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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710511718.0 (22)申请日 2017.06.29 (71)申请人 山东省口腔医院 （山东大学口腔医 院） 地址 250012 山东省济南市文化西路441 号 (72)发明人 吴训伟冷雪 (74)专利代理机构 长沙星耀专利事务所(普通 合伙) 43205 代理人 许伯严 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) A01K 67/027(2006.01) (54)发明名称 一种体内重建毛囊的方法 (57)摘要 本发明公开了一种体内重建毛囊的方法。
2、， 它 涉及美容整形技术领域。 它的步骤为： 首先细胞 分离， 将新鲜分离的细胞培养扩增， 并以细胞球 或细胞团块状培养， 移植前细胞准备， 可以直接 取新鲜分离的皮肤单细胞， 或培养扩增的表皮和 真皮细胞按比例混合， 或细胞球又或细胞团块， 将其重悬于培养液， 将免疫缺陷小鼠麻醉， 用针 头或取皮器在裸鼠皮肤上打洞， 将准备好的细胞 悬液用移液管枪头转移到打好的洞内， 转移好所 有细胞， 盖上硅胶膜并缝合好， 再铺一层凡士林 纱布， 包扎并及时观察处理， 3周后可见毛发生 长。 本发明操作简便， 创伤小， 毛囊形成效率高， 可注射细胞数目范围大， 适合注射团块细胞和数 量较多的细胞， 适合开。
3、发应用于临床或医美上治 疗脱发疾病。 权利要求书2页 说明书3页 CN 107164310 A 2017.09.15 CN 107164310 A 1.一种体内重建毛囊的方法， 其特征在于， 其步骤为： (1)细胞分离： 取出生1-3天的C57小鼠， 剪去四肢和尾巴， 用镊子把整块皮剥下， 浸泡在 含有2.5mg/ml解离酶的PBS 中4孵育过夜， 机械法将表皮细胞和真皮细胞分离； (2)细胞培养： 将上步新鲜分离的细胞按照以下方法培养扩增： 表皮细胞培养： 用含10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬 细胞， 接种到事先用包被基质处理过的细胞培养瓶(细胞数大约在。
4、300万-500万每T75细胞 培养瓶)中， 培养三天， 之后换成CNT07或其它表皮培养基培养， 每2天换液一次， 显微镜下观 察细胞， 待细胞长满时进行传代或后续研究， 表皮按1： 3传代； 真皮细胞培养： 10%胎牛血清的DMEM并带有FGF生长因子的真皮培养基重悬细胞， 接 种在100mm细胞培养皿， 每5天换一次液， 细胞长满后传代或直接进行第3步， 真皮按1： 3-10 倍传代； (3)细胞球培养： 取分离或培养好的真皮和表皮细胞按一定比例混合， 重悬在含10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM真皮培养基中， 接种到不能贴壁的培养皿(6 孔板)进行悬浮培养， 在。
5、37度培养箱孵育16-24小时， 形成细胞球状； (4)细胞团块培养： 取分离或培养好的真皮和表皮细胞按一定比例混合， 重悬在含10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM真皮培养基中， 接种到薄膜如硅胶膜上， 在37 度培养箱培养2小时形成细胞团块； (5)移植前细胞准备： 可以直接取步骤(1)中的新鲜分离的皮肤单细胞， 或步骤(2)中的 培养扩增的表皮和真皮细胞按一定比例混合的单细胞， 或步骤(3)中的细胞球， 又或步骤 (4)中的细胞团块， 将其重悬在5-10ul F12培养液， 细胞数可以控制在1000-100万/ul的浓 度进行移植； (6)在裸鼠皮肤上打洞： 将免疫。
