《MAPK/PKC信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《MAPK/PKC信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟.pdf（17页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710329768.7 (22)申请日 2017.05.11 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 申请人 中国科学院上海生命科学研究院 (72)发明人 徐成冉程新杨李冯思思 吴佳颖邱伟林 (74)专利代理机构 北京北翔知识产权代理有限 公司 11285 代理人 张广育姜建成 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 MAPK/PKC信号通路激活剂促进人类胆管细 。
2、胞分化和成熟 (57)摘要 本发明提供了将定向内胚层干细胞诱导而 形成肝内胆管样细胞的方法， 所述方法包括使定 向内胚层干细胞定向诱导形成肝向内胚层细胞， 以及使肝向内胚层细胞在小分子化合物和MAPK/ PKC信号通路激活剂的定向作用下， 分化形成人 类胆管样细胞。 本发明还提供了通过所述方法获 得的人类胆管样细胞。 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图3页 CN 108865969 A 2018.11.23 CN 108865969 A 1.一种制备人类肝内胆管样细胞的方法， 所述方法使用MAPK/PKC信号通路激活剂诱导 肝向内胚层细胞分化形成人类肝内胆管样细胞。 2.权利要求1的。
3、方法， 包括以下步骤： (i)使定向内胚层干细胞经由小分子化合物的定向诱导形成肝向内胚层细胞； 和 (ii)使肝向内胚层细胞在小分子化合物和MAPK/PKC信号通路激活剂的定向作用下， 分 化形成人类肝内胆管样细胞。 3.权利要求2的方法， 其中所述步骤(i)中的小分子化合物为bFGF/BMP4/TGF /EGF/ VEGF/HGF， 所述步骤(ii)中的小分子化合物为EGF/TGF /HGF。 4.权利要求1-3中任一项的方法， 其中所述人类肝内胆管样细胞是成熟的人类肝内胆 管样细胞。 5.权利要求1-3中任一项的方法， 其中所述MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S,5S)-(E, E)-。
4、8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。 6.权利要求1-3中任一项的方法， 其中所述定向内胚层干细胞由人类诱导多能干细胞 (iPSC)制备得到。 7.权利要求2或3的方法， 其中步骤(ii)以二维或三维的培养方式进行。 8.通过权利要求1-7中任一项的方法获得的人类肝内胆管样细胞。 9.MAPK/PKC信号通路激活剂用于制备人类肝内胆管样细胞的用途。 10.权利要求9的用途， 其中所述MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4- (三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。 权利要求书 1/1。
5、 页 2 CN 108865969 A 2 MAPK/PKC信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟 技术领域 0001 本发明涉及将人类多能干细胞诱导分化形成肝内胆管样细胞的方法。 特别地， 本 发明涉及将人类诱导多能干细胞定向诱导为定向内胚层干细胞， 再进一步诱导而形成肝内 胆管样细胞的方法。 背景技术 0002 由于肝内胆管疾病病理研究、 药物筛选及疾病治疗的需要， 通过将人类多能干细 胞高效地诱导得到成熟的、 功能完善的肝内胆管样细胞是极其重要且急迫的。 0003 目前多个研究组陆续发表了将人类多能干细胞诱导分化形成肝内胆管样细胞的 方案。 Sampaziotis F等人从人类诱导多能。
