一种用于检测德尔卑沙门氏菌的靶基因、特异性引物对及检测方法和试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710354984.7 (22)申请日 2017.05.19 (71)申请人 安徽科技学院 地址 233100 安徽省滁州市凤阳县东华路9 号 (72)发明人 翟立公王俊颖王蓓蓓王丽 郭元新杨剑婷杜传来 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测德尔卑沙门氏菌的靶基因、 特 异性引物对及检测方法和试剂盒 (57。

2、)摘要 本发明提供一种用于检测德尔卑沙门氏菌 的靶基因、 特异性引物对及检测方法和试剂盒。 本发明特异性引物对是根据5个德尔卑沙门氏菌 特异性检测靶点设计而成， 检测靶点稳定高、 特 异性强， 本发明提供的检测方法包括： 提取样品 DNA， PCR扩增； 凝胶电泳检测扩增产物； 比较电泳 后条带。 通过实验比较分析， 本发明方法具有单 一性强， 检测结果可靠， 结果判定简单的特点， 可 以广泛应用于食品卫生领域。 权利要求书1页 说明书14页 附图2页 CN 107164472 A 2017.09.15 CN 107164472 A 1.一种用于检测德尔卑沙门氏菌的靶基因， RU61_0044。

3、1、 RU61_00445、 RU61_00447、 RU61_RS09205、 RU61_RS06985， 其特征在于： RU61_00441具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸 序列或其特异性片段， RU61_00445具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其特异性片段， RU61_00447具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其特异性片段， RU61_RS09205具有如 SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其特异性片段， RU61_RS06985具有如SEQ ID NO.5所示的 核苷酸序列或其特异性片段。 2.用于扩增权利要求1所述靶基因的特异性引物对， 其。

4、特征在于， 所述特异性引物对分 别为： SD1、 SD2、 SD3、 SD11、 SD12， 其中， SD1-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、 SD1-r： 核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示； SD2-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、 SD2-r： 核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示； SD3-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、 SD3-r： 核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示； SD11-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示、 SD11-r： 核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示； SD12-f： 核苷酸序列如SEQ I。

5、D NO.14所示、 SD12-r： 核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。 3.一种检测德尔卑沙门氏菌的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 提取样品DNA， PCR扩增； S2、 凝胶电泳检测扩增产物； S3、 比较电泳后条带， 若在171bp、 164bp、 512bp、 608bp和296bp位置有条带， 则样品中含 有德尔卑沙门氏菌。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 所述凝胶电泳后171bp位置分离出的DNA片 段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； 164bp位置分离出的DNA片段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 512bp位置分离。

6、出的DNA片段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； 608bp位置 分离出的DNA片段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示296bp位置分离出的DNA片段， 其核苷 酸序列如SEQ ID NO.5所示。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 所述PCR扩增过程中， 25l包含有2 Master 12.5 l， 10 M引物对1 l， 模板取1-5 l， 补ddH2O至25 l。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增过程的反应程序为： 94预变 性10min， 94变性30s， 60退火30s， 72延伸45s， 35个循环， 72延伸10min。

7、。 7.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 所述凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。 8.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 以25 lPCR反应体系计量， 对于权利要求2 所述的SD1、 SD2、 SD3、 SD11和SD12引物， 需要德尔卑沙门氏菌总DNA浓度2.685ng/ l。 9.一种用于检测德尔卑沙门氏菌的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括权利要求2所 述的特异性引物对。 10.权利要求1所述的靶基因或权利要求2所述的特异性引物对或权利要求9所述的试 剂盒在检测德尔卑沙门氏菌中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107164472 A 2 一种用于检测德尔卑沙门氏。

8、菌的靶基因、 特异性引物对及检 测方法和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学及生物检测技术领域， 涉及一种用于检测德尔卑沙门氏菌 的靶基因、 特异性引物对及检测方法和试剂盒。 背景技术 0002 德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby)是引起人类感染的主要沙门氏菌血清型之 一， 此血清型菌株的主要宿主为人类。 德尔卑沙门氏菌可存活在畜禽体内， 一旦畜禽的粪便 或携带此病菌的生肉污染了食品及加工场所， 在温度适宜的环境下， 此菌就会迅速的生长 繁殖， 当菌数在食品中达到一定数量， 被食用后就会造成食物中毒， 危害人的身心健康， 严 重者甚至危及生命。 郑华英、 周敦金等在2。

