本发明涉及表达多于一种可变表面蛋白(VSP)的修饰原生动物，包含所述修饰原生动物的疫苗、杂交瘤系、识别蛋白的单克隆抗体，及其步骤、应用和方法。更具体地，本发明涉及包括同时表面表达多于一种可变表面蛋白(VSP)的经修饰的寄生性原生动物。修饰原生动物还可同时表达可变表面蛋白的所有种类(complete repertoire)。原生动物显示出切丁酶(Dicer)和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的表达下降，其中RdRP基因和/或切丁酶基因被沉默。所述原生动物可以是具有抗原变异机制的任何原生动物，并可通过调控此机制的分子沉默其表达。
背景技术
抗原变异是含有暴露于表面的抗原决定簇的病原微生物发生的克隆表型变化。这些生物使用不同的机制改变其表面抗原表达，从而能够在宿主产生的持续免疫压力下维持慢性感染(Deitsch，K.W.，Moxon，E.R.以及Wellems，T.E.Microbiol.Mol.Biol.Rev.61，281-293(1997))。蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia，又名runwayd肠贾第鞭毛虫(runwayd Giardia intestinalis)或十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis))是最常见的人肠寄生虫之一。原生动物蓝氏贾第鞭毛虫也在使寄生虫能够发展成慢性和/或复发感染的过程中显示出抗原变异(Adam，R.D.Clin.Microbiol.Rev.14，447-475(2001)和Nash，T.E.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B 352，1369-1375(1997))。在编码可变表面蛋白(VSP)的所有约190个基因，在特定时间，贾第鞭毛虫仅在每只寄生虫表面上表达一种VSP，但通过未知的机制自发转化成不同的VSP。在贾第鞭毛虫中，抗原变异是导致某些可变和/或长期感染过程，以及多种感染倾向的原因，并且涉及已知为VSP的蛋白家族(Adam，R.D.Clin.Microbiol.Rev.14，447-475(2001)和Nash，T.E.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B 352，1369-1375(1997)。
VSP位于完全滋养体(complete trophozoite)表面，并且是宿主免疫反应识 别的主要抗原。VSP的大小范围在30kDa至200kDa之间；其具有可变的富半胱氨酸氨基末端区域和保守的羧基末端区域，所述羧基末端区域包括疏水的跨膜结构域和仅包含5个氨基酸(CRGKA)的短胞质尾。寄生虫基因组编码总计约190个编码VSP的基因(Morrison，H.G.等，Science 317，1921-1926(2007))，但在任何给定时间点，在每个滋养体表面上仅表达一种VSP。向表达另一种VSP的转换每6-13代发生一次，即便没有任何免疫压力也是如此(Nash，T.E.，Alling，D.W.，Merritt，J.W.Jr以及Conrad，J.T.Exp.Parasitol.71，415-421(1990))。与其他蓝氏贾第鞭毛虫基因类似，编码VSP的基因没有内含子，并且其上游区域相对较短，并且发现其序列保守性有限或没有序列保守性。此外，在这些区域中不存在典型的真核启动子。包含贾第鞭毛虫VSP基因的信使RNA的3′非翻译区也往往较短，通常长度为0-30个核苷酸。迄今为止，已经证明基因重排过程和依赖启动子的开/关机制都没有参与贾第鞭毛虫的抗原转换(Adam，R.D.Clin.Microbiol.Rev.14，447-475(2001)；Nash，T.E.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B 352，1369-1375(1997)和Nash，T.E.，Alling，D.W.，Merritt，J.W.Jr以及Conrad，J.T.Exp.Parasitol.71，415-421(1990))。
发明内容
本发明提供了包括同时表面表达多于一种可变表面蛋白(VSP)的修饰寄生性原生动物。在一种优选的实施方式中，所述原生动物包括同时表面表达的可变表面蛋白的所有种类。原生动物显示出切丁酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的表达下降，其中RdRP基因和/或切丁酶基因已被沉默。所述原生动物可以是显示抗原变异机制的任何原生动物，其中其抗原变异机制可不受其任何组件沉默的调控。
本发明提供了一种对抗原生动物产生的感染的疫苗，其至少包含在其表面表达至少两种可变表面蛋白(VSP)的修饰原生动物。在一种优选的实施方式中，所述原生动物包括在其表面同时表达的可变表面蛋白的所有种类。原生动物显示出切丁酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的表达下降，其中RdRP基因和/或切丁酶基因被沉默。所述原生动物可以是显示抗原变异机制的任何原生动物。所述疫苗还可包含赋形剂和/或助剂。
本发明提供了用于纯化原生动物所有种类的可变表面蛋白(VSP)的方法，所述方法包括：
a)将识别VSP CRGKA氨基酸序列的抗体连接到固体支持物；
b)使所述固体支持物接触原生动物；和
c)分离所有种类的可变表面蛋白(VSP)种类。所述原生动物可以是野生原生动物克隆的混合物，其中每个克隆表达不同的可变表面蛋白，或者所述原生动物也可以是表达所有种类VSP的克隆。
本发明提供了包含多于一种原生动物可变表面蛋白以及赋形剂和/或助剂的疫苗，其中每种所述蛋白是不同的。在一种优选的实施方式中，所述疫苗包含原生动物可变表面蛋白的所有种类，其中每种所述蛋白是不同的。
本发明提供了一种免疫方法，其包括向哺乳动物施用一定量包含修饰原生动物的疫苗，所述修饰原生动物表达至少两种可变表面蛋白(VSP)或同时表达原生动物VSP的所有种类。所述方法用于免疫哺乳动物以对抗原生动物产生的感染，其中所述原生动物具有抗原变异机制。
此外，本发明还提供了免疫方法，其包括向哺乳动物施用一定量的包含原生动物可变表面蛋白的组合的疫苗，其中所述可变表面蛋白的组合分离自包含沉默的RdRP基因和/或切丁酶基因的修饰原生动物。所述方法用于免疫哺乳动物以对抗原生动物产生的感染，其中所述原生动物具有抗原变异机制。在一种实施方式中，施用的疫苗剂量包括50至500μg的原生动物可变表面蛋白。
本发明提供了核苷酸序列，其中所述序列可选自序列SEQ ID No.1至SEQ ID No.112的任一条，其中所述序列为ARNdc。
本发明提供了选自序列SEQ ID No.1至SEQ ID No.112的至少一条序列的应用，其用于沉默RdRP基因或沉默切丁酶基因。
附图说明
图1显示了贾第鞭毛虫中的多个VSP基因同时转录；其中a：使用在[32P]UTP存在下诱导体外转录的新分离的贾第鞭毛虫细胞核进行核连缀分析(nuclear run–on assay)；b：使用包含存在于所有VSP的保守区的探针，对从克隆WB9B10和WB1267提取的总RNA进行RNA印迹(Northern blot)检测；c：将体外产生的正义和反义转录本(vsp9B10、vsp1267、vspA6、vspH7、cwp2 和GDH)印迹并与在如图1a相同条件下的核连缀分析产物杂交；d：对使用特异引物(9B10F/9B10R和1267F/1267R)从克隆WB9B10滋养体基因组DNA上产生的PCR产物(1道和5道)，或使用反向探针R2(2道和6道)或正义探针S1(3道和7道)产生的cDNA进行比较，第4道是不含RT的反应对照，白色箭头指向vsp9B10片段，其存在于基因组DNA和正义cDNA，但不存在于反义cDNA中；黑色箭头指向vsp1267片段，其存在于基因组DNA、正义cDNA和反义cDNA中。M表示分子量标记。
图2显示了用于研究蓝氏贾第鞭毛虫中抗原变异的新工具。a：产生有待于通过PCR扩增成大量VSP编码基因的适合的寡核苷酸；选择从(VSP1267、VSP9B10和VSPA6)和GS(VSPH7)分离的四种蓝氏贾第鞭毛虫VSP的序列，比对这四条序列，并使用四个保守区设计引物；寡核苷酸序列下的箭头指明了用于设计VSP通用引物(S1-S4和R1-R2)的序列；b：在对贾第鞭毛虫WB9B10克隆(在其表面仅表达VSP9B10)的基因组DNA的PCR检测中，使用四种正义引物(S1-S4)和两种反义引物(R1、R2)的组合；不依赖于所用的引物组合扩增多个DNA片段，并且分离、克隆并测序了这些反应的59个主要产物，发现其均为编码VSP的片段；随后使用这些产物中的多个(白色标记1-8)作为探针来检测基因组DNA文库，这样可以鉴定编码具有贾第鞭毛虫VSP典型特征的新蛋白(VSPS1-S8，GenBank登录号AY142122至AY142129)的ORF(可读框)；左侧显示了以nt(核苷酸)计的分子量标记。c：为了核实贾第鞭毛虫VSP转录本沉默是否涉及VSP反义ARN，在从表达单一VSP的滋养体分离的ARN制备物中检索这些分子；使用与此前用于基因组DNA相同的VSP引物组合但在反转录反应(RT)期间使用正义引物来进行RT-PCR；上侧显示了正义引物(S1至S4)；泳道(a)至(h)表明了用于每个PCR反应的引物组合：(a)S1-R1，(b)S2-R1，(c)S3-R1，(d)S4-R1，(e)S1-R2，(f)S2-R2，(g)S3-R2和(h)S4-R2；此外，还显示了没有反转录的阴性对照(RT-)。在这些条件下，分离、克隆并测序了38个扩增产物，证明反义编码VSP，这些产物中的12个(靶标标记为1至12)还作为探针用于基因组文库中，这样可以获得新VSP基因(VSPAS1-VSPAS12，GenBank登录号AY143130-AY142141)的完整序列，表明了VSP基因反义转录本的功能靶标。