6、干细胞(hiPSC)开始， 通过加有Activin-A、 FGF2、 BMP4和Ly294002的CDM培养基诱导3天形成定向内胚层细胞(DE)； 随之， 更换为含有 Activin-A的RPMI培养基， 5天后得到前肠前体细胞(FP)； 随后在加有SB和BMP4的RPMI培养 基定向诱导4天后得到肝母细胞(HB)； 肝母细胞经由FGF10、 RA和Activin-A的RPMI培养基培 养4天后得到胆管前体细胞(CP)； 最终， 胆管前体细胞在含有EGF的William s E培养基及细 胞外基质Matrigel中培养10天后得到胆管样细胞(参见Sampaziotis F,Cardoso de。
7、 Brito M,Madrigal P,Bertero A,Saeb-Parsy K,Soares FA,Schrumpf E,et al.Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.Nat Biotechnol 2015； 33:845-852.)。 Ogawa M等人从人类多能干细胞 开始， 在加有Activin和CHIR的RPMI培养基中培养1天， 随后在只含有Activin的RPMI培养基 中培养6天后形成定向内胚层细胞。
8、； 在含有bFGF和BMP4的H16DMEM培养基中培养6天后得到 肝向内胚层细胞； 进一步在含有HGF、 Dex和OSM的H16DMEM/Ham s F12(3:1)培养基中诱导12 天后得到肝母细胞； 最后， 在含有HGF、 EGF和TGF 的H16DMEM/Ham s F12(3:1)培养基与OP9 滋养层细胞共同作用3-9天后得到胆管样细胞(参见Ogawa M,Ogawa S,Bear CE,Ahmadi S, Chin S,Li B,Grompe M,et al.Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripo。
9、tent stem cells.Nat Biotechnol 2015； 33:853-861)。 这些方案通过逐步 利用不同的培养条件、 小分子化合物及处理顺序和时间， 得到了不同成熟程度的肝内胆管 样细胞， 其高表达一些胆管细胞标志基因， 并且在一定程度上具有类似于体内胆管的功能。 0004 同时， 这两个研究小组分别利用各自建立的诱导方案成功地将来自肝内胆管囊性 纤维化(CF)病人成纤维细胞重编程所得多能干细胞定向诱导分化形成肝内胆管样细胞， 且 这些细胞能够在一定程度上模拟囊性纤维化的病理特征， 例如囊形成缺陷及胆管腔中氯化 物分泌减少等。 通过利用这个病理模型， 他们发现实验性的囊性。
10、纤维化药物VX809能够在一 定程度上促进囊形成且增加氯化物向胆管腔中分泌， 从而改善囊性纤维化病症。 但是， 这些 肝内胆管样细胞诱导方案及诱导得到的肝内胆管样细胞具有以下不足之处， 这也限制了其 应用的范围及可靠性。 0005 (1)胆管样细胞诱导分化效率低、 纯度低， 且所需诱导时间长(26天)， 成本高； (2) 胆管样细胞与来自成体肝脏的成熟肝内胆管细胞在基因表达谱上存在明显差异， 其高表达 说明书 1/8 页 3 CN 108865969 A 3 未成熟肝内胆管细胞的标志基因， 而与成熟肝内胆管细胞相关的基因的表达量低或并不表 达； (3)胆管样细胞与来自成体肝脏的成熟肝内胆管细胞。
11、相比， 其功能并不完善， 且并不成 熟， 包括低酶活性(碱性磷酸酶(ALP)和谷氨酰转肽酶(-GGT)等)、 低CFTR介导的氯化物 转运活性及有限的激素(secretin和somatostainin)响应活性等， 表明胆管样细胞并不成 熟； (4)由于目前已有的肝内胆管样细胞体外诱导方案所采用的小分子化合物种类不同， 其 添加顺序及处理时间也各异， 甚至有的方案还需要加入滋养层细胞， 表明这些方案并不是 完全模拟肝内胆管正常发育过程而进行的， 进而导致诱导分化形成的胆管样细胞并不能完 全反映体内胆管的生理及病理特征； (5)胆管样细胞缺少体内(模式动物和人)功能验证。 发明内容 0006 本。
12、发明使用的试剂的中文名称及其对应的英文缩写形式如表1所示。 0007 表1： 试剂名称中英文对照表 0008 0009 本发明的第一方面提供了一种改进的制备人类肝内胆管样细胞的方法， 所述方法 使用MAPK/PKC信号通路激活剂诱导肝向内胚层细胞分化形成人类肝内胆管样细胞。 0010 本发明的制备人类肝内胆管样细胞的方法， 可包括以下步骤： 0011 (i)使定向内胚层干细胞经由小分子化合物的定向诱导形成肝向内胚层细胞； 和 0012 (ii)使肝向内胚层细胞在小分子化合物和MAPK/PKC信号通路激活剂的定向作用 下， 分化形成人类肝内胆管样细胞。 0013 在一个具体实施方案中， 其中所述。
