《一种地衣芽孢杆菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种地衣芽孢杆菌及其应用.pdf（11页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 102168029 B (45)授权公告日 2012.10.03 CN 102168029 B *CN102168029B* (21)申请号 201010296494.4 (22)申请日 2010.09.29 CCTCC NO. M2010251 2010.09.27 C12N 1/20(2006.01) C12G 3/02(2006.01) C12R 1/10(2006.01) (73)专利权人 湖北白云边酒业股份有限公司 地址 434200 湖北省松滋市新江口镇民主大 道 28 号 (72)发明人 熊小毛 杨团元 张明春 陈茂彬 曹敬华 (74)专利代理机构 武汉。
2、帅丞知识产权代理有限 公司 42220 代理人 朱必武 CN 101215538 A,2008.07.09, CN 1390942 A,2003.01.15, 刘桂君等 . 地衣芽孢杆菌在牛栏山二锅头基 酒生产中的应用 .酿酒科技 .2009,( 第 8 期 ), (54) 发明名称 一种地衣芽孢杆菌及其应用 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 地 衣 芽 孢 杆 菌 （Bacilluslicheniformis） BG05 菌株 CCTCC NO.M2010251， 及其在生产浓酱兼香型白酒中的应 用。 本发明的菌株最适pH7.0左右， 最适生长温度 为 40 50， 以大豆或麸皮为。
3、发酵基质能够产 香， 发酵底物中游离氨基酸含量较高， 具有较好的 耐热性能， 适用于兼香型及酱香型固态法白酒发 酵生产， 能够为生产用高温大曲增香， 提升浓酱兼 香型白酒的典型风味， 经济环保。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丽玮 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株 CCTCC NO.M2010251。 2. 权利要求 1 所述的地衣。
4、芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株 CCTCC NO.M2010251 在生产浓酱兼香型白酒中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102168029 B 2 1/6 页 3 一种地衣芽孢杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种菌株及其应用， 具体涉及一种地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 及其在生产白酒中的应用。 背景技术 0002 近年来， 国内有关研究单位与生产厂家， 对酱香型白酒的微量成分、 生产工艺进行 了大量的研究与分析， 取得了一些有益的进展， 但是对于酱香型白酒风味物质的本质及酱 香产生所必须的微生物种类尚。
5、不清楚 ； 而从其生理生化角度， 对于微生物在酱香物质产生 过程中产生何种酶及其具体作用及各种微生物之间存在怎样的相互协同作用等方面亦一 直没有确切的解释。 0003 浓酱兼香型白云边酒吸取了酱香型白酒的工艺特点高温曲、 高温堆积和浓香 型白酒的工艺特点混蒸续渣、 泥窖发酵， 把两者的生产工艺创造性地结合在一起， 形成 了其独特的生产工艺。兼香型白酒的主体香主要来自高温大曲， 其主体香成分一直是白酒 行业的研究热点。 到目前为止， 关于酱香型白酒和兼香型白酒的特征香气成分， 在学术界仍 未有定论。 但可以确定的是， 这些香味物质的产生、 风格的形成， 是美拉德反应的结果， 而高 温大曲中的产香。
6、功能菌所代谢的生物酶对美拉德反应起了较强的催化作用。因此， 从产香 细菌的角度来分析白酒的主要呈香物质及其形成机制， 是非常必要的。 0004 尽管通过气相色谱分离等手段可检测高温大曲中的香气成分， 但仍存在着香味成 分的形成是由哪些微生物参与以及哪一种微生物起着主导作用等问题。 白云边高温大曲中 微生物的数量大， 种类多， 且含有数量巨大的嗜热微生物， 其中以耐高温的芽孢杆菌为最。 然而目前还没有报道关于分离酱香高温大曲中有益于酱香风味产生的功能微生物。 0005 中国专利 CN 101215538 公开了一株地衣芽孢杆菌及其应用。该地衣芽孢杆菌为 地衣芽孢杆菌 (BACILLUS LICH。
7、ENIFORMIS)BL57CGMCC .2277， 该菌株可以利用含纤维素 的工农业废弃物为原料， 如植物秸秆、 叶片、 其它农业废弃组织、 酒糟等， 将这些原料其中的 纤维素转化为还原糖。中国专利 CN1390942 公开了一种编码 -1， 3-1， 4 葡聚糖酶的基因 和含有前述基因的地衣芽孢杆菌菌株 (Bacillus licheniformis)EGW039。该菌株所产生 的 -1， 3-1， 4- 葡聚糖酶对 - 葡聚糖的 -1， 3 和 -1， 4 键都有高效的分解作用， 能提 高大麦、 小麦等饲料粮利用率， 节约饲料粮。此外， 在啤酒生产中降低啤酒生产中过滤的困 难， 提高原料。