图3显示a：使用WB9B10克隆滋养体表达的HA表位标记的gRdRP变 体的免疫定位；所述酶(红色)位于两个寄生虫细胞核周边的区域；如与伴侣蛋白ER-BiP(Mab 9C9，绿色)的免疫共定位所示，该区域主要涉及粗面内质网(黄色)；b：RdRP活性，其中在没有引物(A-C)或存在引物R1(D)或R2(E)的情况下，使用不同的RNA底物组合(A、B和D：vsp9B10和vsp1267；C和E：vsp9B10，vsp1267和vspH7)，A是不含纯化RdRP的对照。c：使用WB9B10克隆滋养体表达的HA表位标记的g切丁酶的免疫定位；所述酶(绿色)位于细胞胞质中，细胞核由DAPI染色(蓝色)；d：使用WB9B10克隆滋养体中表达的HA表位进行信号标记的gAgo的免疫定位；所述酶(绿色)位于细胞胞质中，细胞核由DAPI染色(蓝色)；e：使用用于gRdRP、gAgo、g切丁酶、GDH和CWP1的探针对从诱导形成包囊4、6或12小时期间的WB9B10克隆滋养体(且所述滋养体保持在一个正常培养基(NT)中12个小时)提取的总RNA进行RNA印迹，结果显示这些PTGS组分(转录后基因沉默)的组成型表达。
图4显示了贾第鞭毛虫中的切丁酶活性和小VSP RNA的检测。a：从贾第鞭毛虫提取物的dsRNA产生小RNA，表明切丁酶型活性。对于vsp1267dsRNA，对其双链(1道)、仅正义RNA链(2道)或仅反义链(3道)进行放射性标记。对于vsp9B10和gdh，进行双链标记。将双链RNA与WB9B10克隆的贾第鞭毛虫提取物一起在37℃温育1小时，随后，分离总RNA并用于电泳。在所有情况下均获得小RNA；b：贾第鞭毛虫dsRNA加工中存在ATP的作用，1道和2道显示未处理的对照：将vsp1267dsRNA与贾第鞭毛虫胞质裂解物一起温育而不浪费ATP(分别温育1小时和3小时)，通过添加2mM葡萄糖和0.1U/μL己糖激酶来减少ATP(3道)。使用磷酸肌酸(CP，4道)、肌酸激酶(CK，5道)或这二者(6道)产生ATP；c：通过将VSP核糖核酸探针(VSP riboprobe)与来自贾第鞭毛虫WB9B10克隆的提取物温育来产生小RNA。将一种、两种或三种不同的VSP RNAm(vsp9B10，vsp1267，vspH7)与贾第鞭毛虫提取物一起混合。在存在多于一种转录本的情况下形成小RNA。使用gdh作为无关基因对照。左侧为按核苷酸计的RNA分子量标记；d：对WB9B10克隆和WB1267克隆滋养体的总RNA，以及低分子量WB1267克隆RNA(LMW-低分子量)进行电泳、印迹并使用部分降解的体外转录vsp9B10 RNA探针进行杂交。在WB9B10克隆中没有发现小RNA；与此不 同，不表达VSP9B0的WB1267克隆中存在小vsp9B10 RNA(箭头所示处)。意外地发现了长度为70个核苷酸的RNA(星号标记)，其可代表部分降解的RNAm。
图5显示了通过将VSP核糖核酸探针与贾第鞭毛虫WB1267克隆提取物一起温育而产生小RNA；将不同VSP(vsp9B10，vsp1267，vspH7)的一种、两种或三种RNAm混合，并使之接触贾第鞭毛虫滋养体提取物，在存在多于一种转录本时产生了[32P]标记的小RNA；左侧为按核苷酸计的RNA分子量标记。
图6显示了过表达VSPH7的WB9B10滋养体中的抗原转换(antigenic commutation)。a：使用pTubCWP1.Pac载体或pTubH7.Pac载体转染WB9B10克隆滋养体，在α-微管蛋白启动子的控制下指导CWP1或VSPH7表达，将使用对照载体(pTubCWP1.Pac)转染的表达VSP H7的GS株滋养体作为对照(由倒三角表示)，方块显示使用对照载体转染的WB9B10滋养体，由于表面蛋白的自发转换，VSP 9B10表达随时间下降，而组成型地表达vspH7的WB9B10滋养体显示VSP9B10(圆形)或VSPH7(三角形)的表达下降速度快于各自的对照。结果表示为3个独立试验的平均百分数±标准差。b：在时间0，表达VSPH7的WB9B10滋养体的典型图像，所有细胞同时在其表面表达VSP9B10和VSPH7；c：培养15天后，表达VSPH7的WB9B10滋养体的典型图像，一些细胞在其表面表达VSP9B10和VSPH7，另外一些细胞仅表达VSP9B10或VSPH7，其余细胞二者均不表达；使用DAPI将细胞核标记为蓝色；
图7显示了表达vsp9B10反义片段的WB9B10滋养体的抗原转换。a：使用pTubCWP1.Pac载体(方形)或包含vsp9B10基因5′(圆形)或3′(三角)一半序列的反义序列的pTubPac载体转染WB9B10克隆滋养体；结果表示为3个独立试验的平均百分数±标准差，并且表明VSP 9B10阳性滋养体量的下降速度快于对照；b：使用不同VSP基因转染的WB9B10滋养体的典型图像，所有细胞均在其表面表达VSP9B10；c：培养15天后，表达vsp9B10反义片段3′的WB9B10滋养体的典型图像，VSP9B10占群体的约50％，使用DAPI将细胞核标记为蓝色。
图8显示了不同转录本浓度的变化可决定哪一种转录本逃脱沉默系统。 在pGEM-T-easy载体中克隆编码VSP的1267、vsp9B10和cwp1基因，并在存在或不存在32P-UTP的情况下进行体外转录；在长短不同的时间段中，使用包含固定浓度的放射性标记vsp1267 RNA的WB1267胞质提取物产生不同浓度的无标记vsp9B10和CWP1转录本，1道：多个核苷酸标记(Decade-Ambion)；2、3和4道：将750ng vsp9B10和250ng vsp1267(比例3∶1)分别温育1、5和24小时；5、6和7道：将等量vsp9B10和vsp1267(各250ng，比例1∶1)分别温育1、5和24小时；8和9道：将750ng CWP1和250ng vsp1267分别温育5和24小时；10道：250ng vsp1267转录本的温育，短温育期(1小时)内，WB1267克隆中几乎没有vsp1267降解，这与添加到混合物中vsp9B10的量无关(2道和5道)。与此不同，在温育较长时间(5小时)后，vsp9B10的存在使放射标记的小vsp1267 RNA出现增加(将10道与3、6和8道比较)，而CWP1转录本(无关)的存在则没有影响，包括在高浓度下(8道)。在温育24小时时，大多数放射标记的转录本被完全降解；
图9显示了贾第鞭毛虫滋养体中切丁酶和RdRP基因的沉默结果，其中通过对RT-PCR获得的条带的密度分析，以及5次RNA印迹测定，与未转染的WB9B10滋养体相比，贾第鞭毛虫切丁酶-AS和RdRP-AS克隆显示出65％至75％之间的信使RNA下降水平，其中结果表示为平均值±标准差。
图10显示了具有沉默的RdRP和切丁酶的转基因贾第鞭毛虫滋养体中不同VSP的表达，a：使用共轭有TRITC的5C1单克隆抗体(VSP1267；右图)和共轭有FITC的9B10单克隆抗体(VSP9B10；左图)在切丁酶-AS转染的滋养体(下图)或空载体(上图)中的直接免疫荧光分析；贾第鞭毛虫中的切丁酶表达被沉默时，表达表面VSP9B10的滋养体还表达VSP1267(合成图；中图)；b：使用特异单克隆抗体(VSP9B10，9B10单克隆抗体；VSP1267，5C1单克隆抗体；VSPA6，6E7单克隆抗体)，通过流式细胞术分析测定9B10、1267克隆以及使用针对贾第鞭毛虫RdRP(RdRP-AS)或切丁酶(切丁酶-AS)的反义构建体转染的细胞克隆中表达特定VSP的贾第鞭毛虫滋养体百分数，使用抗大鼠的山羊免疫球蛋白作为阴性对照；c：其中切丁酶基因被敲除的野生型WB9B10和滋养体WB9B10的蛋白提取物的蛋白质印迹(Western blot)测试，在电泳并转移到硝酸纤维素后，将滤膜(filter)与以下杂交：(1)本发明的G3克隆12F1单克隆抗体(针对所有VSP中的CRGKA保守结构域产生) 或(2)9B10单克隆抗体(VSP9B10特异性)。
图11显示了野生型贾第鞭毛虫克隆和经过抗原变异脱调节(deregulation)修饰的贾第鞭毛虫中的VSP表达；显示了滋养体的共焦免疫荧光图像，其中切丁酶(a)或RdRP(b)已被沉默；使用DAPI(蓝色)复染，使用抗VSP单克隆抗体(绿色)的间接免疫荧光分析的典型图像，WB9B10(d)，WB1267(e)和GS/M-H7(f)，以及(c)使用本发明的抗CRGKA 12F1单克隆抗体(绿色)染色并使用DAPI(蓝色)复染的分离的非克隆WB群体的免疫荧光图像。
图12显示在由野生型和转基因滋养体的不同群体感染并使用WB9B10和WB1267进行攻击的沙鼠的保存样品中，贾第鞭毛虫包囊的检测和定量。(a)首先使用WB9B10、WB1267克隆群或切丁酶(DAS)或RdRP(RAS)表达被沉默的转基因滋养体以及二者1∶1的混合物感染沙鼠。(b-e)对先前被贾第鞭毛虫WB9B10(b)、WB1267(c)、DAS(d)和RAS(e)感染的沙鼠，在初次感染2个月后，使用WB9B10和WB1267的克隆群进行攻击；计数动物释放的包囊量。该图显示了5个不同试验的平均值。
图13显示了在使用表达所有种类的VSP的贾第鞭毛虫滋养体初次感染后，继续使用表达特定VSP的滋养体对沙鼠进行攻击的结果。使用WB9B10(e-h)、WB1267克隆(i-l)或纯化的包囊(m-p)对先前被WB9B10、WB1267、DAS或RAS克隆(a-d)感染的沙鼠进行攻击。该图显示了使用与共轭有抗CWP2 FITC的单克隆抗体(绿色)在沙鼠粪便中的免疫荧光分析的典型图像。
图14显示了由表达所有种类的VSP的转基因滋养体感染的沙鼠的血清和肠内容物能够在体外凝集不同的贾第鞭毛虫克隆。显示了使用WB9B10克隆感染的动物的血清(1b，3f和5f)或肠内容物(2b，4f和6f)；WB1267克隆感染的动物的血清(2b和1f)或肠内容物(3b和2f)；GS/M-H7克隆感染的动物的血清或肠内容物(5b和6b)；VSP9B10特异性Mab(1c和2c)、VSP1267特异性Mab(3c和4c)、VSPH7特异性Mab(5c和6c)、未感染动物的血清(1a，2a，3a，4a，5a和6a)、敲除DAS的滋养体感染的动物的血清(1d，2d，3d，4d，5d和6d)以及RAS感染的动物的血清(1e，2e，3e，4e，5e和6e)进行攻击的WB9B10(1-2)、WB1267(3-4)和GS/M H7克隆(5-6)的相差显微镜典型图像；