13、步骤(i)中的小分子化合物为bFGF/BMP4/TGF / EGF/VEGF/HGF， 所述步骤(ii)中的小分子化合物为EGF/TGF /HGF。 0014 在一个具体实施方案中， 使用本发明的制备人类肝内胆管样细胞的方法得到的人 类肝内胆管样细胞是成熟的人类肝内胆管样细胞。 0015 在一个具体实施方案中， 本发明方法中使用的MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S, 说明书 2/8 页 4 CN 108865969 A 4 5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。 0016 在一个具体实施方案中， 本发明方法中所述定向内胚层干。
14、细胞由人类诱导多能干 细胞(iPSC)制备得到。 0017 在一个具体实施方案中， 本发明方法中使肝向内胚层细胞分化形成人类肝内胆管 样细胞以二维或三维的培养方式进行。 0018 本发明另一方面提供了通过本发明改进的方法获得的人类肝内胆管样细胞。 0019 本发明的再一方面提供了MAPK/PKC信号通路激活剂用于制备人类肝内胆管样细 胞的用途。 0020 在一个具体实施方案中， 其中所述MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S,5S)-(E,E)-8- (5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。 附图说明 0021 图1为本发明由定向内胚层干细胞制备人类胆管。
15、样细胞的流程图。 0022 图2为通过单细胞转录组测序(单细胞RNA-seq)的主要组分分析(PCA)图， 其中PC1 和PC2分别为最主要的两个主要组分。 0023 图3为通过实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定的不同标志基因在各类细胞 中的表达量。 使用TATA盒子结合蛋白(TBP)基因作为内参基因。 所述各类细胞分别为： EPC： 定向内胚层干细胞； HC： 肝向内胚层细胞； CHO： 肝内胆管样细胞； HIB： 人类原代胆管上皮细 胞； ADL： 新鲜分离的人类肝实质细胞。 0024 图4为肝内胆管样细胞的免疫荧光染色图。 其中第一行从左至右分别表示： DAPI、 SOX9、 。
16、CK7和前三张图的叠加图； 第二行从左至右分别表示： DAPI、 SOX9、 CK19和前三张图的 叠加图； 第三行从左至右分别表示： DAPI、 HNF4A、 CK7和前三张图的叠加图； 第四行从左至右 分别表示： DAPI、 ZO-1、 CFTR和前三张图的叠加图。 0025 图5为通过荧光显微镜观察到的第6天的肝向内胚层细胞在包含或不包含TPPB的 条件下培养9天后的形态特征， 其中绿色荧光为所述细胞恒定表达的绿色荧光蛋白(GFP)。 具体实施方式 0026 本发明首先从人类诱导多能干细胞(iPSC)制备定向内胚层干细胞(EP细胞)， 然后 诱导定向内胚层干细胞， 使其分化为肝内胆管样细。
17、胞。 EP细胞具有以下突出特点， 使从EP细 胞开始的定向诱导具有优势： (一)在体外无血清培养条件下， 具有体外无限增殖的潜力( 1016倍)； (二)所有细胞同步停留在内胚层阶段； (三)在一定的定向诱导条件下可以在体外 继续高效分化成各种具有功能的内胚层细胞类群， 包括功能胰腺 细胞， 功能肝细胞、 肝导 管细胞、 肠上皮细胞、 胸腺上皮细胞、 肺上皮细胞等； (四)分化成下游内胚层细胞类群的效 率远高于直接从PSCs出发的情况； (五)不具有分化成外胚层和中胚层的能力， 从而保证了 分化成的内胚层细胞类群的纯度， 并且有利于研究胚层之间相互作用及体外多胚层共培养 的效果； (六)EP细。
