利用转光膜培养微藻的两步法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101575566 B (45)授权公告日 2011.07.06 CN 101575566 B *CN101575566B* (21)申请号 200910085921.1 (22)申请日 2009.05.27 C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 新奥科技发展有限公司 地址 065001 河北省廊坊市经济技术开发区 华祥路新源东道科技园 B 区 (72)发明人 王慧岭 马欣欣 刘敏胜 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 王旭 (54) 发明名称 利用转光膜培养微藻的两步法 (。

2、57) 摘要 本发明提供一种利用转光膜培养微藻的两 步法， 所述方法包括 ： 第一步， 利用第一转光膜进 行培养， 使生物量快速积累 ； 和第二步， 利用第二 转光膜培养经第一步培养获得的微藻， 实现有用 产物的转化 ； 其中所述第一转光膜将来自光源的 光转化成波长在 400-700nm 范围内的光 ； 并且 所述第二转光膜将来自光源的光转化为波长在 400-500nm 范围内的光。 (51)Int.Cl. 审查员 李子东 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 CN 101575566 B1/1 页 2 1. 利用转光膜培养微。

3、藻的两步法， 所述方法包括 ： 第一步， 利用第一转光膜进行培养， 使生物量快速积累 ； 和 第二步， 利用第二转光膜培养经第一步培养获得的微藻， 实现有用产物的转化 ； 其中所述第一转光膜将来自光源的光转化成波长在 400-700nm 范围内的光 ； 并且所述 第二转光膜将来自光源的光转化为波长在 400-500nm 范围内的光。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述第一或第二转光膜直接覆盖在光生 物反应器的表面， 或直接制作成封闭式光反应器， 或覆盖在微藻养殖阳光大棚的棚顶， 或它 们的任意组合。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述第一转光膜和第二。

4、转光膜使用的转 光剂为稀土无机化合物。 4. 根据权利要求 1-3 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述第一转光膜将来自光源 的光转化成波长在 400-480nm 范围内的蓝紫光或波长在 550-700nm 范围内的红橙光。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述第一转光膜所用的转光剂组成通式 为 UV>RI-MS， 转光剂占基料的质量含量为 1.0， 厚度为 0.10-0.16mm。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所述第一转光膜所用转光剂的激发光谱 峰值为 300nm， 350nm 和 550nm， 发射光谱峰值为 650nm。 7. 根据权利。

5、要求 1-3 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述第二转光膜所用的转光 剂组成通式为 UVTBI-MS， 转光剂占基料的质量含量为 1.0， 厚度为 0.10-0.16mm。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 所述第二转光膜所用转光剂的激发光谱 峰值为 276nm， 发射光谱峰值为 447nm。 9. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中在所述第一步培养过程中， 向微藻培养液中通入 空气和 CO2的混合气体。 10. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述微藻是绿藻、 蓝藻或杂色藻。 权 利 要 求 书 CN 101575566 B1/7 页 3 利用转光膜培。

6、养微藻的两步法 技术领域 0001 本发明属于微藻培养领域。 本发明是常规微藻培养方法的改进， 具体而言， 本发明 提供一种利用转光膜培养微藻的两步法。 背景技术 0002 目前， 微藻培养采用的主要方式是开放式大池培养 ( 跑道池 ) 以及密闭式光生物 反应器培养。 开放式大池培养是最早、 最简单的微藻培养系统， 适合生长条件相对粗放的微 藻， 如螺旋藻、 小球藻或杜氏盐藻等几种微藻的培养， 其构造简单， 主要利用环境光照、 温度 条件进行培养， 操作简单， 成本低廉。但是微藻培养受环境条件限制效应明显， 光照强度低 时， 微藻生长速度缓慢 ； 而光照强度过高或紫外线辐射又将抑制微藻生长甚至。