图15显示了在先前使用来自野生型和/或本发明转基因贾第鞭毛虫滋养 体的不同克隆群的纯化VSP免疫的沙鼠的粪便样品中，贾第鞭毛虫包囊的检测和定量。在一个月内，每天使用抗CWP2单克隆抗体监测免疫沙鼠的粪便，以检验包囊释放。使用WB9B10或WB1267滋养体的克隆群感染沙鼠。使用来自本发明转基因滋养体DAS、RAS(及其混合物)的纯化VSP进行免疫；动物先前接受纯化DAS(a)、RAS(b)VSP或其混合物(c)的免疫；这些动物得到保护而免于WB9B10或WB1267克隆的后续感染；对照动物(d)或用细胞内蛋白免疫的那些动物(e)没有得到对抗后续感染的保护。该图显示了5次独立试验的平均值。
图16显示了在感染和攻击期间沙鼠小肠形态的照片；上图显示了试验动物的小肠：(a)使用接种后15天表达所有种类的VSP的滋养体(DAS)初次感染的沙鼠小肠；与对照动物(b)相比，发现淋巴集结(Peyer patch)的大小增加(箭头)。(c)是对使用DAS滋养体的纯化VSP免疫的沙鼠进行攻击期间的小肠；下图显示了实验动物的小肠显微检测：(d)感染的沙鼠显示淋巴集结膨大以及粘膜和粘膜下层中的中度浸润性炎症。在肠腔中可见一些贾第鞭毛虫滋养体(星标；400×)；(e)未感染的对照/未免疫的沙鼠(400×)；(f)是显示组织学上正常的肠粘膜的免疫沙鼠(400×)；插图显示小肠大体形态(250×)。
具体实施方式
在本申请中，滋养体是指单细胞寄生虫(例如原生动物)在特定阶段的细胞。考虑到本申请的效果，应理解术语滋养体、寄生虫、寄生虫细胞或原生动物具有相同的含义并可互换。
在本申请中，本发明的转基因或修饰寄生虫、滋养体或原生动物可以是其转基因原生动物的切丁酶基因和/或RdRP基因被沉默的原生动物。在本申请中，这些原生动物也可替换为转基因、转染或修饰的滋养体、原生动物或寄生虫。在被沉默时，本发明的滋养体或原生动物切丁酶基因也可被称作切丁酶-AS或DAS。在被沉默时，本发明的滋养体或原生动物RdRP基因也可被称作RdRP-AS或RAS。在使用转基因滋养体或原生动物的混合物时，可将其称为切丁酶-AS+RdRP-AS或DAS+RAS。
在本申请中，表达所有种类的可变表面蛋白的滋养体或原生动物可以是抗原变异机制失活的任何原生动物寄生虫或病原体。
发现贾第鞭毛虫中的VSP表达调控包括包含RNA依赖性的RNA聚合酶、切丁酶和RNA干扰装置(RNA interference machinery)组件Argonaute的系统。在表面表达单个表面抗原(蛋白)的克隆有效地转录多个VSP编码基因，但在细胞表面仅积累编码待表达VSP的转录本。
检测对应于沉默VSP基因的反义RNA以及来自沉默蛋白silenciadas但不用于表达VSP的小RNA表明抗原变异调控中存在RNA干扰途径。明显地，切丁酶和RNA依赖性RNA聚合酶的沉默导致寄生虫个体中单种到多种VSP表达的变化。
进行核连缀分析以测定VSP表达是否受到转录或转录后水平的调控。随后，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)研究滋养体中是否存在编码VSP的正义和反义RNA，并研究参与高等真核生物中双链(dsRNA)合成和降解的酶(例如RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、切丁酶和Argonaute)的活性。表征包括克隆并表达这些基因，并分析由编码VSP的dsRNA产生的小RNA。此外，在沉默贾第鞭毛虫RNA干扰(RNAi)途径的组分后，评估不同VSP的表达。
此前从未描述过破坏抗原变异机制，从而产生在病原生物内表达所有种类的可变表面蛋白的细胞。在病原生物中表达表面蛋白的所有种类，从而产生可用作疫苗的寄生虫，或者纯化可变表面蛋白的所有种类以用于免疫预防由这些病原导致的疾病，都还不可能。
VSP在贾第鞭毛虫中的转录
使用从WB9B10克隆滋养体的细胞核分离的RNA，通过核连缀分析来分析VSP基因的转录(图1a)；所述克隆在其表面仅表达VSP9B10(GenBank登录号AAK97086)。所得结果表明大部分编码VSP的基因同时转录。与此不同，将从两种不同贾第鞭毛虫克隆(WB9B10和WB1267)提取的总RNA与作为对应于VSP基因保守性3′末端的探针使用的寡核苷酸一起温育时，只检测到分子量大小对应于在这些克隆表面上表达的VSP的一个转录本(图1b)。此外，还发现了疑似降解产物的极低分子量条带。使用VSP特异性探针，发现在不同贾第鞭毛虫克隆中仅积累一种VSP转录本(参见Nash，T.E.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B 352，1369-1375(1997)。这证明仅积累一种VSP转录本，但在寄 生虫细胞核中转录多于一种VSP。
贾第鞭毛虫中的转录后基因沉默(PTGS)：
PTGS的关键步骤是产生与沉默基因同源的dsRNA。通过设计用于特异性扩增正义或反义VSP产物的RT-PCR测试发现，在克隆并测序这些片段后，两条链的RNA均存在于滋生体中(图2)。为了评价针对VSP编码基因的正义和反义RNA的可能的同时转录，使用特异的正义和反义探针进行第二轮的核连缀实验(图1c)。在此分析中，不能检测到VSP-反义RNA，表明这些分子是转录后产生的。还分析了使用特异引物vsp9B10和vsp1267由WB9B10克隆PCR产生的产物(图1d)。对应于vsp9B10的条带存在于基因组DNA和正义的互补DNA中，但很少出现在反义cDNA中。与此不同，可以从基因组DNA扩增并且同样也在正义和反义cDNA中扩增出没有在WB9B10克隆表面表达的vsp1267。这些结果证明VSP被同时转录(进一步支持了核连缀实验的结果)，并且所表达的反义VSP转录本的丰度低，并且存在被转录但没有翻译的反义VSP RNA。
贾第鞭毛虫RNAi装置的组件：
由RdRP介导无引物地从异常mRNA产生dsRNA，以及通过短干扰RNA(siRNA)指导有引物/无引物地产生dsRNA，对于一些生物中RNAi触发是必需的。鉴定了RdRP的贾第鞭毛虫同源物。此RdRP基因编码155,257Da的碱性蛋白，该碱性蛋白与其他真核RdRP共享高同源性并与贾第鞭毛虫病毒16编码的一种蛋白明显不同，这表明了所鉴定的基因的原生动物性质。
通过RT-PCR和RNA印迹检验贾第鞭毛虫RdRP转录，并通过血凝素标记的表达(HA)确定其定位。贾第鞭毛虫RdRP可能与存在于内质网胞质侧的核糖体结合。另外，所述酶在滋养体中具有活性，这是因为其能够在同源VSP RNA的存在下，在体外形成高分子量RNA(图3)。RNAi的特征是通过dsRNA特异性切丁酶RNA酶将dsRNA降解成21-25核苷酸的siRNA。此前鉴定出贾第鞭毛虫切丁酶同源物，确定了其结构，并且证明了重组蛋白的体外切丁酶活性(Macrae，I.J.等，Science 311，195-198(2006)。
通过使用果蝇切丁酶-1序列检索贾第鞭毛虫基因组数据库中的同源基 因，鉴定出与切丁酶结构域具有高度同源性的多个克隆。通过PCR以及随后与基因组文库的比较，发现了两个独立的ORF，其包含存在于已知切丁酶的结构域：带有PIWI和PAZ结构域的Argonaute蛋白(gAgo，GenBank登录号AY142142)和双齿RNase III(g切丁酶，GenBank登录号AY142144)，其包含可能分别参与酶与RISC其他组件及RNA相互作用的PAZ结构域和亮氨酸拉链基序。
根据图3所示，切丁酶在整个贾第鞭毛虫生活周期中组成型表达，并具有胞质定位(图3)。为了评估贾第鞭毛虫切丁酶活性，进行了体外分析，其中将放射标记的dsRNA暴露于核后(post-nuclear)贾第鞭毛虫提取物。结果(图4a)证明，无论基因和标记的链(正义、反义或二者)，dsRNA都被加工成20-30个核苷酸的小RNA片段，与在高等真核生物中类似，ATP的存在有利于此加工(图4b)。由这些实验获得的小RNA能够被克隆成类似于具有5′-P和3′-OH末端的siRNA。这些siRNA的测序表明，其源自输入的VSP基因，并且具有22-25个核苷酸的长度(表1)。
表1：
结果显示，可鉴定出带有PIWI和PAZ结构域的单个贾第鞭毛虫Argonaute蛋白(贾第鞭毛虫AGO)。通过RNA印迹评估其表达，并通过表达标记有血凝素的蛋白测定其细胞定位。贾第鞭毛虫AGO定位于胞质。
VSP表达的调控：
在实验中，多个同源VSP转录本的出现可引导贾第鞭毛虫RdRP在发生多个VSP基因的转录后产生反义RNA。此外，切丁酶以及可能的AGO的存在和活性表明RNAi样的机制可参与贾第鞭毛虫中表面抗原变异体表达的调控。
通过将贾第鞭毛虫胞质提取物与体外产生的一种、两种或三种不同VSP转录本混合，来分析贾第鞭毛虫PTGS装置是否能够区分存在的不同VSPmRNA。将两种或更多的标记VSP mRNA与包含RNAi装置的滋养体提取物一起温育时，按照与切丁酶活性测试产物相同的模式产生了小VSP RNA(比较图4a和4c)。与此不同，无论何时温育单个转录本，都没有发生mRNA降解。此外，如果向放射标记的单个VSP mRNA添加无关基因cwp2(编码包囊壁蛋白2)或gdh(编码谷氨酸脱氢酶)，则没有检测到形成小RNA的降解(图4c)，说明沉默装置特异性地加工同源RNA。在使用来自不同贾第鞭 毛虫克隆(例如WBA6，WB1267或GSH7)的细胞提取物时获得了类似的结果：只有与其他同源VSP基因组合时，vsp9B10 RNA才被加工成小RNA，但在其为添加到反应中的唯一VSP时，则没有被加工(图5)。存在于滋养体提取物中的内源siRNA和各种正义和反义VSP RNA显然的确没有干扰沉默过程。由于用于这些实验的VSP mRNA是在体外合成的，沉默机制显然能够在没有任何可能的转录后RNA修饰的情况下区分同源mRNA。考虑到在贾第鞭毛虫中发现了正义和反义VSP转录本并且通过实验证明了切丁酶活性，本发明人检索了由VSP dsRNA降解产生的小RNA。