18、胞及其分化后的细胞类群在体内不成瘤； (七)可以从任何多能干细胞系 分化获得； (八)极大程度地降低不同细胞株由于遗传和表观状态的差别造成的分化效率差 异。 0027 本发明以定向内胚层干细胞为出发点， 经由小分子化合物bFGF/BMP4/TGF /EGF/ 说明书 3/8 页 5 CN 108865969 A 5 VEGF/HGF的定向诱导6天形成肝向内胚层细胞(Hepatic endoderm)。 之后我们采用两种方 法制备人类胆管样细胞： 1)以二维的贴壁培养方式， 在EGF/TGF /HGF和MAPK/PKC信号通路 激活剂TPPB的定向作用下， 肝向内胚层细胞在短短6天内即可形成高纯。
19、度人类胆管样细胞， 此方法并不依赖高浓度的基质胶(Matrigel)， 所得人类胆管样细胞具有更好的人类胆管细 胞特性， 因此我们能够体外规模化制备人类胆管样细胞； 2)以三维的培养方式， 在EGF/TGF /HGF和TPPB的定向作用下， 肝向内胚层细胞在较短的时间内(6天)即可形成人类胆管样细 胞， 并伴随管状结构的形成， 可直接进行胆管体外功能的验证， 但此方法依赖高浓度的基质 胶， 因此规模化制备受限， 仅适用于小规模应用。 0028 现有肝内胆管样细胞诱导方案的缺陷主要是由于我们对调控肝内胆管分化与成 熟的分子机理的认识并不完善造成的。 我们通过利用单细胞测序技术在全转录组水平上对 。
20、小鼠肝脏早期发育过程中肝胆细胞分化发育研究发现， MAPK/PKC信号通路在肝内胆管分化 发育过程中被特异地激活。 进一步通过早期胚胎肝脏体外培养及诱导实验证明， MAPK/PKC 激活剂的应用能够促进肝内胆管细胞的分化和成熟。 因而， 我们发现了一条全新的能够促 进肝内胆管分化和成熟的信号通路。 重要的是， 我们通过在肝内胆管样细胞体外诱导体系 中加入MAPK/PKC激活剂能够有效、 快速地得到更成熟、 功能更完善的肝内胆管样细胞， 并且 证明其在肝内胆管及肝脏损伤修复过程中发挥重要的作用。 0029 本发明以定向内胚层干细胞(EP细胞)为起点进行诱导分化， 所述定向内胚层干细 胞获得自人类。
21、诱导多能干细胞。 然而， 需要理解的是， 定向内胚层干细胞的来源不限于人类 诱导多能干细胞， 还可来自其他细胞系(例如H9细胞系)。 0030 以下实施例用于示例性地说明本发明。 0031 实施例1： TPPB对小鼠肝内胆管细胞分化和成熟的作用 0032 1)小鼠肝内胆管细胞分化发育 0033 8至12周的C57BL/6品系雌鼠和C3H品系雄鼠来自于维通利华公司(北京)， 交配得 到的子代小鼠(B6C3F1)用于后续实验。 六周左右的B6C3F1雌鼠与八至十二周的B6C3F1雄鼠 交配， 第二天早上查到阴道栓则记为胚胎发育(E)0.5天。 所有小鼠都饲养在232、 12小 时昼夜交替的无菌环境。
22、中， 以高压灭菌过的食物和水喂食。 所有小鼠实验都严格按照北京 大学实验动物中心管理条例执行。 0034 取小鼠胚胎发育(E)10.5、 11.5、 12.5、 13.5、 14.5、 15.5和17.5天总共7个时间点的 肝芽或胎肝， 用适量0.25胰蛋白酶-EDTA于37消化至单细胞悬液， 加入等量体积的胎牛 血清(FBS)终止消化； 用特定的荧光基团连接的膜表面标志蛋白抗体(DLK-FITC和EpCAM- APC)标记细胞后， 通过流式细胞分选的方法收集特定类型的肝胆单细胞于裂解液中； 再利 用Smart-seq2的方法(Picelli et al.,2014)得到cDNA， 用True。
23、Prep DNA Library Prep Kit制备单细胞测序文库， 通过Illumina HiSeq 2500平台测序得到单端51bp读段； 最后通 过主要组分分析(PCA)方法确定肝胆细胞类型并确认肝内胆管细胞分化路径及特点。 0035 2)E12.5小鼠肝叶培养及TPPB诱导 0036 取E12.5小鼠肝叶并放置于包含有2ml培养基(RPMI 1640培养基内加入10FBS、 1 青霉素-链霉素、 1ITS-X和50ng/ml EGF， 包含或不包含0.5 M TPPB和/或10 M U0126 (MAPK/PKC信号通路下游MEK1/2抑制剂)的12孔板中的Nuclepore Tra。