7、杀死微藻， 同 时开放式大池培养微藻细胞密度往往很低。 0003 新型光生物反应器的研制与开发弥补了开放式大池培养系统的不足， 使一些对生 长条件要求相对比较苛刻的微藻能够在适合的密闭条件下培养， 能够防止污染， 并能根据 微藻生长需要， 便于调整光照强度和温度等条件， 能够在一定程度上提高培养的微藻密度。 但是光生物反应器一般造价较高， 使得微藻培养成本相应上升。 0004 以高密度培养进行微藻养殖一直是研究的热点， 更是难点。 为了实现高密度养殖， 一般采取异养方式， 异养需要添加有机碳源， 成本较高。普通的自养则细胞浓度较低， 生物 量无法有效积累， 很难实现大规模养殖。 0005 单胞。

8、藻在人工养殖的过程中， 由于受到光照、 营养条件、 污染等因素的限制， 很难 达到高密度的培养， 使得微藻养殖成本一直居高不下， 很难实现大规模产业化生产。 在高密 度养殖中光照成为严重限制其生长的因素， 大多数绿藻一般当细胞密度吸光度在 750nm 为 1.0 左右时， 在藻液深度为 5cm 处光已经衰减掉将近 90。因此， 有效提高光的利用效率成 为一大难题。高密度培养一般要求在短期内即可积累大量的生物量， 但是短期内细胞内的 可利用成分积累往往较少， 因此需要进行两步法再培养。 0006 在本领域现有技术中， 所谓两步法培养， 是在培养初期保证微藻的最佳生长条件 及营养条件， 使其快速生。

9、长积累生物量， 而在微藻生长过程中， 生物量的积累与产物的积累 往往正好相反， 因此在培养到一定浓度之后将微藻接入贫营养培养体系里， 微藻为了生存， 在体内大量积累油脂或色素之类具有商业应用价值的物质。 0007 理论上， 叶绿素的吸收光谱为 400 480nm 的蓝紫光和 600 680nm 的红橙光区， 也就是说对光合作用有意义的是蓝紫光和红橙光。基于此， 目前已有人将转光膜应用在微 藻培养中。通常， 根据所培养的微藻的光合作用曲线， 选择加入适当的转光剂的薄膜， 即称 为转光膜， 转光剂多为含有 电子的有机类物质， 在受激发后可产生能级的电子跃迁， 激 发出不同波长的荧光， 激发波段较宽。

10、， 在400600nm之间， 并有多个明显激发峰， 发射光谱 恰好与叶绿素吸收光谱相一致， 将使对微藻生长不利的紫外光及对微藻光合作用影响不大 的绿光转换成有效光成份， 增加光利用效率。 0008 转光膜在农业生产中已被广泛应用， 可以有效的提高农作物的生长速度及产量。 说 明 书 CN 101575566 B2/7 页 4 但是将转光膜用于微藻养殖的大棚建设则尚未见报道， 特别是利用转光膜用两步法高密度 培养微藻并诱导高附加值色素等有用产物的合成也尚未见报道。 发明内容 0009 本发明提供一种利用转光膜培养微藻的两步法， 具体而言， 所述方法包括 ： 0010 第一步， 利用第一转光膜进行。

11、培养， 使生物量快速积累 ； 和 0011 第二步， 利用第二转光膜培养经第一步培养获得的微藻， 实现有用产物的转化 ； 0012 其中， 所述第一转光膜将来自光源的光转化成波长在 400-700nm 范围内的光 ； 并 且所述第二转光膜将来自光源的光转化为波长在 400-500nm 范围内的光。 0013 在本发明的方法中， 所述光源包括天然光源和人工光源， 例如， 但不限于， 太阳， 日 光灯等。所述第一转光膜将来自光源的光转化成有利于微藻光合作用的光， 主要为蓝紫光 或红橙光， 例如， 波长在 400-480nm 范围内的蓝紫光或波长在 550-700nm 范围内的红橙光 ； 优选地， 。