使用部分降解的vsp9B10 RNA探针在贾第鞭毛虫WB9B10和WB1267克隆中进行RNA印迹分析，检测到未表达的VSP(本申请中为VSP1267)的小RNA，但没有检测到表达于WB9B10克隆表面的VSP9B10的小RNA(图4d)。这些结果产生了单个VSP转录本如何绕过此沉默加工并且在寄生虫表面翻译并表达的问题。
为了证明不同VSP转录浓度是否对抗原变化产生影响，通过在诸如α-微管蛋白基因的强启动子的控制下克隆表达vsp9B10和vspH7(GenBank登录号AAA18202)二者或包含受vsp9B10反义区的构建体，来使VSP的体内表达失衡(Touz，M.C.，Gottig，N.，Nash，T.E.以及Lujan，H.D.J.Biol.Chem.277，50557-50563(2002)和Elmendorf，H.G.等，Mol.Biochem.Parasitol.113，157-169(2001))。VSPH7显示出可变表达，即便在选择药物的压力下也是如此，VSP9B10也随时间而减少(图6)。此外，VSP9B10被敲减时，其在寄生虫表面上表达的降低速度快于对照(图7)。这些结果表明VSP的启动子区对VSP表达影响极小或没有影响，因此，PTGS机制必然参与了贾第鞭毛虫的抗原变异。
使不同VSP转录本的浓度失衡的其他体外试验证明，mRNA浓度与给定VSP绕开沉默装置并被翻译相关(图8)。这些结果表明，贾第鞭毛虫提取物被程序化以保持特定VSP转录本不被修饰，但当不同VSP的浓度较高时，能够启动RNA降解(给定转录本的加工可依赖于每种VSP的相对胞质浓度)。
贾第鞭毛虫RdRP、切丁酶和AGO的沉默：
由于贾第鞭毛虫具有多倍性并且存在两个细胞核，不可能在贾第鞭毛虫 内沉默特定基因，所以通过在滋养体中组成型表达贾第鞭毛虫切丁酶、RdRP和AGO的部分反义转录本以敲减它们的表达来进行直接试验，从而显示表征的RNAi组件在抗原变异期间的参与情况。根据使用特异单克隆抗体的免疫荧光分析(图10a和表2)、流式细胞术(图10b)和蛋白质印迹(图10c)的测定，发生RdRP(RdRP-AS)或切丁酶(切丁酶-AS)表达下降时(图9)，产生了在其表面表达多于一种VSP的滋养体。沉默贾第鞭毛虫AGO没有产生任何存活的克隆，表明此分子对寄生虫至关重要。本发明敲减了切丁酶或RdRP的滋养体如常地增殖并在培养物中形成包囊，并且在应用沉默或敲减方法时，对VSP的调控没有不良影响(表2)。由本文公开的教导可见，可将切丁酶和/或RdRP沉默或敲除以获得修饰原生动物，例如修饰的疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)原生动物，或显示抗原变异机制的任何其他原生动物，这些均在本发明的范围之内。
表2
敲减或沉默RdRP(RdRP-AS)和切丁酶(切丁酶-AS)的贾第鞭毛虫中vsp表达的定量分析
上表显示了使用特异的单克隆抗体(Mab)(对VSP9B10，使用Mab 9B10；对VSP1267，使用5C1；对VSPA6，使用6A7；对VSPS1，使用1B2；对VSPS2，使用7B8；对VSPS7，使用6F8)，通过免疫荧光分析测定，在培养5天后，由编码RdRP和切丁酶的贾第鞭毛虫基因的反义构建体(例如单独的空质粒(Mock))转染的WB9B10滋养体或未转染(None)的WB9B10滋养体中，表达特定VSP的贾第鞭毛虫滋养体百分数。山羊抗小鼠免疫球蛋白用作对照，且显 示没有反应。数据表示为3分独立试验的平均值±标准差，每份试验一式两份进行。结果显示，根据各百分数的加和，单个滋养体可表达很多不同的VSP。
由图10b可见，克隆显示了清楚的单VSP表达模式，而RdRP-AS和切丁酶-AS滋养体显示每个滋养体表达多于一种VSP。
由图10c所示，特异的抗VSP9B10单克隆抗体仅识别9B10克隆和修饰滋养体中的一个条带，而本发明的12F1单克隆抗体与修饰滋养体中的很多种蛋白反应，这表明当RNAi通路被破坏或沉默时，贾第鞭毛虫中可同时表达很多VSP。
总之，PTGS系统(至少包含RdRP和切丁酶)参与了蓝氏贾第鞭毛虫中表面抗原表达的调控。由于在实验和天然贾第鞭毛虫感染的宿主中的体液免疫反应与原始VSP的消除一致，提出了细胞和抗体在选择表型变异体中的功能作用及对感染过程的影响。由于寄生虫抵抗特异免疫反应的保护作用依赖于在免疫学上不同的表面蛋白之间的表达转换，宿主利用特异免疫反应预防感染的方式之一是通过产生对抗所有表面抗原决定簇的抗体。这些结果证明了，RNAi系统组件调控减损导致滋养体或原生动物中多于一种表面蛋白的表达，其中这些修饰原生动物构成了用于产生对抗重要的人或动物病原体或对抗具有抗原变异性的任何病原微生物(例如疟原虫或锥虫)的疫苗的基本工具。
很明显，通过表达表面蛋白的所有种类而修饰的任何原生动物均包含在本发明的范围之内，而与所使用的沉默方法无关。
同样，本发明的范围还包括原生动物中的任何RdRP和/切丁酶沉默方法。
为了测定表达所有种类的VSP的修饰贾第鞭毛虫滋养体是否能够作为疫苗使用，本发明人在实验性沙鼠贾第鞭毛虫病模型中进行了研究。首先，如实施例中所示，使用通过敲减贾第鞭毛虫切丁酶(DAS)或贾第鞭毛虫RdRP(RAS)表达而表达所有种类的VSP的WB分离物产生滋养体。此外，通过有限稀释受到所用抗给定VSP的Mab控制的WB和GS细胞分离物，获得了仅表达表面VSP的滋养体群。图11显示了切丁酶(图11a)或RdRP(图11b)被沉默的滋养体在其表面表达很多VSP，例如由直接免疫荧光分析可见显示了VSP9B10(绿色)和VSP1267(红色)的共定位(黄色)。由此可见，大多数滋养体在其表面表达多于一种VSP。通过使用针对不同VSP的一组单克隆抗体测定了在其表面上表达不同VSP的细胞的百分数(表3)。
表3
Mab WB9B10 DAS RAS DAS+RAS 对照 0 0 0 0 9B10 99 78 67 75 5C1 0 96 51 93 6E7 0.1 89 93 84 G10/4 0 0 0 0 9C9 0 0 0 0 Mab WB9B10 DAS RAS DAS+RAS 1B2 0 66 92 91 7B8 0 89 74 84 6F8 0 87 46 71 7G8 0 90 89 88 1B4 0 77 52 68
这些百分数证明细胞在其表面同时表达大量的VSP(>100％)。这些修饰滋养体如野生型细胞一样在体外生长并形成包囊，这表明这些酶的沉默不影响其他细胞进程。在培养物中，滋养体自发将一种VSP转换成另一种，因此，为了确保群体同一性，在克隆和选择24小时后，在培养物中仅保留在其表面表达特定VSP的细胞群。图11c显示可使用针对所有已知VSP共有的CRGKA胞质尾的本发明单克隆抗体标记(在透化后)非克隆培养的WB分离物的所有滋养体。根据使用DAPI复染的间接免疫荧光分析测定，可在图1d–f(分别为Mab 9B10，Mab 5C1，Mab 6E7)中观察到仅表达一种VSP(VSP9B10，VSP1267，VSPA6)的滋养体的克隆群。首先，使用这些贾第鞭毛虫群体感染SPF沙鼠。感染启动了口胃滋养体接种和包囊释放，清楚地证实了动物感染。通过使用CWP2特异性单克隆抗体(Mab 7D2)的免疫荧光分析评估并测定粪便样品中的贾第鞭毛虫包囊。此外，计数这些动物产生的每克粪便包囊量，从而测定每种修饰型和野生型细胞群的感染性和毒力。图12a显示所有群体都可以在健康沙鼠中形成感染。粪便样品中包囊开始出现的时 间和包囊量在所用不同滋养体之间略有不同。处死一些动物，并回收肠内容物以验证滋养体在小肠中的存在。受感染的动物在感染的第二周出现了腹泻现象，其中一些体重下降。为了防止出现某些带有少量滋养体的慢性感染动物的可能，使用甲硝唑处理半数动物以治愈任何不可检测的感染。
为了测定使用表达特定VSP(VSP9B10和VSP1267)的滋养体或表达VSP所有组成部分的滋养体进行的初次感染是否保护动物免受后续感染，在初次感染自愈后2个月，使用表达特定VSP(VSP9B10或VSP1267)的滋养体的克隆群接种相同的动物。图12b和图12c分别显示了先前被WB9B10或WB1267感染的动物中的包囊消除结果。图12d和图12e分别显示了先前被DAS或RAS滋养体感染的动物的结果。结果清楚地证明，(a)被表达单一一种VSP的滋养体感染的动物难以被表达相同VSP的细胞的二次感染，表明在对给定表面蛋白的初次感染期间产生了强免疫反应(图12a和图12b)，(b)被表达特定VSP的细胞感染的动物易于被表达不同VSP的滋养体再次感染，表明与对人感染的观察类似，愈后或药物治疗后常发生再次感染(图12b和图12c)。(c)与此不同，使用表达所有种类的VSP的滋养体群感染的动物得到保护而免于被仅在其表面表达一种VSP的克隆群的后续感染(图12d和图12e)。在初次感染后2、4、6和12个月进行相同的试验性攻击，获得了相同的结果(表4和表5)。
表4：使用WB9B10克隆滋养体进行攻击，以及感染沙鼠的百分数(括号中)
表5：使用WB1267克隆滋养体进行攻击，以及感染沙鼠的百分数(括号中)
使用抗贾第鞭毛虫CWP2的单克隆抗体对所选动物的粪便进行的免疫荧光分析清楚地显示了感染动物的包囊释放，而在受保护的那些动物中则没有包囊释放(图13)。观察可见，先前被WB9B10克隆感染的动物难以被相同克隆后续感染(在粪便中没有发现包囊)，但被表达VSP1267的滋养体感染(检测到大量的包囊)。先前被DAS或RAS滋养体感染的沙鼠受到保护，而免于WB9B10或WB1267克隆的后续感染(没有在粪便样品中发现包囊)。