24、ck-Etch Membranes (Whatman)上培养2天。 然后利用上述1)中的方法进行单细胞测序及分析。 说明书 4/8 页 6 CN 108865969 A 6 0037 3)结果分析 0038 如图2所示， 通过单细胞转录组测序(单细胞RNA-seq)的主要组分分析(PCA)表明， MAPK/PKC信号通路激活剂TPPB促进小鼠肝内胆管细胞分化和成熟。 图2中的2个最主要组分 分别为PC1和PC2， 符号 “+” 和 “” 分别表示胚胎发育(E)10.5-17.5小鼠体内原代肝母细胞/ 肝实质细胞和原代肝内胆管细胞。 TPPB能够促进肝内胆管细胞分化和成熟(黑色圆形)。 U012。
25、6(MAPK/PKC信号通路下游MEK1/2抑制剂)能够抑制TPPB对肝内胆管发育的促进作用 (黑色正方形)， 表明TPPB通过MAPK/PKC信号通路发挥作用。 0039 实施例2： 人类定向内胚层干细胞的制备和维持培养 0040 使用Gadue等人在WO 2012/178215 A1中公开的方法， 从人类诱导多能干细胞 (iPSC)制备定向内胚层干细胞(EP细胞)。 将人类诱导多能干细胞(iPSC)(购自上海中乔新 舟生物科技有限公司)在含有谷氨酰胺(2mM)、 MTG(4.510-4M)、 激活素A(100ng/ml)和 CHIR99021(2M)的RPMI培养基内诱导1天， 随后在含有。
26、谷氨酰胺(2mM)、 抗坏血酸(50g/ml)、 MTG(4.510-4M)、 bFGF(5ng/ml)和激活素A(100ng/ml)的RPMI培养基内定向诱导2天， 最后 在含有谷氨酰胺(2mM)、 抗坏血酸(50g/ml)、 MTG(4.510-4M)、 bFGF(5ng/ml)和激活素A (100ng/ml)的SFD培养基内定向诱导2天。 利用流式细胞分选的方法分选出CXCR4+/CD117+ 细胞， 即得到人类定向内胚层干细胞。 0041 将所得的定向内胚层干细胞在用基质胶原液(BD Biosciences)包被且以小鼠成 纤维细胞(Swiss Webster)做为滋养细胞(50万/5。
27、8cm2)的培养皿上， 在含有BMP4(50ng/ ml)、 bFGF(10ng/ml)、 VEGF(10ng/ml)和EGF(10ng/ml)的SFD培养基(73IMDM、 25Ham s F12、 1B27、 0.5N2和0.5BSA)中扩增， 同时保持内胚层的相关特性。 0042 实施例3： 定向内胚层干细胞的肝向内胚层定向分化 0043 定向内胚层干细胞以悬浮培养方式进行肝向分化， 细胞密度为100万/ml分化培养 基(含有BMP4(50ng/ml)、 bFGF(10ng/ml)、 VEGF(10ng/ml)、 EGF(10ng/ml)、 TGF (10ng/ml)、 HGF(25ng。
28、/ml)、 Dex(40ng/ml)、 谷胺酰胺(2mM)、 抗坏血酸(50g/ml)和MTG(4.510-4M)的SFD 培养基)， 于每3ml培养基内加入100 l基质胶原液和预冷的细胞悬液进行充分混匀后置于 低吸附培养皿内定向分化， 分化时长6天， 每2天更换培养基一次。 0044 实施例4： 肝向内胚层的肝内胆管样细胞二维定向分化 0045 将第6天所得的肝向内胚层细胞在含有EGF(50ng/ml)、 TGF (5ng/ml)、 HGF(25ng/ ml)、 TPPB(0.5 M)、 Dex(40ng/ml)、 谷氨酰胺(2mM)、 抗坏血酸(50g/ml)和MTG(4.510-4M)。
29、的 BDM培养基(William s E培养基内加入10mM烟酰胺、 17mM碳酸氢钠、 6.3mM丙酮酸钠、 14mM葡 萄糖、 20mM HEPES和ITS+premix)， 以二维贴壁的方式移入由基质胶(1:3)包被的培养皿内， 进行为期3-9天的定向分化， 每2天更换培养基一次。 0046 实施例5： 肝向内胚层的肝内胆管样细胞三维定向分化 0047 将包裹于40基质胶的第6天的肝向内胚层细胞置于12孔transwell内(200 l/ 孔)， 37固化2小时， 随后在含有EGF(50ng/ml)、 TGF (5ng/ml)、 HGF(25ng/ml)、 TPPB(0.5 M)、 De。