12、所述第一转光膜将来自光源的光转化为红橙光， 例如， 波长在 550-700nm 范围内的 红橙光。优选地， 所述第二转光膜将来自光源的光转化为蓝光， 例如， 波长在 400-500nm 范 围内的蓝光， 有利于类胡萝卜素等色素积累。 0014 另外， 在本发明的方法中， 第一步利用第一转光膜培养积累生物量的过程中， 可以 使用有利于微藻生长的营养丰富的培养基 ； 在第二步利用第二转光膜培养经第一步培养获 得的微藻的过程中， 可以与贫营养培养体系结合， 使有用产物快速、 大量的积累。 0015 在本发明的一个优选实施方案中， 所用的转光膜购自江苏米可多公司， 转光膜 基料为聚乙烯 SH150， 。

13、第一转光膜和第二转光膜所用的转光剂为稀土无机化合物， 组成 通式分别为 UV>RI-MS 和 UVTBI-MS， 转光剂占基料的质量含量为约 1.0， 膜的厚度为 0.10-0.16mm。其中， UV>RI-MS 型转光剂激发光谱峰值在 300nm， 350nm 和 550nm， 发射光 谱峰值在 650nm， 可将紫外光和绿光转换成易于被微藻吸收利用的红光 ； UVTBI-MS 型转光 剂激发光谱峰值在 276nm， 发射光谱峰值为 447nm， 可将紫外光转换成蓝光。然而本领域技 术人员应该理解， 根据微藻培养的需要， 可以使用任何适当的转光剂和转光膜， 并不限于上 述实例。 00。

14、16 在本发明中， 所述第一或第二转光膜可以直接覆盖在光生物反应器的表面， 可以 直接制作成封闭式光反应器， 也可以覆盖在微藻养殖阳光大棚的棚顶， 或它们的任意组合， 优选覆盖在微藻养殖阳光大棚的棚顶。 0017 参考图 1， 在本发明的一个实施方案中， 培养过程采用两步法在覆有不同转光膜 的阳光大棚中进行， 所用的第一和第二转光膜分别具有将紫外光转换为 550-700nm 的红橙 光， 及 400-500nm 的蓝光的能力。与传统阳光大棚相比， 第一转光膜在一级培养阳光大棚中 增加了有利于光合作用的红橙光， 减小光限制， 第二转光膜在二级转化阳光大棚中， 增加了 便于色素积累的蓝光， 可以有。

15、效快速的实现后期产品转化， 有效提高产物积累。 0018 图 1 显示本发明的一个优选实施方案。具体而言， 太阳光通过第一转光膜 ( 购自 江苏米可多公司， 转光膜基料为聚乙烯 SH150， 所用转光剂组成通式为 UV>RI-MS， 激发 光谱峰值在 300nm， 350nm 和 550nm， 发射光谱峰值在 650nm， 转光剂占基料的质量含量为 约 1.0， 膜的厚度为 0.10-0.16mm) 进入一级培养阳光大棚， 在一级光反应器里进行生物 量的积累， 由于该转光膜将太阳光转换为光合作用所需的红光， 且红光的穿透能力高， 可以 说 明 书 CN 101575566 B3/7 页 5。

16、 有效减少由于细胞密度增加所引起的光衰减， 减少紫外光等对生长的抑制， 从而有效提高 生物量的生产。由于细胞快速生长需要大量碳源， 使得 pH 值上升很快， 在此同时可以以适 当流速按一定比例通入空气和 CO2混合气体， 具体比例根据 pH 值变化来调节， 以保持最佳 生长 pH 环境并及时补充碳源。培养大约一周， 进行初步浓缩， 去掉原培养基后， 将藻泥打 入二级光反应器， 二级光反应器置于覆以可将紫外光转化为蓝光的第二转光膜 ( 购自江 苏米可多公司， 转光膜基料为聚乙烯 SH150， 所用转光剂组成通式为 UVTBI-MS， 激发光谱 峰值在 276nm， 发射光谱峰值为 447nm， 。