9、003年 一起德尔卑沙门氏菌污染水源引起的肠道 传染病暴发流行的调查 中显示， 武汉市一个村庄因为饮用了未经消毒的井水后， 陆续出现 了上吐下泻、 腹痛发热等症状， 随后检验人员进行了取样检验分析， 发现该次事故是由于德 尔卑沙门氏菌感染而引起。 谢春平等在2013年 合肥地区五类食品沙门氏菌污染情况调查 分析 中发现， 合肥地区常见五类食品 (生肉、 水产品、 卤菜、 乳制品、 发酵豆制品)的沙门氏 菌污染调查表明， 在以上食品中共检测出沙门氏菌22株， 其中德尔卑沙门菌占到 45.6。 国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定沙门氏菌为必检项目。 目 前， 随着分子生。

10、物学的不断发展尤其是聚合酶链式反应(PCR)的发展， 通过分子技术检测鉴 定沙门氏菌血清型变得更加可靠。 0003 现有技术中， 德尔卑沙门氏菌检测主要使用传统的培养方法， 整个检测过程步骤 较多， 时间较长， 一般需要4-6个工作日， 而且干扰的因素较多， 检测结果的判定较复杂， 给 食品检测带来非常不利的影响。 而且用于德尔卑沙门氏菌的PCR检测的靶基因研究较少且 主要是由于没有合适的检测靶点。 发明内容 0004 针对现有技术不足， 本发明提供一种用于检测德尔卑沙门氏菌的靶基因、 特异性 引物对及检测方法和试剂盒， 解决了现有技术中德尔卑沙门氏菌检测结果判定复杂、 检测 周期长的技术问题。

11、。 0005 为实现以上目的， 本发明通过以下技术方案予以实现： 0006 一种用于检测德尔卑沙门氏菌的靶基因， RU61_00441、 RU61_00445、 RU61_00447、 RU61_RS09205、 RU61_RS06985， RU61_00441具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其特 异性片段， RU61_00445具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其特异性片段， RU61_ 00447具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其特异性片段， RU61_RS09205具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其特异性片段， RU61_RS0698。

12、5具有如SEQ ID NO.5所示的核苷 酸序列或其特异性片段。 0007 用于扩增所述靶基因的特异性引物对， 所述特异性引物对分别为： SD1、 SD2、 SD3、 说明书 1/14 页 3 CN 107164472 A 3 SD11和SD12， 其中， 0008 SD1-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、 SD1-r： 核苷酸序列如 SEQ ID NO.7所示； 0009 SD2-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、 SD2-r： 核苷酸序列如 SEQ ID NO.9所示； 0010 SD3-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、 SD3-r： 核苷酸序列如。

13、 SEQ ID NO.11所 示； 0011 SD11-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示、 SD3-11： 核苷酸序列如SEQ ID NO.13所 示； 0012 SD12-f： 核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示、 SD12-r： 核苷酸序列如SEQ ID NO.15所 示。 0013 一种检测德尔卑沙门氏菌的方法， 包括以下步骤： 0014 S1、 提取样品DNA， PCR扩增； 0015 S2、 凝胶电泳检测扩增产物； 0016 S3、 比较电泳后条带， 若在171bp、 164bp、 512bp、 608bp和296bp 位置有条带， 则样 品中含有德尔卑沙门氏菌。。

14、 0017 优选的， 所述凝胶电泳后171bp位置分离出的DNA片段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； 164bp位置分离出的DNA片段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 512bp位置分离 出的DNA片段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； 608bp位置分离出的DNA片段， 其核苷酸序 列如SEQ ID NO.4所示； 296bp位置分离出的DNA片段， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。 0018 优选的， 所述PCR扩增过程中， 25 l包含有2Master 12.5 l， 10 M 引物对1 l， 模 板取1-5 l， 补ddH2O至25 l。

15、。 0019 优选的， 所述PCR扩增过程的反应程序为： 94预变性10min， 94变性30s， 60 退火30s， 72延伸45s， 35个循环， 72延伸 10min。 0020 优选的， 所述凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。 0021 优选的， 以25 lPCR反应体系计量， 对于权利要求2所述的SD1、 SD2、 SD3、 SD11和 SD12引物， 需要德尔卑沙门氏菌总DNA浓度2.685 ng/ l。 0022 一种用于检测德尔卑沙门氏菌的试剂盒， 所述试剂盒包括所述的特异性引物对。 0023 一种所述的靶基因或所述的特异性引物对或所述的试剂盒在检测德尔卑沙门氏 菌中的应用。 002。