为了检测初次感染中获得的包囊(释放的滋养体的未知VSP)是否能够感染这些动物，使用大量包囊接种先前被DAS、RAS和DAS+RAS群感染的沙鼠。表6的结果显示，与接种特定滋养体群的动物类似，与对照沙鼠相 比，这些动物难以被感染。总而言之，这些结果毫无疑义地显示了对所有VSP的免疫反应是预防产生新感染所必需的。
表6：包囊感染的攻击，以及感染沙鼠的百分数(括号中)
此外，在初次感染期间观察到的症状在攻击性感染期间消失。这些结果同样表明需要对抗所有VSP的免疫反应以预防新感染。
另一方面，从感染动物和对照动物获取血清和肠内容物，并与表达一种或几种VSP的滋养体一起在体外放置。未感染的动物的血清或肠内容物对寄生虫形态、存活性或运动性没有影响(图14)。与此不同，将表达单个VSP的滋养体克隆群与靶向所述蛋白的Mab或被所述滋养体克隆群感染的动物的血清或肠内容物一起温育时，出现整个群体的分离和凝集，表明存在针对所述表面蛋白的抗体。与被不同克隆感染的沙鼠的血清或肠内容物一起温育显示没有显著影响(图14)。克隆群接触到来自被沉默切丁酶或RdRP的细胞感染的沙鼠的血清或肠内容物时，出现强烈的滋养体凝集(图14)。这些结果表明，感染的沙鼠能够对存在于滋养体中的VSP产生强烈的免疫反应，并且可存在于细胞表面的其他抗原对于抗体的产生或者赋予对抗后续感染的保护都是无关的。
此外，体液对抗分离GS/M的滋养体(B群)。在这种情况下，被DAS和RAS滋养体感染的动物的血清和肠内容物显示了部分细胞凝集(30％至40％之间)，这表明这些群可能在其VSP共享一些共有表位。
另一方面，还获得了杂交瘤系，其产生针对于带有CRGKA氨基酸序列的VSP胞质尾的单克隆抗体。
用纯化的VSP免疫沙鼠
使用与存在于所有VSP的5个氨基酸的胞质尾反应的单克隆抗体，从修饰的DAS和RAS滋养体纯化VSP的所有种类(参见实施例)。过表达贾第鞭毛虫细胞内抗原GRP78/BiP，并进行免疫纯化，以作为对照。随后，通过3天内3个剂量的口胃给药，使用不含助剂的这些蛋白制剂免疫动物。在所有情况下，免疫都没有导致疾病症状，这表明单独的VSP对动物无毒。2个月后，使用表达特定VSP的寄生虫接种动物。通过计数粪便中的包囊监测动物感染，并且在一些情况下处死动物，以观察滋养体在小肠中的存在。所有种类的VSP的口服给药产生了强烈的免疫反应，其保护动物免于感染，在初次感染期间观察到类似的结果。此外，接种赋形剂(vehicle)或GPR78/BiP的对照动物迅速被克隆滋养体群感染(图15)。作为免疫原使用的单个纯化的VSP显示的结果与在上述感染试验中的观察相同。由VSP所有组成部分的制剂产生的保护持续至少1年(表7、8和9)。
表7：使用WB9B10克隆滋养体进行攻击，以及在使用纯化的VSP免疫后感染沙鼠的百分数(括号中)
表8：使用克隆WB1267滋养体进行攻击，以及在使用纯化的VSP免疫后感染沙鼠的百分数(括号中)
表9：包囊感染的攻击，以及感染沙鼠的百分数(括号中)
令人感兴趣地，必须指出，尽管贾第鞭毛虫感染有时显示没有炎症，但感染的沙鼠肠显示了淋巴集结尺寸增大，且肠上皮中浸润性嗜中性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞增加(图16)。在免疫的沙鼠中没有发现高位小肠的肉眼可见的变化和显微变化(图16)。
这些结果表明，初次感染和使用VSP制剂的免疫都能够赋予动物免疫保护，能够预防贾第鞭毛虫包囊或得自于感染者粪便样品的克隆的后续感染。
在所有情况下，N/A是指无法实施；d是指处死动物以检测肠寄生虫。
本发明的修饰原生动物和疫苗提高了任何哺乳动物对抗原生动物产生的感染的免疫力，其中所述原生动物具有用于克服宿主免疫反应的抗原变异机制。原生动物显然可以是具有所述机制的任何类型的原生动物，例如疟原虫、锥虫、巴贝西虫(Babesia)等。
野生型和修饰或沉默的原生动物都产生感染，其中在第15天具有包囊释放峰且在第30天自愈。
使用或未使用甲硝唑处理的动物对后续感染显示出类似的保护模式。
野生型和修饰(沉默)型滋养体产生的包囊对天然沙鼠都具有感染性。
被在其表面仅表达一种VSP的活贾第鞭毛虫感染的沙鼠受到保护而免于相同克隆的后续感染。
被在其表面仅表达一种VSP的活贾第鞭毛虫感染的沙鼠没有受到对抗随后不同克隆感染的保护。
被表达所有种类的VSP(例如通过沉默切丁酶和/或RdRP)的活贾第鞭毛虫滋养体感染的沙鼠受到对抗随后不同克隆群感染的保护。
被表达所有种类的VSP(例如通过沉默切丁酶和/或RdRP)的活贾第鞭毛虫滋养体感染的沙鼠受到保护而免于得自于人粪便样品的包囊的后续感染。
使用表达所有种类的VSP(例如通过沉默切丁酶和/或RdRP)的死贾第鞭毛虫滋养体免疫的沙鼠受到对抗随后不同克隆群感染的保护。
使用纯化的VSP免疫的沙鼠受到对抗随后不同克隆群感染的保护。
使用纯化的细胞内抗原免疫的沙鼠没有受到对抗后续感染的保护。
由表达所有种类的VSP的细胞的初次感染产生了保护动物免于后续感染的免疫反应(保护率在87％至100％之间)。
没有疫苗制剂显示对动物的毒性作用。
通过以下实施例更好地说明本发明，但不能将这些实施例解释为对本发明范围的限定。另一方面，应当清楚地理解，在阅读本说明书后，本领域技术人员可提出其他实施方式、修改和等效变体而不脱离本发明的精神和/或附属权利要求书的范围。
实施例
实施例1：寄生虫培养和克隆：在补充了成牛血清和牛胆汁的TYI-33培养基中培养贾第鞭毛虫滋养体(Lujan，H.D.，Mowatt，M.R.，Conrad，J.T.，Bowers，B.以及Nash，T.E.J.Biol.Chem.270，29307-29313(1995)。通过有限稀释和基于使用相应抗VSP单克隆抗体的免疫荧光分析的选择进行滋养体的连续克隆。按照此前的报道进行包囊化(Lujan，H.D.，Mowatt，M.R.，Conrad，J.T.，Bowers，B.以及Nash，T.E.I，J.Biol.Chem.270，29307-29313(1995)。使用蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的WB克隆株9B10、1267和A6，以及GS克隆株H7。
PCR：按照(Mowatt，M.R.L.，H.D.；Cotten，D.B.；Bowers，B.；；Yee， J.；Nash，T.E.；Stibbs，H.H.Mol Microbiol 15，955-63(1995)中的描述分离蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的总DNA。
a：正义引物S1(5′-CVT GTG CHR RST GCA A-3′)(SEQ ID No.113)，S2(5′-TGC ACS RSC TGC YAB CC-3′)(SEQ ID No.114)，S3(5′-TAG TGY DSY VMV TGY AA-3′)(SEQ ID No.115)和S4(5′-CGA TCA TGA CGG GCT TCT-3′)(SEQ ID No.116)。反义引物R1(5′-CCB ACG AGG CCY CCS ACG AC-3′)(SEQ ID No.117)和R2(5′-CGC CTT CCC KCK RCA KAY GA-3′)(SEQ ID No.118)。PCR条件为：94℃变性40秒，53℃杂交40秒和使用Taq高保真聚合酶(Invitrogen)72℃延伸90秒，共计35个循环。
RT-PCR：向1μg总RNA添加VSP正义引物(S1-S4)并在70℃加热5分钟。使用上文列出的所有可能的引物正义/反义组合，或者使用特异的vsp1267和vsp9B10引物(1267_F，5′-ATG TTG TTG ATA GCC TTC TAT C-3′)(SEQ ID No.119)；1267_R，5′-CTA CGC CTT CCC CCT GCA TAT G-3′(SEQ ID No.120)；9B10_F，5′-ATG TTT GGC AGT TTT GTT CTC-3′(SEQ ID No.121)；9B10_R，5′-TCA CGC CTT CCC TCT ACA TAT G-3′(SEQ ID No.122))扩增反转录反应样品(2微升)。通过电泳分析RT-PCR产物并通过Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。为了研究贾第鞭毛虫滋养体分化期间或沉默试验中不同基因的表达，使用以下特异的引物对进行RT-PCR：g切丁酶(645bp)：HL160，5′-TGG CGG CGT CGT ATC AGT TAT-3′(SEQ ID No.123)，HL161，5’-TCC CCG CAC GCA AGA AGA A-3’(SEQ ID No.124)；gAgo(912bp)：HL164，5’-ATT GCC CCC TAC GGT GTC-3’(SEQ ID No.125)，HL165，5’-CTC TGC CGG CCT TCC TAC-3’(SEQ ID No.126)，gRdRP(569bp)：HL187，5’-CAT GGG TTG CAG TTT CTT GAC GA-3’(SEQ ID No.127)，HL188，5’-AGC CCC TTA TCT GTT GCC TCC TTC-3’(SEQ ID No.128)；CWP1差异表达对照(533bp)：HL183，5’-TCG CCC TGG ATG TTT CGG ACA T-3’(SEQ ID No.129)，HL184，5’-AGG CGG GTGAGG CAG TA-3’(SEQ ID No.130)和GDH组成型表达(407pb)：HL185，5′-AGT GGG GCG GGT CTT TAC TCA-3(SEQ ID No.131)′，HL186，5′-TGT TCG CGC CCA TCT GGT AGT TCT-3′(SEQ ID No.132)。如下文所述，还分离、标记了这些反应的产物，并将其用作RNA印迹的探针。