8、利用率。中国专利 CN1369552 公开了一种微生物复合菌剂及使用其制成的微 生物发酵剂和肥料， 采用枯草芽孢杆菌 35-45、 地衣芽孢杆菌 25-35、 嗜热脂肪芽孢杆 菌 25-35作为菌种， 以上菌种分别经接种、 一级菌种培养， 使菌数含量达 108 个 /ml， 然后 再按上述菌种配比混合并经二级菌种培养， 使菌数含量达 5-9109 个 /ml， 即得复合菌剂。 然而该文献公开的是含有地衣芽孢杆菌及其它两种芽孢杆菌的复合菌剂， 且仅仅用来将池 塘泥、 草炭土、 鸡畜粪、 酒糟、 粉煤灰、 作物秸秆、 城市废弃物等作为基料发酵生产微生物肥 料。 说 明 书 CN 102168029。
9、 B 3 2/6 页 4 发明内容 0006 本发明的第一个目的在于提供一种嗜热芽孢杆菌， 该菌株适用于兼香型及酱香型 固态法白酒发酵生产， 能够为生产用高温大曲增香， 提升浓酱兼香型白酒的典型风味， 经济 环保。 0007 为了实现本发明的目的， 发明人通过大量试验筛选， 最终从白云边酒厂的高温大 曲中， 筛选分离得到适应性良好、 能在 55 -65高温环境下生长良好的地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)BG05 菌株， 并于 2009 年 12 月 10 日保藏于湖北武汉武昌珞珈山 武汉大学中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCC NO.M2010251。 0。
10、008 本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251 具有以下培养特征 ： 0009 牛肉膏蛋白胨培养基 50培养 24h， 菌落呈圆形， 灰色， 凸起， 边缘有细小绒毛， 表 面光滑， 湿润， 粘稠不易挑。菌落大小为 (0.3-0.5)cm(0.3-0.5)cm， 生长速度快。 0010 葡萄糖培养基 50培养 24h， 菌落呈山丘状， 湿润， 有大量粘液， 表面有光泽， 无皱 纹， 边缘缺刻至明显， 缺刻呈羽毛状。菌落大小为 (0.4-0.5)cm(0.4-0.5)cm， 菌落生长极 为迅速。 0011 本发明的地衣芽孢。
11、杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251 具有以下形态特征 ： 0012 于 1000 倍显微镜观察嗜热芽孢杆菌的菌体形态， 菌株形态特征为 ： 菌体杆状， 单 生， 大小约 0.871.43m( 平均 )， 复红染色均匀， 未见不着色脂肪粒， 抗酸复红染色阳性， 芽孢红色。孢囊不膨大， 芽孢椭圆形， 中生或次中生。 0013 本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251 具有以下生物学特性 ： 0014 嗜热芽孢杆菌 BG05 的生长温度为 20 65， 最适生长温。
12、度为 40 50， 在 pH2.0 9.0 的范围内均能生长。 0015 本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251 在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和葡萄糖琼脂培养基 50培养 24h， 连续传代数代培养， 其培 养特征及形态特征均无明显变化， 该菌株的生物学性状基本稳定。 0016 本发明的第二个目的是提供地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株 CCTCCNO.M2010251 在生产浓酱兼香型白酒中的用途。 0017 本 发 明 涉 及 的 地 衣 芽 孢 杆 菌 (Bacillus l。
13、icheniformis)BG05 菌 株 CCTCC NO.M2010251 能够耐高温， 以麸皮作为发酵基质高温培养可获得香味突出的发酵物， 发酵物 中游离氨基酸含量较高。将其制成人工大曲投入酿造生产可提高经济效益。具体表现为如 下优点 ： 0018 1) 根据实施例 2 表 1 的温度耐受性实验可以看出， 实验菌在 50作用生长情况良 好， 在 55下仍能保持一定的生长量， 在 60时菌株生长速度受到抑制。这说明本发明的 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株温度耐受性强， 完全适合工业上浓酱兼 香型白酒生产中的应用 ； 0019 2) 根据实施例 3 。
14、表 2 的菌株大豆发酵实验可以看出， 实验组在地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)BG05 菌株的作用下， 大豆随发酵温度的上升逐渐增香， 在 55 说 明 书 CN 102168029 B 4 3/6 页 5 高温条件下香味浓郁， 发酵完毕， 其吸光度达到 0.693。这说明本发明的地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株温度耐受性强， 而且在 55以下随着温度的升高， 增 香能力越强。 0020 3) 根据实施例 4 表 3、 表 4 的单菌发酵麦麸产游离氨基酸的含量测定试验中 可以看出， 试验组和对照组在氨基酸种类上没有差别 ；。