30、x(40ng/ml)、 谷氨酰胺(2mM)、 抗坏血酸(50g/ml)和MTG(4.510-4M)的BDM培养基内， 进行为期3-9天的定向分化， 每2天更换培养基一次。 0048 实施例6： 肝内胆管样细胞的实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)鉴定 0049 通过RT-qPCR对二维定向分化得到的肝内胆管样细胞进行分析。 总RNA利用RNA微 说明书 5/8 页 7 CN 108865969 A 7 量提取试剂盒(Ambion)制备， 并取用500ng-1 g RNA， 利用随机引物及Oligo(dT)进行cDNA 反转录。 使用以下表2中的引物， 利用SYBR Green荧光染料(Ro。
31、che)插入的方法进行各标志 基因的RT-qPCR鉴定。 所得结果利用管家基因TATA盒子结合蛋白(TBP)基因进行均一化。 0050 表2： 使用的引物的序列 0051 0052 0053 实验结果如图3所示， 实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)结果显示本发明二维定 向分化所得的肝内胆管样细胞几乎不表达肝母细胞基因AFP及肝实质细胞基因ALB和 HNF4A， 而高表达肝内胆管细胞基因SOX9、 CK19、 NOTCH2、 CK7和AQP1， 并且表达水平与原代胆 管上皮细胞相近。 TBP为内参基因。 0054 同样， 对通过三维培养方式得到的肝内胆管样细胞进行RT-qPCR鉴定， 得到。
32、与上述 结果相同的实验结果。 0055 实施例7： 肝内胆管样细胞的免疫荧光染色鉴定 0056 对于二维定向分化产生的肝内胆管样细胞， 吸去培养皿中的培养基， 加入37预 热过的PBS， 洗三次， 每次20分钟； 用4多聚甲醛(PFA)37固定过夜； 吸去固定液， 用PBS洗 三次， 随后用0.3Triton-X100室温通透30分钟； 吸去通透液， 用PBS洗三次； 此后， 用3 说明书 6/8 页 8 CN 108865969 A 8 BSA室温封闭2小时； 吸去封闭液， 加入按比例稀释过的一抗(下表3中1-6的抗体， 所用抗体 均稀释于加入0.2BSA+0.05Triton-X100的P。
33、BS中)， 室温过夜； 用PBS洗过后， 加入按比 例稀释过的二抗(下表3中7-11的抗体)， 室温处理2小时； 用PBS洗过后， 加入DAPI(Prolong Gold Antifade reagent with DAPI， Invitogen)， 10分钟后洗去； 最后， 用倒置荧光显微镜 观察、 记录。 实验中使用的具体抗体信息见下表3。 0057 表3： 免疫荧光染色中使用的抗体 0058 0059 实验结果如图4所示， 免疫荧光染色结果显示本发明所得的肝内胆管样细胞高表 达胆管命运和功能相关蛋白SOX9、 CK19、 CK7、 ZO-1和CFTR， 并且具有正确的细胞定位， 但不 表。
34、达肝实质细胞蛋白HNF4A。 0060 同样， 对通过三维培养方式得到的肝内胆管样细胞进行免疫荧光染色鉴定， 得到 与上述结果相同的实验结果。 0061 实施例8： 肝内胆管样细胞形态观察 0062 为了直接观察胆管样细胞在诱导过程中的形态变化， 并探究TPPB在胆管样细胞诱 导分化中的作用， 我们首先构建了恒定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人类诱导多能干细胞， 具 体步骤包括： 依据替代人基因组内AAVS位点编码区内序列来设计基因靶向载体， 该基因靶 向载体包括绿色荧光蛋白(GFP)编码及SV40聚腺嘌呤序列， 同时含有由TK启动子控制的新 霉素筛选基因， 在此盒子5 和3 两端各含有2k长度。
35、的同源臂序列用于定点整合； 将此靶向 载体与含有导向RNA的CAS9剪切质粒同时以脂质体方式转入人类诱导多能干细胞内， 次日 进行阳性克隆药物筛选； 12天后， 挑取细胞单克隆进行分离与扩增， 并利用聚合酶链式反应 说明书 7/8 页 9 CN 108865969 A 9 (PCR)与DNA原位杂交(Southern blot)方法验证所得克隆的正确性。 得到绿色荧光蛋白基 因修饰的人类诱导多能干细胞后， 我们将按照上述二维定向分化方法进行肝内胆管样细胞 诱导实验， 得到绿色荧光蛋白基因修饰的肝内胆管样细胞。 使用倒置荧光显微镜进行观察。 0063 实验结果如图5所示， 与对照组相比， TPP。