6、缺陷小鼠(裸鼠)麻醉， 用21G针头或取皮器进行皮肤打 洞， 洞的大小可根据需要而定； (7)细胞移植： 将第5步准备好的细胞用移液管枪头转移到打好的洞内， 转移好所有细 胞， 盖上硅胶膜， 必要时可缝合皮肤与膜片， 然后铺一层凡士林纱布， 包扎小鼠； (8)观察处理： 及时观察小鼠， 7-10天去掉包扎， 3周后可见毛发生长。 2.根据权利要求1所述的一种体内重建毛囊的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)表皮细 胞分离的步骤为： 将C57乳鼠的表皮组织切成均匀的粘稠状， 置于含有0.025%胰酶的DPBS 中， 37水浴震荡消化20-30分钟， 100um过滤器过滤， 细胞悬液用含10%FB。
7、S的DMEM 中和， 低 速离心， 沉淀用F12培养基洗一次， 然后再用F12培养基重悬， 细胞计数。 3.根据权利要求1所述的一种体内重建毛囊的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)真皮细 胞分离的步骤为： 用手术刀将乳鼠真皮组织切成粘稠状， 用含2.5mg/ml一型胶原酶的DMEM 在37水浴中震荡消化25min， 然后加入DNase继续消化5min， 100um过滤器过滤， 细胞悬液 用含10%FBS的DMEM 中和， 离心， 沉淀用F12培养基洗一次， 然后再用F12培养基重悬， 细胞计 数。 4.根据权利要求1所述的一种体内重建毛囊的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中真皮 和表皮细。
8、胞的混合比例为真皮： 表皮=1-5： 1。 5.根据权利要求1所述的一种体内重建毛囊的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中真皮 和表皮细胞的混合比例为真皮： 表皮=1-5： 1。 权利要求书 1/2 页 2 CN 107164310 A 2 6.根据权利要求1所述的一种体内重建毛囊的方法， 其特征在于， 所述步骤(6)中洞的 大小在0.1-2mm之间， 洞的数量根据洞的大小决定， 洞与洞之间距离在0.5-1mm左右。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107164310 A 3 一种体内重建毛囊的方法 技术领域 0001 本发明涉及的是美容整形技术领域， 具体涉及一种体内重建毛囊的方法。 背。
9、景技术 0002 目前有三种常用重建毛囊方法： 小室法、 注射法和移植法， 这些方法都有各自的缺 陷， 实用价值不高。 比如小室法是将含有细胞的小室植入小鼠背部， 该方法花费的时间较 长， 且针对不同的伤口形态需要制作不同大小的小室， 在伤口愈合之前， 被试动物需要一直 带着这个沉重的小室， 不适用于临床大规模应用。 注射法是将毛囊混合细胞注射到小鼠皮 内或皮下， 该方法简便易操作， 但不适合注射团块细胞和数量较多的细胞， 而且重建的毛发 生长方向杂乱， 不易穿出皮肤， 再生毛发效率较低， 因此， 该方法将来也不能用于临床实践。 移植法是最近改良的一种新的移植方法能， 有效再生毛发， 但它跟小。
10、室法相似， 需要大片切 除宿主的皮肤(创伤大)， 移植操作比较复杂， 实际应用， 特别是开发临床治疗脱发的应用受 限。 基于此， 设计一种新型的体内重建毛囊的打洞法尤为必要。 发明内容 0003 针对现有技术上存在的不足， 本发明目的是在于提供一种体内重建毛囊的方法 (孔洞法)， 操作简便， 创伤小， 毛囊形成效率高， 适合注射团块细胞和数量较多的细胞， 易于 推广使用， 并且可开发应用于临床或美容领域来解决脱发问题。 0004 为了实现上述目的， 本发明是通过如下的技术方案来实现： 一种体内重建毛囊的 方法， 其步骤为： (1)细胞分离： 取出生1-3天的C57小鼠， 剪去四肢和尾巴， 用镊。