Northern杂交：在1.2％琼脂糖-甲醛凝胶上分离总RNA(10-15μg)，转移到Hybond N+(GE)，并通过标准方法使用UV交联剂(UVP)固定。使用γ-[32P]-ATP(5′-末端标记系统，Promega)，由T4多核苷酸激酶对保守的C-末端片段(反义引物R2)进行放射性标记。通过随机引物法(Prime-A-Gene标记系统，Promega)均匀地标记grdrp和其他DNA片段。
核连缀分析：将细胞重悬在4℃的1ml冰冷裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.4，1.5mM MgCl2，0.14M NaCl和CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物)中；添加2.25μl的Nonidet P-40，并将悬浮液在冰上孵育15分钟。通过在2,000g离心1分钟回收细胞核，并在4℃的1ml冰冷细胞核清洗缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.4，140mM KCl，10mM MgCl2，20％(V/V)甘油和14mM β-巯基乙醇)中清洗两次。随后，将细胞核重悬在50μl标记缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.4，4℃)，140mM KCl，10mM MgCl2，20％(V/V)甘油和14mM β-巯基乙醇，ATP、GTP和CTP各1mM，10mM磷酸肌酸，100μg/ml磷酸肌酸激酶和0.1μM[32P]UTP，5000μCi/ml)中，并在37℃温育40分钟。使用狭缝印迹仪(BioRad)将RT-PCR产生的VSP产物和3μg克隆到p-GEM T-easy载体(Promega)的vsp9B10、vsp1267、vspH7和vspA6转移到Hybond N+。此外，在类似的条件下将体外转录反应产生的正义和反义转录本进行印迹。
小RNA的检测：按照此前的描述进行小RNA的检测(35.Hutvagner，G.，Mlynarova，L.以及Nap，J.P.Detailed，RNA 6，1445-1454(2000))。简言之，将15μg蓝氏贾第鞭毛虫总RNA在65℃的1×上样缓冲液中变性10分钟，并上样至15％聚丙烯酰胺/7M尿素的凝胶中。在电泳分离后，在100V，经45分钟，将0.5×Trisborate-EDTA缓冲液(pH 8)中的RNA电印迹到TBE 0.5×中的Hybond N+膜上，最后通过UV固定。使用克隆到p-GEM T-easy载体(Promega)的VSP基因9B10、1267和H7，通过T7或SP6 RNA聚合酶，在体外转录[32P]-标记的核糖核酸探针。通过在80mM NaHCO3和160mM Na2CO3存在下，在60℃温育1小时，部分水解标记的RNA。在25％甲酰胺，0.5NaCl，25mM EDTA，1×Denhardt氏溶液和150μg/ml变性鲑鱼精子DNA中杂交各水解的VSP转录本，并在42℃温育过夜。杂交后，将膜在2×SSC，0.5％SDS中清洗两次，每次30分钟，并在45℃的0.5×SSC，0.5％SDS中清洗一次，共15分钟。随后，按照相同的方式杂交每个反向水解的vsp转录本，并通过曝光于 -70℃的Kodak XAR膜或磷光成像仪(Amersham)检测膜信号。长度标准品来自商业来源(DecadeTM RNA标记，Ambion)。
核酸内切酶活性：通过将dsRNA分子与贾第鞭毛虫克隆WB9B10、WBA6或WB1267的胞质提取物一起温育分析切丁酶活性。将克隆到p-GEM T-easy载体(Promega)的vsp9B10、vsp1267、vspH7、cwp2和gdh基因在体外转录，以产生全长的正义[32P]-标记的RNA探针，将所述探针纯化并检测没有小RNA污染物。将纯化或混合的vsp转录本与贾第鞭毛虫提取物一起在37℃温育1小时。通过对等量的体外转录的正义和反义RNA(vsp1267、vsp9B10、cwp2和gdh)退火而产生dsRNA，所述正义和反义RNA带有或没有[32P]UTP标记。将这些dsRNA重悬在Tris-HCl(pH 7.5)/20mM NaCl中，在95℃加热1分钟，并经12小时冷却至室温。由1×107-1×108个细胞产生细胞裂解物，将其重悬在500μl缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，250mM蔗糖，且包含CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物)，进行超声处理，并在2,000g离心15分钟以分离未裂解的细胞和细胞核，随后与dsRNA一起在37℃温育1小时。随后，提取总RNA，电泳并按照对小RNA的上述说明进行转移。通过经Microcon-100滤器单元过滤进行低分子量RNA的选择。使用300mM NaCl/0.6ml异丙醇沉淀包含小RNA的滤液，上样到20％聚丙烯酰胺/7M尿素的凝胶上，并进行电泳。为了测定ATP对核酸内切酶活性的影响，通过将贾第鞭毛虫胞质提取物与2mM蔗糖/0.1U/μl己糖激酶(Sigma)一起在35℃温育30分钟，来耗尽ATP。随后，向存在或不含10mM磷酸肌酸和/或100μg/ml磷酸肌酸激酶的裂解物中添加[32P]UTP-标记的vsp1267 dsRNA，并在37℃处理1或3小时。使用Trizol提取总RNA，并且如上所述，使用上述Microcon-100过滤单元富集RNA样品的低分子量RNA。将样品电泳，并按照上文所述检测产物。将使用贾第鞭毛虫提取物加工的dsRNA产物通过凝胶纯化，连接、扩增、克隆并测序(Ngo，H.，Tschudi，C.，Gull，K.以及Ullu，E.Proc.Natl Acad.Sci.USA 95，14687-14692(1998)。
为了测定小RNA的性质，按照文献的描述(Elbashir，S.M.，Lendeckel，W.以及Tuschl，T.Genes Dev 15，188-200(2001)，使用碱性磷酸酶处理(以证明5’磷酸的存在)或在β-消除后进行高碘酸盐氧化(以确认3’羟基的存在)。
RdRP克隆、测序和活性：对于RT-PCR，使用从滋养体提取的总RNA，并使用oligo(dT)20作为引物进行cDNA合成。比对来自多种生物的已知RdRP 并结合贾第鞭毛虫中的密码子使用常识，从而设计适度简并引物：RdRP_F：(5′-TA(T/C)，GT(T/C)TTT AC(T/C)GAT GGC G(C/G)A GG)-3′)SEQ ID No.133和SEQ ID No.134；和RdRP_R：(5′-TCA CC(A/G)TCC AGG TC(G/A)CTG CC)-3′)SEQ ID No.135和SEQ ID No.136。将使用这些寡核苷酸形成的PCR产物电泳，凝胶纯化，由随机引物法进行放射性标记，并用于筛选报道的λgt22a中的蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库(Elbashir，S.M.，Lendeckel，W.以及Tuschl，T.Genes Dev 15，188-200(2001)。按照文献描述进行λZAP gDNA文库筛选(Elbashir，S.M.，Lendeckel，W.以及Tuschl，T.Genes Dev 15，188-200(2001)。将DNA片段克隆到pBlueScript SKII+，并进行自动测序。使用来自Invitrogen的商业试剂盒，以及引物5′-CTT GTG CAT AGT AAA CAA AG-3′SEQ ID No.137和5′-CAA ATG GTC GAT GCT GGG-3′SEQ ID No.138进行35′-RACE。对于gRdRP体外活性，使用抗HA-琼脂糖(Sigma)，通过亲和性从转染的滋养体纯化HA标记的RdRP。在存在或不含VSP特异性引物，且包含50mM Hepes pH 7.6，20mM醋酸铵，5mM MgCl2，0.1％Triton X-100，四种核糖核苷三磷酸各1mM(包含[α-32P]UTP)和1u/μl RNasin，并添加了按照上文所述通过体外转录制备的ssRNA底物(250μg/ml)的20μl反应混合物中，于35℃测试酶活性60分钟。通过琼脂糖凝胶电泳，随后转移并进行放射自显影来分析反应产物。
转染和免疫荧光分析：修饰PTubPac37质粒以引入整个gRdRP、g切丁酶、gAgo和VSPH7编码区，并且在对应时，在TAA终止密码子前引入流感血凝素表位(HA)(Touz，M.C.，Gottig，N.，Nash，T.E.以及Lujan，H.D.J.Biol.Chem.277，50557-50563(2002))。将gAgo编码区引入质粒pTubNterPac，其中将所述基因引入到血凝素编码区之后以避免HA标签可能干扰PIWI结构域。此质粒是pTubHAPac的修饰型，其中将原始的多克隆位点替换成一个新的多克隆位点(MCSnewSense：5′GAT TCC GGG CCC AGATCT ATC GAT ACG CGT ATG CAT TCG CGA GAT ATC TGC 3′SEQ ID No.139；MCSnewAntisense：5′GCG GCC GCA GAT ATC TCG CGA ATG CAT ACG CGTATC GAT AGA TCT GGG CCC G 3′SEQ ID No.140)。按照此前的描述(Yee，J.和Nash，T.E.Proc.Natl Acad.Sci.USA 92，5615-5619(1995)，通过电穿孔完成蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的转染。按照此前的描述，通过电穿孔完成蓝氏贾第鞭毛虫滋养 体的转染。将细胞在冰上孵育10分钟，在37℃的生长培养基中培养过夜，并选择具有嘌呤霉素抗性的细胞。