16、4 本发明提供一种用于检测德尔卑沙门氏菌的靶基因、 特异性引物对及检测方法和 试剂盒， 与现有技术相比优点在于： 0025 本发明通过基因组比较分析获得德尔卑沙门氏菌的特异性检测靶基因， 从而通过 特异性引物对进行PCR扩增、 电泳检测该目的基因， 本发明检测结果准确， 检测过程简单， 检 测周期短， 实现了德尔卑沙门氏菌高特异性快速检测的目的； 0026 本发明提供检测德尔卑沙门氏菌的5个特异性靶基因、 相应的PCR 引物对、 利用以 上引物对和靶基因进行检测， 特异性引物对是根据5 个德尔卑沙门氏菌特异性检测靶点设 计而成， 该特异性检测靶点稳定高、 特异性强， 通过合理优化PCR扩增反应。

17、体系， 凝胶电泳检 测手段， 可以快速、 准确地鉴定出德尔卑沙门氏菌； 0027 采用本发明的检测方法可直接鉴定德尔卑沙门氏菌， 不需要血清型实验， 检测时 间缩短在12h以内， 并且， 由于检测过程无需采用传统检测方法中必须使用的抗血清， 可降 说明书 2/14 页 4 CN 107164472 A 4 低检测成本， 本发明通过PCR 检测特异性DNA片段， 具有单一性强， 检测结果可靠， 结果判定 简单的特点， 能够广泛应用于食品卫生领域。 附图说明 0028 图1为本发明特异性引物对SD1、 SD2、 SD3、 SD11和SD12对不同菌种特异性评价凝胶 电泳结果图； 0029 图2为本。

18、发明特异性引物对SD1、 SD2、 SD3、 SD11和SD12对不同模板浓度灵敏度评价 凝胶电泳结果图。 0030 图中1号引物为SD1特异性引物对； 2号引物为SD2特异性引物对； 3号引物为SD3特 异性引物对； 11号引物为SD11特异性引物对； 12 号引物为SD12特异性引物对； 0031 1、 ddH2O； 2、 德尔卑沙门氏菌； 3、 猪霍乱沙门氏菌； 4、 乙型副伤寒沙门氏菌； 5、 丙型 副伤寒沙门氏菌； 6、 汤普逊沙门氏菌； 7、 亚利桑那沙门氏菌； 8、 都柏林沙门氏菌； 9、 鸭沙门 氏菌； 10、 波斯坦沙门氏菌； 11、 阿伯丁沙门氏菌； 12、 S.病牛沙门氏。

19、菌； 13、 山夫顿堡沙门氏 菌； 14、 火鸡沙门氏菌； 15、 甲型副伤寒沙门氏菌； 16、 伦敦沙门氏菌； 17、 鼠伤寒沙门氏菌； 18、 肠炎沙门氏菌； 19、 布雷德沙门氏菌； 20、 达喀尔沙门氏菌； 21、 伊斯特本沙门氏菌； 22、 迈 阿密沙门氏菌； 23、 阿贡纳沙门氏菌； 24、 巴森海德沙门氏菌； 25、 蒙特维的亚沙门氏菌； 26、 耶路撒冷沙门氏菌； 27、 波恩沙门氏菌； 28、 布伦登鲁普沙门氏菌； 29、 圣保罗沙门氏菌； 30、 海德尔堡沙门氏菌； 31、 肯塔基沙门氏菌； 32、 布洛克利沙门氏菌； 33、 博纳恩沙门氏菌； 34、 旺兹沃斯沙门氏菌； 。

20、35、 阿德莱德沙门氏菌。 具体实施方式 0032 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面结合实施例对本发明 实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例是本发明一部分实施 例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0033 实施例1： 0034 PCR检测方法对不同菌种特异性评价 0035 1、 德尔卑沙门氏菌血清型特异性基因的筛选 0036 在NCBI数据库中获得了德尔卑沙门氏菌CVM40386菌株 (NZ_JYYM01000031)的全 基因。