17、转光剂占基料的质量含量为约 1.0， 膜的厚度为 0.10-0.16mm) 的二级转化阳光大棚中， 蓝光有利于色素的积累， 并且二级光反应器内为零 营养培养基 ( 不含任何营养成分 )， 为藻类生长的胁迫环境， 能够实现快速产品转化， 进而 提高微藻的经济价值。 0019 本发明利用转光膜培养微藻的两步法适用于大部分微藻的培养， 特别适用于对光 需求较多的绿藻的培养， 例如， 但不限于， 绿藻、 蓝藻、 或杂色藻等。 0020 在本发明中， 本发明方法的优点主要在于以下方面 ： 0021 首先， 采用转光膜两步法培养微藻， 其特点是根据实际需要分别以不同转光膜进 行第一步和第二步培养， 可以选。

18、择性的满足微藻不同时期对不同波长光的需求， 快速有效 实现生物量的积累与产物转化， 不会对后期产品造成污染， 转化速度快， 且不需要其他外源 手段， 经济可行 ； 0022 其次， 采用转光膜两步法培养微藻， 不需要加入诱变剂诱导产物转化。 单一的营养 缺乏， 胁迫生长需要时间较长， 并且长时间处于贫营养环境中， 会有大量藻体死亡， 且在胁 迫环境下， 藻体生长不利， 极易受到污染， 而且添加其他诱变剂均对微藻有一定的致死率， 部分药品还会对后期提取及产品纯度有影响。采用转光膜诱变， 可以有效提高转化速度及 产物积累， 转化周期缩短， 大大减少培养污染的机会， 并且对后期产品没有任何影响。 0。

19、023 另外， 以转光膜覆棚与直接用转光膜制作生物反应器及贴覆在生物反应器表面相 比， 成本较低， 便于进行大规模培养， 减少清洗对其造成的损伤， 提高使用寿命， 并且转光膜 可以有效调控阳光大棚的温度， 在冬季可以起到很好的保温效果， 降低成本。重要地是， 由 于大多数微藻培养与转化所要求的生长条件往往不同， 因此在两个覆盖不同转光膜的阳光 大棚里进行， 分别实现其相应的最佳条件， 互不矛盾， 便于形成大规模连续化生产。 0024 本领域的技术人员应该理解， 在利用本发明的两步法培养微藻过程中， 以转光膜 覆盖阳光大棚棚顶和以转光膜覆盖在光生物反应器的表面以及用转光膜直接制作的封闭 式光反应。

20、器可以任意组合使用， 例如， 第一步培养可以在以第一转光膜覆顶的阳光大棚中 进行生物量累积培养， 第二步培养可以在贴覆第二转光膜的光生物反应器内或由第二转光 膜制成的封闭式光反应器内培养， 其中所用的第二转光膜可以具有对特定产物特异性的转 光能力， 以实现不同产物的快速、 大量转化。 附图说明 0025 从下面结合附图的详细描述中， 本发明的上述特征和优点将更明显， 其中 ： 0026 图 1 显示本发明的一个优选实施方案的示意图 ； 0027 图 2 显示按照实施例一在使用转光膜和不使用转光膜条件下小球藻生长曲线图。 0028 图 3 显示按照实施例二在使用转光膜和不使用转光膜条件下新绿藻生。

21、长曲线图。 说 明 书 CN 101575566 B4/7 页 6 具体实施方式 0029 以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解， 所述实施例只是举例说明 的目的， 并不意欲限制本发明的范围和精神。 0030 实施例一 ： 转光膜两步法培养小球藻 0031 以小球藻 (Chlorella， 一种绿藻 ) 为对象， 采用将第一和第二转光膜覆盖在光反 应器外壁进行两步法培养。 0032 将第一转光膜 ( 购自江苏米可多公司， 转光膜基料为聚乙烯 SH150， 转光剂组成通 式为 UV>RI-MS， 激发光谱峰值在 300nm， 350nm 和 550nm， 发射光谱峰值在 650nm。