36、B显著增加了第6天肝向内胚层细胞在二 维培养条件下培养9天后诱导形成的胆管样细胞的数目， 并促进了胆管样细胞管状结构的 形成。 0064 同样， 对于通过三维培养方式得到的绿色荧光蛋白基因修饰的肝内胆管样细胞， 可观察到相同的结果。 0065 讨论 0066 我们在已有的肝内胆管样细胞诱导方案中加入MAPK/PKC信号通路激活剂TPPB。 初 步结果表明， MAPK/PKC信号通路的激活能够有效地促进更成熟的胆管样细胞的分化形成及 形态建成(图3-5)， 并极大地缩短了诱导所需时间。 0067 特别地， 我们是以定向内胚层干细胞为起始细胞向胆管样细胞诱导的。 实验表明， 几乎所有类型的人类多能。
37、干细胞都能够被诱导形成定向内胚层干细胞。 并且， 定向内胚层 干细胞能够更便捷、 更高效地向胆管样细胞分化， 从而提高了诱导效率。 0068 此外， 已有的肝内胆管样细胞诱导方案必须是在三维培养条件下实现的。 但通过 三维培养可得到的细胞数目有限， 只可用于小规模实验， 限制了其应用。 我们发现， TPPB能 够促进二维培养下胆管样细胞的形成， 且这些细胞具有和三维培养得到的胆管样细胞相似 的基因表达水平和性质。 因此， 我们能够通过TPPB在二维培养条件下实现胆管样细胞的规 模化生产， 这对于肝内胆管发育学研究、 胆管疾病模型的构建和药物筛选、 以及大规模制备 胆管样细胞用于3D打印肝脏器官。
38、有重要的意义。 说明书 8/8 页 10 CN 108865969 A 10 序列表 北京大学 中国科学院上海生命科学研究院 MAPK/PKC信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟 CP1170290P/CB 18 PatentIn version 3.3 1 26 DNA 合成序列 AFP-F 1 ctacctgcct ttctggaaga actttg 26 2 22 DNA 合成序列 AFP-R 2 gatcgatgct ggagtgggct tt 22 3 24 DNA 合成序列 ALB-F 3 gtgaaacaca agcccaaggc aaca 24 4 20 DNA 合成序列 。
39、ALB-R 4 序列表 1/4 页 11 CN 108865969 A 11 tcctcggcaa agcaggtctc 20 5 25 DNA 合成序列 HNF4A-F 5 tccaacccaa cctcatcctc cttct 25 6 24 DNA 合成序列 HNF4A-R 6 tcctctccac tccaagttcc tgtt 24 7 21 DNA 合成序列 SOX9-F 7 gagctcgaaa ctgactggaa a 21 8 22 DNA 合成序列 SOX9-R 8 cttctcttct cctcctgcaa ag 22 9 19 DNA 合成序列 CK19-F 序列表 2。
40、/4 页 12 CN 108865969 A 12 9 tttgtgtcct cgtcctcct 19 10 21 DNA 合成序列 CK19-R 10 ggttctgcat ggttagcttc t 21 11 18 DNA 合成序列 NOTCH2-F 11 gcctgagcct ttgaagca 18 12 17 DNA 合成序列 NOTCH2-R 12 ttctcggtcg cctcctc 17 13 20 DNA 合成序列 CK7-F 13 catccctgct tggactgaaa 20 14 18 DNA 合成序列 序列表 3/4 页 13 CN 108865969 A 13 CK。
41、7-R 14 ggccaccttt ctctgctg 18 15 24 DNA 合成序列 AQP1-F 15 ccatactgta gacactctga caag 24 16 20 DNA 合成序列 AQP1-R 16 cccataagag gcttgaccat 20 17 26 DNA 合成序列 TBP-F 17 ttgctgagaa gagtgtgctg gagatg 26 18 22 DNA 合成序列 TBP-R 18 cgtaaggtgg caggctgttg tt 22 序列表 4/4 页 14 CN 108865969 A 14 图1 图2 说明书附图 1/3 页 15 CN 108865969 A 15 图3 图4 说明书附图 2/3 页 16 CN 108865969 A 16 图5 说明书附图 3/3 页 17 CN 108865969 A 17 。