11、子把整块皮剥下， 浸泡在 含有2.5mg/ml解离酶的PBS 中4孵育过夜， 机械法将表皮细胞和真皮细胞分离。 0005 (2)细胞培养： 将上步新鲜分离的细胞按照以下方法培养扩增： 表皮细胞培养： 用含10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬 细胞， 接种到事先用包被基质处理过的细胞培养瓶(细胞数大约在300万-500万每T75细胞 培养瓶)中， 培养三天， 之后换成CNT07或其它表皮培养基培养， 每2天换液一次， 显微镜下观 察细胞， 待细胞长满时进行传代或后续研究， 表皮按1： 3传代。 0006 真皮细胞培养： 10%胎牛血清的DMEM并带有FGF生长因。
12、子的真皮培养基重悬细 胞， 接种在100mm细胞培养皿， 每5天换一次液， 细胞长满后传代或直接进行第3步， 真皮按1： 3-10倍传代。 0007 (3)细胞球培养： 取分离或培养好的真皮和表皮细胞按一定比例混合， 重悬在含 10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM真皮培养基中， 接种到不能贴壁的培养 皿(6孔板)进行悬浮培养， 在37度培养箱孵育16-24小时， 形成细胞球状。 0008 (4)细胞团块培养： 取分离或培养好的真皮和表皮细胞按一定比例混合， 重悬在含 10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM真皮培养基中， 接种到薄膜如硅胶膜 上， 在。
13、37度培养箱培养2小时形成细胞团块。 说明书 1/3 页 4 CN 107164310 A 4 0009 (5)移植前细胞准备： 可以直接取步骤(1)中的新鲜分离的皮肤单细胞， 或步骤(2) 中的培养扩增的表皮和真皮细胞按一定比例混合的单细胞， 或步骤(3)中的细胞球， 又或步 骤(4)中的细胞团块， 将其重悬在5-10ul F12培养液， 细胞数可以控制在1000-100万/ul的 浓度进行移植。 0010 (6)在裸鼠皮肤上打洞： 将免疫缺陷小鼠(裸鼠)麻醉， 用21G针头或取皮器进行皮 肤打洞， 洞的大小可根据需要而定。 0011 (7)细胞移植： 将第5步准备好的细胞用移液管枪头转移到。
14、打好的洞内， 转移好所 有细胞， 盖上硅胶膜， 必要时可缝合皮肤与膜片， 然后铺一层凡士林纱布， 包扎小鼠。 0012 (8)观察处理： 及时观察小鼠， 7-10天去掉包扎， 3周后可见毛发生长。 0013 作为优选， 所述步骤(1)表皮细胞分离的步骤为： 将C57乳鼠的表皮组织切成均匀 的粘稠状， 置于含有0.025%胰酶的DPBS中， 37水浴震荡消化20-30分钟， 100um过滤器过 滤， 细胞悬液用含10%FBS的DMEM 中和， 低速离心， 沉淀用F12培养基洗一次， 然后再用F12培 养基重悬， 细胞计数。 0014 真皮细胞分离的步骤为： 用手术刀将乳鼠真皮组织切成粘稠状， 用。
15、含2.5mg/ml一 型胶原酶的DMEM 在37水浴中震荡消化25min， 然后加入DNase继续消化5min， 100um过滤 器过滤， 细胞悬液用含10%FBS的DMEM 中和， 离心， 沉淀用F12培养基洗一次， 然后再用F12培 养基重悬， 细胞计数。 0015 作为优选， 所述步骤(3)中真皮和表皮细胞的混合比例为真皮： 表皮=1-5： 1。 0016 作为优选， 所述步骤(4)中真皮和表皮细胞的混合比例为真皮： 表皮=1-5： 1。 0017 作为优选， 所述步骤(6)中洞的大小在0.1-2mm之间， 洞的数量根据洞的大小决定， 洞与洞之间距离在0.5-1mm左右。 0018 本发。
16、明的有益效果： (1)操作简单方便； (2)创伤小， 洞可大可小， 灵活性好； (3)毛囊形成效率高； (4)可以注射的细胞数目范围大； (5)可以注射单细胞， 也可用细胞团块； (6)可以形成正常的皮肤结构； (7)符合美容要求， 实际应用前景广。 具体实施方式 0019 为使本发明实现的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结合 具体实施方式， 进一步阐述本发明。 0020 本具体实施方式采用以下技术方案： 一种体内重建毛囊的方法， 其步骤为： (1)细胞分离： 取出生1-3天的C57小鼠， 剪去四肢和尾巴， 用镊子把整块皮剥下， 浸泡在 含有2.5mg/ml解离酶的P。