21、组序列， 根据比较基因组的方法将该菌基因组的每个基因利用NCBA网站的Blast程序 进行比对， 选择与该血清型同源性较高(E值0,Q ery cover0)同时与其它微生物的 同源性很低(Q ery cover10)的基因作为德尔卑沙门氏菌的准特异性基因。 通过该方 法共获得12个德尔卑沙门氏菌的准特异性基因， 再针对每一个基因设计多对引物， 利用实 验室保存的沙门氏菌其它血清型进行特异性验证。 根据PCR结果， 确定RU61_00441、 RU61_ 00445、 RU61_00447、 RU61_RS09205、 RU61_RS06985基因作为德尔卑沙门氏菌血清型特异性 的检测靶点， 。

22、基因序列分别如SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 0037 2、 引物设计 0038 通过Primer5.0软件设计引物， 设置GC范围在40-60， 产物大小范围为100- 说明书 3/14 页 5 CN 107164472 A 5 1000bp， 从备选引物对中选择出引物， 5对特异性引物对： SD1、 SD2、 SD3、 SD11和SD12， 核苷 酸序列分别为SD1-f： SEQ ID NO.6、 SD1-r： SEQ ID NO.7； SD2-f： SEQ ID NO.8、 SD2-r： 。

23、SEQ ID NO.9； SD3-f： SEQ ID NO.10、 SD3-r： SEQ ID NO.11； SD11-f： SEQ ID NO.12、 SD11-r： SEQ ID NO.13； SD12-f： SEQ ID NO.14、 SD12-r： SEQ ID NO.15； 委托上海生工生物工程技术 服务有限公司合成。 0039 3、 DNA模板的制备 0040 将包括德尔卑沙门氏菌(Salmonella derby)等46株沙门氏菌标准菌株和18株非 沙门氏菌(如表1)(编号为CICC的菌株购自于中国工业微生物菌种保藏中心， 编号为CMCC的 菌株购自于中国医学微生物菌种保藏中心，。

24、 无编号的为实验室自己保藏的菌株， 如果其他 同行出于研究需要， 本试验室愿意提供该菌株)的各个血清型分别接种到 30ml的LB液体培 养基中， 37培养8h。 分别取1ml各菌菌悬液于1.5ml 离心管中， 12000r/min， 离心1min， 弃 上清。 用500 l灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次， 再用100 l灭菌纯水溶解沉淀。 在沸水浴中煮 沸10min， 12000r/min， 离心1min， 取上清液作为PCR模板。 0041 4、 PCR扩增反应体系的建立 0042 建立PCR检测体系： 25 l反应体系包含： 2Master 12.5 l， 10 M 引物对1 l， 模板 取1。

25、 l， 补ddH2O至25 l。 0043 设定PCR的反应程序： 94预变性10min， 94变性30s， 60退火30s， 72延伸 45s， 30个循环， 72延伸10min。 于PCR仪中按照既定的反应体系和反应程序分别以上述步 骤中提取的各菌菌株 DNA为模板进行PCR扩增， 以做凝胶电泳进行检测。 0044 5、 凝胶电泳检测 0045 将上述进行PCR扩增后的产物和作为Marker的DS2000DNA、 ddH2O按照既定的顺序 分别取6 l加到1的琼脂糖凝胶中， 用150V 电压跑40min后， GoldView染色后观察结果。 0046 PCR凝胶检测结果如图1、 表1和表2。

26、， 以包括德尔卑沙门氏菌 (Salmonella Derby) 在内的37株沙门氏菌DNA作为模板， PCR扩增后仅有德尔卑沙门氏菌在171bp、 164bp、 512bp、 608bp和296bp出现特异性电泳条带； 为更好说明本发明的特异性， 以不同来源的沙门氏菌 共46株和18株非沙门氏菌(表1和表2中， 其中 “*” 代表分离株， 其它为标准菌株)进行PCR扩 增， 凝胶电泳得到结果如表1所述。 电泳结果在171bp、 164bp、 512bp、 608bp和296bp位置出现 扩增条带时， 证明为阳性结果， 以 “+” 表示； 当该位置没有扩增条带， 证明为阴性结果， 以 “” 表示。