22、， 转光剂 占基料的质量含量为约 1.0， 膜的厚度为 0.10-0.16mm) 覆盖于 10L 鼓泡式反应器外壁， 同时以无转光膜的相同的反应器做对照， 采用改良SM培养基(培养基成分及其含量见下表 1-6)， 以相同密度接种对数期藻种 ( 转培后 5-7 天形成 )， 初始 OD750为 0.102。在自然光照 下培养该绿藻， 光照强度通过人为调控在 10000-20000lux。控制室温为约 25。从反应器 底部通过曝气头通入空气与 CO2混合气体， 气液体积比为 1 16。培养周期为 10 天。图 2 显示小球藻在使用转光膜和不使用转光膜条件下的生长曲线， 结果显示该藻转光膜条件下 生。

23、物量比对照组生物量提高了约 25。 0033 将培养 10 天后的藻液离心浓缩后去掉原培养基， 加入无培养基的自来水， 将能 够将太阳光主要转化为蓝光的第二转光膜 ( 购自江苏米可多公司， 转光膜基料为聚乙烯 SH150， 所用转光剂组成通式为 UVTBI-MS， 激发光谱峰值在 276nm， 发射光谱峰值为 447nm， 转光剂占基料的质量含量为约 1.0， 膜的厚度为 0.10-0.16mm) 覆盖在另一个同样的反应 器的表面， 以无转光膜做对照。结果显示， 在转光膜条件下， 总类胡萝卜素的含量比对照提 高了 1.5。 0034 表 1. 改良 SM 培养基的组成及其含量 0035 # 成。

24、分 量 1 Spir 溶液 1 500mL/L 2 Spir 溶液 2 500mL/L 0036 注 ： 下划线表示需要事先配制成母液， 所述母液的配制参见下表 2-3。 0037 表 2.Spir 溶液 1 的组成及其含量 0038 # 成分 量 终浓度 1 NaHCO3 6.805g/500mL dH2O 162mM 2 Na2CO3 2.00g/500mL dH2O 48mM 说 明 书 CN 101575566 B5/7 页 7 3 K2HPO4 0.5g/500mL dH2O 2.9mM 0039 表 3.Spir 溶液 2 的组成及其含量 0040 # 成分 量 终浓度 1 NaN。

25、O3 2.5g/500mL 36.2mM 2 K2SO4 1g/500mL 5.73mM 3 NaCl 1g/500mL 17.1mM 4 MgSO47H2O 0.2g/500mL 0.81mM 5 CaCl22H2O 0.04g/500mL 0.36mM 6 P-IV 金属溶液 6mL/0.5L 7 Chu 微量营养溶液 1mL/0.5L 8 维生素 B12 1mL/0.5L 0041 注 ： 下划线表示需要事先配制成母液， 所述母液的配制参见下表 4-6。 0042 表 4.P-IV 金属溶液的组成及其含量 0043 # 成分 量 终浓度 1 Na2EDTA2H2O 0.75g/L 2mM。

26、 2 FeCl36H2O 0.097g/L 0.36mM 3 MnCl24H2O 0.041g/L 0.21mM 4 ZnCl2 0.005g/L 0.037mM 5 CoCl26H2O 0.002g/L 0.0084mM 6 Na2MoO42H2O 0.004g/L 0.017mM 0044 表 5.Chu 微量营养溶液的组成及其含量 0045 # 成分 量 终浓度 说 明 书 CN 101575566 B6/7 页 8 1 CuSO45H2O 0.02g/L 0.78M 2 ZnSO47H2O 0.044g/L 0.15M 3 CoCl26H2O 0.02g/L 0.084M 4 MnCl。