15、 然而从含量上看， 试验组发酵分 解得到的各类氨基酸含量大多高于对照组。这表明， 本发明的地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株发酵代谢分泌的酶类分解蛋白质的能力较强。 0021 4) 根据实施例 5 表 5 的菌株产香培养基的选择实验可以看出， 试验菌株在麸皮浸 出汁中发酵产香效果最好， 香味浓郁， 其次为麸皮固体培养基。实验结果表明， 本发明的地 衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株在以麸皮为底物的发酵物中产香效果最 好， 液态发酵产香效果优于固态发酵。 附图说明 0022 图 1 为本发明所述的地衣芽孢杆菌 (B。
16、acillus licheniformis)BG05 菌株在牛肉 膏蛋白胨琼脂培养基上的菌落图 0023 图 2 为本发明所述的地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株在葡萄 糖琼脂培养基上的菌落图 0024 图 3 为本发明所述的地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株在 1000 倍显微镜菌体形态图 具体实施方式 0025 以下是本发明的具体实施例， 对本发明的技术方案做进一步作描述， 但是本发明 的保护范围并不限于这些实施例。 凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发 明的保护范围之内。 0026 实施例 1。
17、 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株的培养 0027 从白云边酒厂生产用高温大曲中筛选分离得到适应性良好、 能在 55 -65高温 环境下生长良好的地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株， 并于 2009 年 12 月 10 日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCC NO.M2010251。 0028 该菌株的保藏采用牛肉膏蛋白胨斜面培养基 ： 牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g， NaCl5g， 琼 脂 20g， 自来水 1000mL， pH7.2-7.4， 121灭菌 20m。
18、in。 0029 该菌株的培养采用以下两种培养基 ： (1) 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 ： 牛肉膏 3g， 蛋 白胨10g， NaCl5g， 琼脂20g， 自来水1000mL， pH7.2-7.4， 121灭菌20min ； (2)LB培养基 ： 蛋 白胨 1g， 酵母浸出汁 0.5g， NaC l1g， 水 100mL， pH7.0， 121灭菌 20min。 0030 根据培养基不同， 该菌株的培养方式可选用两种 ： (1) 液体培养制种子液 ： 把菌株 接种于 LB 培养基中， 在 40温度下， 150rpm 摇瓶培养 16h ； (2) 固体培养活化菌株 ： 接种于 牛肉膏蛋白胨琼脂培养。
19、基中， 于 50培养箱培养 16h。 0031 实施例 2 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株的温度耐受性实验 0032 将活化后的地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株培养液按无菌操 说 明 书 CN 102168029 B 5 4/6 页 6 作法分别接种到装有 100mL 实施例 1 所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中， 将接种 后的培养管置于摇床上， 分别放置在 35、 40、 45、 50、 55、 60下， 160rpm 振荡培 养 24h 后， 测定 600nm 波长下的 OD 值， 对浓度大的菌。
20、悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨培养液 适当稀释后测定， 使其 OD 值在 0.10 0.65 以内， 经稀释后测得的 OD 值乘以稀释倍数， 即 为培养液实际的 OD 值。 0033 从表1中可以看出， 实验菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05在50 作用生长情况良好， 在 55下仍能保持一定的生长量， 在 60时菌株生长速度受到抑制。 这说明本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株温度耐受性强， 完全适 合工业上浓酱兼香型白酒生产中的应用。 0034 表 1 不同温度下吸光度值 0035 0036 实施例 3 地衣芽孢杆菌。
21、 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株大豆发酵实验 0037 将活化后的地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株制成种子液， 以 10接种量接种于大豆培养基 ( 黄豆用水浸泡 12h， 去皮， 分装， 每瓶 25g， 121灭菌 30min。)， 按照 35、 45、 55顺序升温发酵， 各温度下发酵 48h， 以不接菌为对照发酵后 观察并感官评价。发酵物用无水乙醇浸提 3h 后离心， 取上清液于 490nm 处测吸光值。 0038 从表2中可以看出， 实验组在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株。