27、； 从表1也可以看出， 经过该方法PCR扩增， 仅德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby) 出现阳性反应。 结果很好地说明了本发明提供的方法稳定性高， 特异性强， 适用范围广， 检 测结果准确。 0047 实施例2： 0048 PCR检测方法对不同模板浓度灵敏度评价 0049 德尔卑沙门氏菌血清型特异性基因的筛选、 引物设计步骤如实施例1。 0050 DNA模板的制备： 挑取德尔卑沙门氏菌单菌落转接到30ml的LB 液体培养基中， 37 过夜培养。 以上海生工生物工程技术服务有限公司生产的细菌基因组DNA小量提取试剂 盒， 提取德尔卑沙门氏菌总 DNA， 经测定， 浓度为265.8n。

28、g/ l。 用无菌水作10倍梯度稀释， 共 稀释7个梯度， 作为PCR模板。 0051 PCR扩增反应体系的建立： 建立PCR检测体系： 25 l反应体系包含： 2Master 12.5 说明书 4/14 页 6 CN 107164472 A 6 l， 10 M引物对1 l， 模板取5 l， 补ddH2O至25 l。 设计PCR的反应程序： 94预变性10min， 94 变性30s， 60退火 30s， 72延伸45s， 30个循环， 72延伸10min。 0052 取上述步骤中6个梯度DNA模板各取1 l加入PCR反应体系， 于 PCR仪上进行反应扩 增。 取6 lPCR扩增产物到1的琼脂糖。

29、凝胶中， 用150V电压跑40min后， GoldView染色后观察 结果。 0053 针对于SD1、 SD2、 SD3、 SD11和SD12引物对从第1到第3泳道 0054 171bp、 164bp、 512bp、 608bp和296bp处均有条带显示， 第3泳道相 0055 应的浓度为2.658ng/ l， 电泳结果如图2(图2中M为DNAladder I； 0056 模板浓度2-10为265.85ng/ l、 26.59ng/ l、 2.69ng/ l、 268.59pg/ l、 0057 26.86pg/ l、 2.69pg/ l、 268.59fg/ l、 26.86fg/ l和2.。

30、69fg/ l)所示。 因 0058 此， 判定对于171bp、 164bp、 512bp、 608bp和296bp引物的PCR检 0059 测灵敏度为2.658ng/ l。 0060 表1特异性评价所用的菌株及检测结果 0061 0062 表2特异性评价所用的菌株及检测结果 0063 说明书 5/14 页 7 CN 107164472 A 7 0064 0065 综上所述， 本发明通过基因组比较分析获得德尔卑沙门氏菌的特异性检测靶基 因， 从而通过特异性引物对进行PCR扩增、 电泳检测该目的基因， 本发明检测结果准确， 检测 过程简单， 检测周期短， 实现了德尔卑沙门氏菌高特异性快速检测的目。

31、的； 0066 本发明提供检测德尔卑沙门氏菌的5个特异性靶基因、 相应的PCR 引物对、 利用以 上引物对和靶基因进行检测， 特异性引物对是根据5 个德尔卑沙门氏菌特异性检测靶点设 计而成， 该特异性检测靶点稳定高、 特异性强， 通过合理优化PCR扩增反应体系， 凝胶电泳检 测手段， 可以快速、 准确地鉴定出德尔卑沙门氏菌； 0067 采用本发明的检测方法可直接鉴定德尔卑沙门氏菌， 不需要血清型实验， 检测时 间缩短在12h以内， 并且， 由于检测过程无需采用传统检测方法中必须使用的抗血清， 可降 低检测成本， 本发明通过PCR 检测特异性DNA片段， 具有单一性强， 检测结果可靠， 结果判定。

32、 简单的特点。 0068 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些修改或者 替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。 0069 说明书 6/14 页 8 CN 107164472 A 8 0070 说明书 7/14 页 9 CN 107164472 A 9 0071 说明书 8/14 页 10 CN 107164472 A 10 0072 说明书 9/14 页 11 CN 107164472 A 11 0073 说明书 10/14 页 12 CN 107164472 A 12 0074 说明书 11/14 页 13 CN 107164472 A 13 0075 说明书 12/14 页 14 CN 107164472 A 14 0076 说明书 13/14 页 15 CN 107164472 A 15 0077 说明书 14/14 页 16 CN 107164472 A 16 图1 说明书附图 1/2 页 17 CN 107164472 A 17 图2 说明书附图 2/2 页 18 CN 107164472 A 18 。