一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710410112.8 (22)申请日 2017.06.03 (83)生物保藏信息 CGMCC No.13454 2016.12.15 (71)申请人 农业部环境保护科研监测所 地址 300191 天津市南开区复康路31号 (72)发明人 陈昢圳任天志郑向群 (74)专利代理机构 北京誉加知识产权代理有限 公司 11476 代理人 鲁云博 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/38(2006.01)。

2、 (54)发明名称 一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用 (57)摘要 本发明属于生物环保技术领域， 具体涉及一 种新的生活污水高效脱氮菌及其应用。 所述脱氮 菌分类命名为假单胞菌Pseudomonassp.， 为新 种， 于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为： CGMCCNo.13454。 本发明新型高效脱氮菌可直接 应用于农村生活污水治理中， 具有较好的脱氮效 果。 通过投加该菌， 可有效提高对农村生活污水 中氮的去除效率。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 107177530 A 2017.09.19 CN 1071。

3、77530 A 1.一种生活污水高效脱氮菌， 该菌分类命名为： 假单胞菌Pseudomonas sp.， 为新种， 于 2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为： CGMCC No.13454。 2.根据权利要求1所述的生活污水高效脱氮菌， 其特征在于， 所述生活污水高效脱氮菌 菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。 3.根据权利要求1所述的生活污水高效脱氮菌， 其特征在于， 所述生活污水高效脱氮菌 菌株具有以下表型特征： 在3037下， 琼脂培养基上培养2472h后， 菌落白色， 半透明， 圆形， 表现光滑， 边缘整齐； 菌体短杆。

4、状， 0.40.8 m2.0 m， 单个或成对排列， 革兰氏阴 性； 其生长的温度为1542， NaCl浓度为04， pH为611。 4.根据权利要求1所述的生活污水高效脱氮菌， 其特征在于， 所述生活污水高效脱氮菌 菌株与序列相似的模式菌株进行DAN-DNA杂交， 同源性低于40。 5.根据权利要求4所述的生活污水高效脱氮菌， 其特征在于， 所述序列相似的模式菌株 为： Pseudomonas alcaliphila AL15-21T、 Pseudomonas toyotomiensis HT-3T和 Pseudomonas chengduensis MBRT。 6.根据权利要求1所述的生活。

5、污水高效脱氮菌， 其特征在于， 所述生活污水高效脱氮菌 具有硝化反硝化功能。 7.根据权利要求1所述的生活污水高效脱氮菌， 其特征在于， 所述生活污水高效脱氮菌 去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于500mg/L。 8.根据权利要求7所述的生活污水高效脱氮菌， 其特征在于， 所述生活污水高效脱氮菌 去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于100mg/L。 9.权利要求18中任一项所述的脱氮菌在生活污水净化中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述污水为农村生活污水。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107177530 A 2 一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用 技术领域 0001 本发。

6、明属于生物环保技术领域， 具体涉及一种新的生活污水高效脱氮菌及其应 用。 背景技术 0002 中国目前有行政村60多万个， 村庄人口有7.6亿， 其中96村庄缺乏污水处理系 统。 农村污水基数大， 但受农村经济发展水平和生产、 生活方式等发展水平影响， 不同地区 农村的污水排放特征差别很大。 目前城镇污水处理厂采用的技术和运行模式不适合用于农 村分散型污水的处理。 随着国家对农村开发力度加大， 诸如农家乐、 村办企业和养殖企业等 不断增多， 农村污水类型不断增加， 污水中含盐量、 氮磷等含量不断升高， 加之化肥和农药 的使用， 这增加了污水治理难度。 污水无序排放造成地表水、 地下水的污染， 。

7、水库、 池塘和河 道等水体变黑， 富营养化严重， 恶臭污染大气， 严重影响居住环境和身心健康。 加之， 农村地 区经济较为落后， 高耗能、 较高费用的技术很难推广应用。 当前， 必需寻找一种成本较低、 无 二次污染、 应用范围广和适应性强的技术， 且适合在中国农村地区推广应用。 微生物脱氮法 与物理、 化学法相比较,以它高效率、 低成本、 无二次污染等不可比拟的优点已被人们所认 可。 本发明新型高效脱氮菌可直接应用于农村生活污水治理中， 具有较好的脱氮效果。 通过 投加该菌， 可有效提高对农村生活污水中氮的去除效率。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用。 。

8、所述生活污水高效 脱氮菌是从天津生活污水中分离筛选得到的， 该菌可以应用在污水处理中， 特别是农村生 活污水处理中。 0004 本发明提供的生活污水高效脱氮菌， 该菌分类命名为： 假单胞菌 Pseudomonas sp.， 为新种， 于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC； 地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号)， 保藏编号为： CGMCC No.13454。 0005 优选地， 所述生活污水高效脱氮菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1 所示， 其 长度为1498bp。 0006 优选地， 所述生活污水高效脱氮菌菌株具有以下。

9、表型特征： 在3037下， 琼脂培 养基上培养2472h后， 菌落白色， 半透明， 圆形， 表现光滑， 边缘整齐； 菌体短杆状， 0.4 0.8 m2.0 m， 单个或成对排列， 革兰氏阴性； 其生长的温度为1542， NaCl浓度为0 4， pH为611。 0007 优选地， 所述生活污水高效脱氮菌菌株与序列相似的模式菌株进行 DAN-DNA杂 交， 同源性低于40。 0008 具体地， 所述序列相似的模式菌株为： Pseudomonas alcaliphila AL15-21T、 Pseudomonas toyotomiensis HT-3T和Pseudomonas chengduensi。