22、 的作用下， 大豆随发酵温度的上升逐渐增香， 在 55高温条件下香味浓郁， 发酵完毕， 其吸 光度达到0.693。 这说明本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株温度 耐受性强， 而且在 55以下随着温度的升高， 增香能力越强。 0039 表 2 单菌发酵大豆结果 0040 0041 实施例 4 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株单菌发酵麦麸产游 离氨基酸的含量测定试验 0042 干燥麸用水浸泡 3h， 分装 (25g/ 瓶 )， 121灭菌 30min。每瓶加入 1mL 地衣芽孢杆 说 明 书 CN 10216。
23、8029 B 6 5/6 页 7 菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株种子液， 按照 55发酵 6d， 发酵后观察嗅闻， 以一 株不产香的枯草芽孢杆菌为对照。发酵结束后， 用 50mL 的 95乙醇分两次抽提发酵原料， 然后在 70条件下烘干， 测定其分解产生的各种氨基酸的量。 0043 发酵结束， 接有地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株的试验 组发酵物颜色加深， 香味突出， 明显区别于对照组。从表 3、 表 4 中可以看出， 试验组和 对照组在氨基酸种类上没有差别 ； 然而从含量上看， 本发明的地衣芽孢杆菌 (Bacil。
24、lus licheniformis)BG05 菌株发酵分解得到的各类氨基酸含量大多高于对照。这表明， 本发明 的地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)BG05 菌株发酵代谢分泌的酶类分解蛋白质的 能力较强。 0044 表 3 单菌发酵麦麸产游离氨基酸含量测定 (mg/100g) 0045 0046 表 4 单菌发酵麦麸产游离氨基酸含量测定 (mg/100g) 0047 0048 实施例 5 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株产香培养基的选择 实验 0049 将地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 。
25、菌株在麸皮培养基 ( 麸皮 49.5g， 葡萄糖0.5g， 加水35mL， 搅拌均匀后， 115灭菌30min)、 小麦固体培养基(干燥小麦 麦粒破碎为麦沙、 麦粉各半， 加等量水， 润浸18h后， 蒸熟、 冷却、 打散， 称取50g于三角瓶中， 121灭菌 30min)、 麸皮浸出汁 ( 小麦麸皮 100g， 高温淀粉酶 1500IU， 加水 500mL， 于 100 蒸煮10min。 待冷却后， 加入碱性蛋白酶50000IU， 于55保持30min。 过滤取上清液， pH6.2。 1105Pa 灭菌 20min， 使用前加葡萄糖至终浓度为 10g/L) 和小麦浸出汁 ( 将干燥小麦麦粒 粉。
26、碎后， 取麦粉 100g， 按麸皮浸出汁方法制作 ) 四种发酵培养基中进行培养， 以不接菌的培 养基为对照。 其中固体发酵培养基接种量为10， 55条件下培养15d ； 液体发酵培养基接 种量为 5， 150rpm， 55条件下培养 6d。发酵结束嗅闻， 筛选获得产香最为明显的发酵培 养基。发酵液的香味， 按无香味 (-)、 微香 (+)、 香味明显 (+)、 香味突出 (+) 四个等级划 分。 0050 表 5 产香培养基的选择 说 明 书 CN 102168029 B 7 6/6 页 8 0051 0052 0053 从表5中可以看出， 地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifor。
27、mis)BG05菌株在麸皮浸 出汁中发酵产香效果最好， 香味浓郁， 其次为麸皮固体培养基。实验结果表明， 本发明的地 衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株在以麸皮为底物的发酵物中产香效果最 好， 液态发酵产香效果优于固态发酵。 0054 从 上 述 实 施 例 2、 3、 4、 5 可 以 看 出， 本 发 明 的 地 衣 芽 孢 杆 菌 (Bacillus licheniformis)BG05 菌株具有一定程度的产香效果， 能够耐高温。BG05 从白云边高温大曲 中分离得到， 它与白酒酿造关系密切， 将其制成强化大曲应用于大曲生产， 有助于高温大曲 的发酵生香， 应用于酿造生产， 能为白酒增香。既经济又环保， 减少企业开支， 提高经济效 益。 说 明 书 CN 102168029 B 8 1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102168029 B 9 2/3 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102168029 B 10 3/3 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102168029 B 11 。