按照文献的描述(Touz，M.C.，Gottig，N.，Nash，T.E.以及Lujan，H.D.J.Biol.Chem.277，50557-50563(2002)，在所述转染15天后，使用抗HA单克隆抗体(Sigma)对未包囊化的滋养体进行间接免疫荧光分析。如其他文献所述(Touz，M.C.，Gottig，N.，Nash，T.E.& Lujan，H.D.J.Biol.Chem.277，50557-50563(2002))，使用此前报道的抗VSP单克隆抗体检测固定滋养体上不同VSP的表达。类似地，使用本发明中产生的新型单克隆抗体。使用装配了氩/氦/氖激光和X100(数值孔径＝1.4)油浸物镜的Zeiss LSM5 Pascal激光扫描共焦显微镜(Zeiss Plan-Apochromat)收集共焦图像。采集与盖玻片(z截面)平行的0.3μm单个共焦截面。使用Zeiss电荷偶联设备相机获取图像，并使用LSM和Adobe Photoshop软件处理。对于gRdRP、g切丁酶和gAgo的功能分析，使用包含Eco RV位点的VSP9B10特异性正义引物和带有Nco I位点的反义引物，通过PCR扩增每个基因的ORF部分。将PCR产物纯化、限制性酶切并克隆到载体pTubHAPac。通过这种方式将基因反向插入到pTubHAPac中，得到此后用于表达抑制的反义构建体(Touz，M.C.，Gottig，N.，Nash，T.E.以及Lujan，H.D.J.Biol.Chem.277，50557-50563(2002)。通过染料终止剂循环测序确认序列。通过使用上述基因特异性引物对从转染滋养体提取的总RNA进行RT-PCR和qRT-PCR确认了基因的敲减，并与仅使用载体转染，或使用表达HA标记的各分子的相同载体转染的细胞对照进行比较。
实施例2：
产生针对VSP 5氨基酸以及针对单个VSP的单克隆抗体：使用200mg的(a)通过sMBS交联剂与KLH共轭的NH2-CRGKA-COOH肽的HPLC纯化制剂，或(b)合成的多抗原肽[NH2-CRGKA]8-[K]7-bAla-OH(二者均来自Biosynthesis，Inc.)，或在Sigma助剂系统(Sigma)中乳化的，源自WB分离物的培养滋养体的蛋白提取物，经皮下免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠。21天后，使用200mg的相同制剂经皮下强化免疫，并且在20天后，使用100mg抗原制剂经静脉内强化免疫。3天后，处死小鼠，并将脾细胞用于与NSO骨髓瘤细胞融合。通过使用原始肽的ELISA，或通过使用未包囊化和包囊化滋养体的间接免疫荧光筛选分泌抗体的杂交瘤(Jambhekar，A.D.等，RNA 13，625-642(2007)和Aggarwal， A.，Merritt，J.W.，Jr.以及Nash，T.E.Cysteinerich；Mol Biochem Parasitol 32，39-47(1989))。按照此前的报道(Mowatt，M.R.L.，H.D.；Cotten，D.B.；Bowers，B.；；Yee，J.；Nash，T.E.；Stibbs，H.H.Mol Microbiol 15，955-63(1995)，使用完整滋养体产生抗VSP的单克隆抗体。
DNA甲基化：通过使用苯酚和氯仿/异戊醇(24/1％v/v)提取从蓝氏贾第鞭毛虫克隆1267纯化DNA，与ARNase(Roche)一起温育以消除ARN污染物，并使用乙醇沉淀。通过高效液相色谱测定甲基脱氧核糖核苷的存在(45，46)。在Phenomenex Luna 5μm C18，4.6×150mm上进行脱氧核糖核苷的分离。基于浓度已知的标准脱氧核糖核苷的吸收来校准此方法。
实施例3：不同疫苗的制备和保护分析
1.寄生虫：在阿富汗，从被诊断为贾第鞭毛虫病的有症状患者分离蓝氏贾第鞭毛虫WC株(ATCC 30957)(Antigenic analysis of Giardia lamblia from Afghanistan，Puerto Rico，Ecuador，and Oregon.Smith PD，Gillin FD Kaushal NA和Nash TE.Infect.Immun.1982 May；36(2)：714-9)，从美国的有症状患者分离GS/M株(Antigenic analysis of Giardia lamblia from Afghanistan，Puerto Rico，Ecuador，and Oregon.Smith PD，Gillin FD Kaushal NA和Nash TE.Infect.Immun.1982May；36(2)：714-9)；在37℃，将源自WB株的克隆和转基因滋养体培养于带有螺盖的12ml硼硅酸盐玻璃瓶中补充了20％成牛血清(Invitrogen)、牛胆汁(Sigma)和抗生素/抗真菌溶液的TYI-S-33培养基内(Methods for cultivation of luminal parasitc protists of clinical importance.Clark CG，Diamond LS.Clin Microbiol Rev.2002 Jul；15(3)：329-41)。通过在厌氧箱(BD)中的96孔培养板(DeltaLabs)上进行有限稀释获得表达不同表面蛋白的贾第鞭毛虫克隆，并通过使用特异单克隆抗体的免疫荧光分析进行选择(A new method for cloning Giardia lamblia，with a discussion of the statistical considerations of limiting dilution.Baum KF，Berens RL，Jones RH，Marr JJ.J Parasitol.1988 Apr；74(2)：267-9)。将反应性克隆在培养基中扩增过夜，并在使用前验证其均一性(homogeneity)。在对照试验和感染中使用WB 1267(Mab 5C1)、9B10(Mab 9B10)、A6(Mab 6E7)和GS/M/H7(Mab G10/4)克隆(Nash，T.Surface antigen variability and variation in Giardia lamblia.Parasitol Today 8， 229-234(1992))。
产生表达所有种类的VSP的转基因滋养体：将编码贾第鞭毛虫RdRP和切丁酶的基因的互补序列克隆到pTubHA.pac质粒中(Sorting of encystation-specific cysteine protease to lysosome-like peripheral vacuoles in Giardia lamblia requires a conserved tyrosine-based motif.Touz MC，Lujan HD，Hayes SF，Nash TE.J Biol Chem.2003Feb 21；278(8)：6420-6.Epub 2002 Dec3.)。由于存在α-微管蛋白启动子和抗生素嘌呤霉素选择，这样可以在蓝氏贾第鞭毛虫中组成型且稳定地表达基因。使用Platinium HiFi Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，并使用包含NcoI和EcoRV限制性位点的寡核苷酸探针，通过PCR从WB/9B10克隆cDNA扩增编码切丁酶和RdRP酶的基因，随后克隆载体。引物为DAF：5′-AGT TGA AAC TAT CAT GGT TGC TCC CGA A-3′SEQ ID No.141，DAR：5′-CCA CCA TGG TTG AAC GCC GAA TCC AAC-3′SEQ ID No.142，RAF：5′-GCG ATA GGT TGC AGT TCC ATG ACG TTC TTG A-3′SEQ ID No.143和RAR：5′-CCA CCA TGG TCG CTA CCT TAG CAT CAT CC-3′SEQ ID No.144。通过使用限制性酶降解以及随后的测序验证构建体。通过上述qRT-PCR进行酶沉默的验证。
蓝氏贾第鞭毛虫的转染：基本如文献所述，通过电穿孔进行贾第鞭毛虫的转染(Transient transfection and expression of firefly luciferase in Giardia lamblia.Yee J，Nash TE.Proc Natl Acad Sci USA.1995 Jun 6；92(12)：5615-9)。简言之，将在12ml管中生长直至汇合的WB/9B10克隆滋养体培养物(约107个细胞)重悬在0.4cm平板中的0.3ml TYI-S-33完全培养基中。随后，加入10-15μg质粒至100μl的终体积。将混合物在冰上孵育10分钟。在BTX电穿孔仪中，以50V、1000μF和700Ω将细胞电穿孔。在冰上孵育10分钟后，将细胞转移到包含12ml完全培养基的管中，并在37℃的厌氧条件下温育过夜。次日，向培养基中补充嘌呤霉素，并将滋养体在37℃温育7-10天。为了获得克隆细胞系，在96孔板中进行有限稀释。