27、24H2O 0.012g/L 0.064M 5 Na2MoO42H2O 0.012g/L 0.052M 6 H3BO3 0.62g/L 10M 7 Na2EDTA2H2O 0.05g/L 0.13M 0046 表 6. 维生素 B12储液的组成及其含量 0047 # 成分 量 1 HEPES 缓冲液 pH 7.8 2.4g/200mL dH2O 2 维生素 B12(cyanocobalamin， Sigma V2876) 0.027g/200mL dH2O 0048 注 ： 本领域的技术人员应该理解， 除非另外指明， 本发明所用的试剂均可从普通的 生物试剂公司或化学试剂公司购买， 其配制方法也。

28、是本领域的技术人员公知的。 0049 实施例二 ： 转光膜两步法培养新绿藻 0050 同实施例一， 培养藻种为新绿藻 (Neochloris oleoabundans， 购自 UTEX)， 采 用 BBM 培养基 ( 参考文献 ： Stein， J.(ED.)Handbook ofPhycological methods.Culture methods and growth measurements.CambridgeUniversity Press. 第 448 页 )。所用的 第一转光膜主要将紫外光光转化为红光， 其购自江苏米可多公司， 转光膜基料为聚乙烯 SH150， 转光剂组成通式为U。

29、V>RI-MS， 激发光谱峰值在300nm， 350nm和550nm， 发射光谱峰 值在 650nm， 转光剂占基料的质量含量为约 1.0， 膜的厚度为 0.10-0.16mm ； 第二转光膜主 要将紫外光转化为蓝光， 厂家同上， 转光膜基料也为聚乙烯 SH150， 所用转光剂组成通式为 UVTBI-MS， 激发光谱峰值在 276nm， 发射光谱峰值为 447nm， 转光剂占基料的质量含量为约 1.0， 膜的厚度为 0.10-0.16mm。使用转光膜条件下两步法培养新绿藻， 培养周期为一周， 细胞生物量比对照提高 20， 总脂含量比对照提高 18 ( 图 3)。 0051 实施例三 ： 使。

30、用以第一和第二转光膜覆顶的两级阳光大棚进行两步法培养小球藻 0052 培养对象与实施例一的培养对象相同， 均为小球藻。一级大棚以转光剂的组成 通式为 UV>RI-MS， 转光剂占基料的质量含量为约 1.0， 厚度为 0.10-0.16mm 的米可多 公司生产的转光膜 ( 转光膜基料为聚乙烯 SH150， 转光剂激发光谱峰值在 300nm， 350nm 和 550nm， 发射光谱峰值在 650nm) 覆顶， 大棚膜顶外部有可以自主开合的遮阳帘， 内部有可以 自由开合的反光帘， 以调节中午过强的光照。 大棚内部有水帘降温系统， 大棚内部所用反应 说 明 书 CN 101575566 B7/7 。

31、页 9 器为玻璃管式鼓泡反应器， 培养体系为 10m3， 以 SM 培养基培养小球藻， 接种初始 OD750 在 0.40， 以遮阳帘和反光帘控制光强， 从初始培养光强 8000lux， 到后期的光强 30000lux， 随 着培养浓度的增加， 中午控光时间逐渐减短， 培养 10 天后， 离心浓缩后转入二级转光大棚。 二级转光大棚以转光剂组成通式为 UVTBI-MS， 转光剂占基料的质量含量为约 1.0， 厚度 为0.10-0.16mm的米可多公司生产的转光膜(转光膜基料为聚乙烯SH150， 转光剂激发光谱 峰值在 276nm， 发射光谱峰值为 447nm) 覆顶， 将浓缩后的藻液中加入自来水， 使得 OD750 为 约 1.00， 不再控制光强， 培养约一周， 所得结果与实施例一基本一致。 0053 应该理解， 尽管参考其示例性的实施方案， 已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解， 在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神 和范围的条件下， 可以在其中进行各种形式和细节的变化， 可以进行各种实施方案的任意 组合。 说 明 书 CN 101575566 B1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101575566 B2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 。