17、BS 中4孵育过夜， 机械法将表皮细胞和真皮细胞分离。 0021 表皮细胞分离的步骤为： 将C57乳鼠的表皮组织切成均匀的粘稠状， 置于含有 0.025%胰酶的DPBS中， 37水浴震荡消化20-30分钟， 100um过滤器过滤， 细胞悬液用含10% FBS的DMEM 中和， 低速离心， 沉淀用F12培养基洗一次， 然后再用F12培养基重悬， 细胞计数。 说明书 2/3 页 5 CN 107164310 A 5 0022 真皮细胞分离的步骤为： 用手术刀将乳鼠真皮组织切成粘稠状， 用含2.5mg/ml 一型胶原酶的DMEM 在37水浴中震荡消化25min， 然后加入DNase继续消化5min，。
18、 100um过 滤器过滤， 细胞悬液用含10%FBS的DMEM 中和， 离心， 沉淀用F12培养基洗一次， 然后再用F12 培养基重悬， 细胞计数。 0023 (2)细胞培养： 上步新鲜分离的细胞可以直接进行第五步细胞的移植前准备， 也可 按照以下方法培养扩增： 表皮细胞培养： 用含10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬 细胞， 接种到事先用包被基质处理过的细胞培养瓶(细胞数大约在300万-500万每T75细胞 培养瓶)中， 培养三天， 之后换成CNT07或其它表皮培养基培养， 每2天换液一次， 显微镜下观 察细胞， 待细胞长满时进行传代或后续研究， 表皮按1：。
19、 3传代。 0024 真皮细胞培养： 10%胎牛血清的DMEM并带有FGF生长因子的真皮培养基重悬细 胞， 接种在100mm细胞培养皿， 每5天换一次液， 细胞长满后传代或直接进行第3步， 真皮按1： 3-10倍传代。 0025 (3)细胞球培养： 取分离或培养好的真皮和表皮细胞按一定比例混合(真皮： 表皮= 1-5： 1)， 重悬在含10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM真皮培养基中， 接种 到不能贴壁的培养皿(6孔板)进行悬浮培养， 在37度培养箱孵育16-24小时， 形成细胞球状。 0026 (4)细胞团块培养： 取分离或培养好的真皮和表皮细胞按一定比例混合(真皮：。
20、 表 皮=1-5： 1)， 重悬在含10mM Rock蛋白激酶抑制剂的含10%胎牛血清的DMEM真皮培养基中， 接 种到薄膜如硅胶膜上， 在37度培养箱孵育2小时形成细胞团块。 0027 (5)移植前细胞准备： 可以直接取步骤(1)中的新鲜分离的皮肤单细胞， 或步骤(2) 中的培养扩增的表皮和真皮细胞按一定比例混合的单细胞， 或步骤(3)中的细胞球， 又或步 骤(4)中的细胞团块， 将其重悬在5-10ul F12培养液， 细胞数可以控制在1000-100万/ul的 浓度进行移植。 0028 (6)在裸鼠皮肤上打洞： 将免疫缺陷小鼠(裸鼠)麻醉， 用21G针头或取皮器进行皮 肤打洞， 洞的大小在。
21、0.1-2mm之间， 洞的数量根据洞的大小决定， 洞与洞之间距离在0.5-1mm 左右。 0029 (7)细胞移植： 将第5步准备好的细胞用移液管枪头转移到打好的洞内， 转移好所 有细胞， 盖上硅胶膜， 必要时可缝合皮肤与膜片， 然后铺一层凡士林纱布， 包扎小鼠。 0030 (8)观察处理： 及时观察小鼠， 7-10天去掉包扎， 3周后可见毛发生长。 0031 本具体实施方式通过先在皮肤上打洞， 然后再把单细胞或细胞团块用移液管或注 射器打到洞内来达到重建毛囊的目的， 该方法简称孔洞法， 相比传统的小室法、 注射法和移 植法， 不仅操作简便， 创伤小， 而且可以注射的细胞数目范围大， 可以形成正常的皮肤结构， 毛囊形成效率高， 符合现代美容要求， 适合开发应用于临床上或医美上治疗脱发疾病， 具有 广阔的应用前景。 0032 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。 说明书 3/3 页 6 CN 107164310 A 6 。