共焦免疫荧光和显微检查：通过在冰上冷却20分钟，使滋养体从管脱离。回收细胞并重悬在生长培养基中，涂布到载玻片，并在37℃的潮湿相机中温育1小时以使滋养体重新粘附。使用温培养基清洗制备物3次，并在温PBS中清洗2次。随后，通过使用1∶1丙酮/甲醇在-20℃固定30分钟，并在1× PBS/0.05％Tween 20、2.5％BSA中封闭30分钟，以使细胞变为可透的。首先，将细胞与稀释在1×PBS/0.05Tween 20、BAS 2.5％中的针对不同VSP的Mab一起在室温下温育1小时。靶向不同VSP的单克隆抗体为：mAb 9B10(抗VSP-9B10B)、mAb 5C1(抗-VSP 1267)、mAb 6E7(抗-VSPA6)、mAb 1B2(抗-VSP S1)、mAb 2D5(抗-VSP S2)、mAb 2E1(抗-VSP S3)、mAb 2G10(抗-VSP S4)、MAb 6F8(抗-VSP S5)、mAb 7A9(抗-VSP S6)、mAb 7B8(抗-VSP S7)、mAb 7C2(抗-VSP S8)、mAb 7C9(抗-VSP S9)、mAb 7C10(抗-VSP S10)、mAb 7D4(抗-VSP S11)、mAb 2D4(抗-VSP S12)、mAb 3B8(抗-VSP S13)、mAb 4A2(抗-VSP S14)、mAb 7F4(抗-VSP S15)、Mab 7H2(抗-VSP S16)。在与适合的单克隆抗体一起温育后，使用1×PBS/0.05Tween 20清洗载玻片两次，随后在封闭液中，与1/200稀释的FITC或TRITC标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白二抗一起温育1小时。细胞核用DAPI复染。通过装配氩/氦/氖激光和X100油浸物镜(数值孔径＝1,4)的激光扫描共焦显微镜LSM5 Zeiss Pascal(Zeiss Plan Apochromat)获得共焦图像。采集与盖玻片(z截面)平行的0.3微米共焦截面。使用Zeiss相机通过设备获取图像，并使用LSM和Adobe Photoshop软件处理。通过在一式三份的试验中计数500个细胞或通过流式细胞术来计算表达特定VSP的细胞的百分数。
产生抗5氨基酸VSP尾的单克隆抗体：按照上述实施例2中的描述进行抗5氨基酸VSP尾的单克隆抗体的生产。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹：按照文献报道，对滋养体蛋白提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Lujan，H.D.，Mowatt，M.R.，Conrad，J.T.，Bowers，B.以及Nash，T.E.Identification of a novel Giardia lamblia cyst wall protein with leucine-rich repeats.Implications for secretory granule formation and protein assembly into the cyst wall.J Biol Chem 270，29307-29313(1995)。
动物：在动物中进行的所有实验程序均按照阿根廷科尔多瓦天主教大学动物管理和使用委员会提供的方案进行，并且所有动物均良好地耐受免疫方针(immunization guideline)。6周龄的无病原(SPF)雄性近亲繁殖沙鼠标本(长爪沙鼠，Meriones unguiculatus)得自于阿根廷科尔多瓦天主教大学实验动物中心，并在12小时光照/12小时黑暗循环下，分别圈养在调节空气(18-22℃， 湿度40-50％)的生物危害笼架(Techniplast)中。给予高压灭菌食物和补充了滤器灭菌的维生素溶液混合物的无菌水，供其任意取食。在本试验中，仅使用在本发明人处出生的动物，以确保这些动物从未被贾第鞭毛虫寄生虫或任何其他相关物感染。根据阿根廷动物管理委员会和国际动物照料规定(international animal attention rules)的规章和准则，所有动物均在SPF实验室条件下饲养。在感染前，使用从滋养体和包囊提取的总蛋白制剂，通过ELISA检测沙鼠是否为抗蓝氏贾第鞭毛虫或贾第鞭毛虫蛋白的血清抗体阴性。在感染后，在攻击前10天，对一些对照组的沙鼠，使用20mg甲硝唑口服处理3天以排除任何可能存在的低水平肠贾第鞭毛虫。
通过甲硝唑处理以消除原生动物寄生虫：为了开始处理，将动物置于带有过滤空气的灭菌笼中；在高压灭菌器中将水和食物灭菌。制备100mg/ml的甲硝唑工作溶液。对这些动物口服给予500μl此溶液，每天给药一次，连续3天。在随后4天，动物没有接受抗生素。使用500μl甲硝唑工作溶液持续处理2天。通过在400ml高压灭菌饮用水中添加2ml甲硝唑进行补充处理，这是动物在整个处理中唯一能够饮用的水(动物摄取此稀释的甲硝唑溶液9天)。在整个处理期间每天收集粪便，并且每天使用单克隆抗体7D2(包囊壁抗-蛋白2)进行免疫荧光分析以测定包囊的存在(Identification of a novel Giardia lamblia cyst wall protein with leucin-rich repeats.Implications for secretory granule formation and protein assembly into the cyst wall.Lujan HD，Mowatt MR，Conrad JT，Bowers B，Nash TE.J Biol Chem.1995 Dec 8；270(49)：29307-13)。在处理期间，正常动物群经历酵母增多，并在处理结束后数天恢复到其正常状态。
3.感染：通过口胃接种重悬在0.5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)的2×105滋养体或包囊在沙鼠中诱导感染。一些对照动物通过相同的途径接受0.5mlPBS。使用从感染沙鼠收集的新鲜包囊以防止得自于感染患者的样品中产生的存活性和感染性的快速损失。从第0天到第30天每天从感染沙鼠收集粪便。通过光学显微镜或使用包囊(mAb 7D2)或滋养体特异性抗体(BIP；Mab 9C9)的免疫荧光分析来通过观察鉴定包囊或滋养体。
4.周期性地处死随机选择的沙鼠，分离小肠，纵向切开并在4℃的培养基中悬浮30分钟。收集上清液，并如文献所述，通过光学显微镜和荧光显微 镜或在培养基中放置达6天以检测贾第鞭毛虫滋养体(Gottstein，B.，Deplazes，P.以及Tanner，I.In vitro synthesized immunoglobulin A from nu/+and reconstituted nu/nu mice against a dominant surface antigen of Giardia lamblia.Parasitol Res 79，644-648(1993))。
通过在24小时的周期中，从单个圈养的动物收集粪便颗粒，对沙鼠排泄的贾第鞭毛虫包囊进行定量。将粪便样品称重，重悬在2ml PBS中，并通过3层轻薄棉布(cheesecloth)过滤。将滤液在冷冻离心机(Beckman)中以250g离心10分钟。将滤液在4℃的冷冻离心机(Beckman)中以250g离心10分钟。清洗3次后，将沉淀物悬浮在2ml PBS中；使用FITC标记的7D2 mAb对包囊染色，并在血球计中计数。如果没有在粪便中发现包囊或者在培养6天后没有检测到滋养体，则认为沙鼠没有被感染。
从切丁酶-AS和RDRP-AS转基因滋养体纯化VSP：使用本发明生成的针对保守VSP尾部5个氨基酸的Mab 12F1，通过免疫亲和纯化如上所述在这些转基因滋养体中表达的VSP所有种类。使用蛋白A-琼脂糖(Amersham)从通过腹腔内(IP)注射杂交瘤细胞培养物而产生的腹水中分离小鼠免疫球蛋白。将纯化的mAb连接到磁珠(Dynal)，并用于从包含质膜的滋养体微粒体级分纯化VSP。将纯化的VSP重悬在包含0.01％Tween 20的PBS中，定量并用于口服免疫沙鼠。使用特异的mAb，通过相同的方法纯化单个VSP。
贾第鞭毛虫GRP78/BiP的纯化：使用包含贾第鞭毛虫内质网伴侣蛋白BiP/GRP78全长的质粒pTubHA.pac转染从9B10 WB克隆分离的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体(Increased expression of the molecular chaperone BiP/GRP78 during differentiation of a primitive eukaryote.Lujan HD，Mowatt MR，Conrad JT，Nash TE.Biol Cell.1996；86(1)：11-8)，并且使用血凝素(HA-BIP)标记此表位的三个拷贝。使用缓冲液RIPA裂解转基因滋养体，并使用抗HA免疫纯化试剂盒(Sigma)分离BIP蛋白。
口服免疫：通过悬浮在无菌PBS/0.01％Tween 20中的200μg寄生虫蛋白的连续三次口服给药来免疫动物，在每次给药之间间隔3天。在使用BIP、膜制剂或纯化VSP作为免疫原时，给沙鼠施用相同量的蛋白。
血样品：在感染或免疫首日后收集血样品以如下所述检测循环抗体的存在。使用乙醚麻醉沙鼠，并从眼窝丛或通过心脏内穿刺术取血。通过将血样 品在800×g离心15分钟收集血清，并将其在-70℃贮存备用。使用二氧化碳气处死沙鼠。
5.肠内容物：如小鼠一样，收集感染、未感染或免疫沙鼠的小肠分泌物(Heyworth，M.F.Relative susceptibility of Giardia muris trophozoites to killing by mouse antibodies of different isotypes.J Parasitol 78，73-76(1992)。
总之，将沙鼠禁食一天但可接触饮水，随后处死。切除从十二指肠至盲肠的小肠，并使用注射器吸出其内容物并分离。在一些情况下，将肠内容物在4℃以5,000×g离心以分离细胞、剩余物和细菌。在一些试验中，使用3ml冷PBS清洗小肠腔5次，并如上所述进行离心。通过过滤将上清液灭菌，并在-70℃贮存备用。
凝集分析：在96孔平底板中进行分析。将约5×105滋养体与动物肠分泌物、血清或包含抗VSP的特异抗体(均热失活)的腹水在不含成牛血清的TYI-S-33培养基中的多个稀释物一起在4℃孵育1小时。将其混合并通过显微术分析滋养体的凝集。使用TRITC标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白证明了抗体与寄生虫表面结合。