10、s MBRT。 0009 优选地， 所述生活污水高效脱氮菌具有硝化反硝化功能。 说明书 1/4 页 3 CN 107177530 A 3 0010 所述生活污水高效脱氮菌菌株经鉴定为假单胞菌属新种， 故分类命名为： 假单胞 菌Pseudomonas sp.。 0011 优选地， 所述生活污水高效脱氮菌去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于 500mg/L。 0012 更优选地， 所述生活污水高效脱氮菌去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于 100mg/ L。 此时， 脱氮率可达到95以上。 0013 本发明提供上述脱氮菌在生活污水净化中的应用。 0014 特别地， 所述污水为农村生活污水。 0015 本发明的。

11、生活污水高效脱氮菌为筛选自农村生活污水中的土著微生物， 将其用于 含盐量高的农村生活污水中， 其经济效益可观， 将会大大节约污水处理成本， 也不需要考虑 菌种的安全性， 适合在我国聚集地较为分散的农村地区使用。 本发明生活污水高效脱氮菌 具有良好的脱氮效果， 通过投加该菌， 可有效提高土著微生物对农村生活污水中氮的去除 效率。 本发明新型高效脱氮菌可直接应用于农村生活污水治理中， 具有较好的脱氮效果。 通 过投加该菌， 可有效提高对农村生活污水中氮的去除效率。 0016 保藏说明 0017 菌种名称： 生活污水高效脱氮菌 0018 分类命名： 假单胞菌Pseudomonas sp. 0019 。

12、菌株编号： 68 0020 保藏机构： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0021 保藏机构简称： CGMCC 0022 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号 0023 保藏日期： 2016年12月15日 0024 保藏中心登记入册编号： CGMCC No.13454 附图说明 0025 图1为本发明生活污水高效脱氮菌菌株菌体形态电镜照片。 0026 图2为本发明生活污水高效脱氮菌菌株菌落形态照片。 0027 图3为本发明生活污水高效脱氮菌菌株与相关种的16S rDNA序列发育树。 0028 图4为本发明生活污水高效脱氮菌菌株脱氮效果。 具体实施方式 0029 实施例1本发明生活污。

13、水高效脱氮菌菌株的分离鉴定： 0030 (1)培养基： 0031 硝化脱氮培养基： 硫酸铵0.48g， 琥珀酸4.71g， 微量元素溶液50mL， 溶解后用蒸 馏水定容至1L， pH控制在7.07.2。 (固体培养基， 加入2琼脂) 0032 所述微量元素溶液： K2HPO43H2O 6.5g， MgSO47H2O 2.5g， NaCl 2.5g， FeSO4 7H2O 0.05g， MnSO4H2O 0.04g， 溶解后用蒸馏水定容至1L； 0033 反硝化脱氮培养基： 好氧反硝化培养基： KNO3 0.36g， Na2HPO47H2O 7.9g， KH2PO4 1.5g， MgSO47H2。

14、O 0.1g， 琥珀酸钠2.81g， 微量元素溶液2mL， 溶解后用蒸馏水定容 至1L， pH7.07.5。 微量元素溶液： EDTA 50.0g， ZnSO4 2.2g， CaCl2 5.5g， MnCl24H2O 说明书 2/4 页 4 CN 107177530 A 4 5.06g， FeSO47H2O 5.0g， CuSO45H2O 1.57g， CoCl26H2O 1.61g， 溶解后用蒸馏水定容 至1L， pH7.0。 0034 (2)硝化菌株的分离筛选 0035 用无菌移液管取10mL天津生活污水， 置于容量为250mL的三角瓶(其中含有100mL 无菌脱氮培养基)中， 摇床富集培。

15、养， 培养条件为30， 转速 160rpm， 每一代培养三天。 采用 二苯胺试剂检测氨氧化菌的存在。 0036 采用极限稀释的方法将含有硝酸菌的培养液进行平板涂布， 37恒温培养箱中培 养48h后， 选取单一菌落进行多次平板分区划线。 在显微镜下观察无杂菌时， 菌株纯化结束。 0037 将纯化好的10的菌株接种于100mL新鲜液体硝化培养基中， 30、 120rpm摇床 培养48h后， 测定氨氮去除率， 选取氨氮去除率高于85的菌株作为选到的硝化脱氮菌。 0038 (3)反硝化菌株的筛选 0039 将10的接种量接种于100mL新鲜液体反硝化培养基中， 30、 120rpm 摇床培养 48h后。

16、， 测定硝酸盐氮去除率， 选取去除率高于90的菌株作为选到的反硝化脱氮菌。 0040 图1为本发明生活污水高效脱氮菌菌株菌体形态电镜照片。 图2为本发明生活污水 高效脱氮菌菌株菌落形态照片。 由图1和图2可见， 所述菌株具有以下表型特征： 在3037 下， 琼脂培养基上培养2472h后， 菌落白色， 半透明， 圆形， 表现光滑， 边缘整齐； 菌体短杆 状， 0.40.8 m2.0 m， 单个或成对排列， 革兰氏阴性； 其生长的温度为1542， NaCl浓 度为04， pH 为611。 0041 (4)16S rDNA序列分析与系统发育分析 0042 通过16S rDNA的PCR扩增与测序， 得。

17、到16S rDNA基因序列长度为 1498bp(参见SEQ ID NO:1)。 提交Genbank进行比对， 发现本发明生活污水高效脱氮菌属于假单胞菌 (Pseudomonas sp.)。 采用MEGA 5.0软件， 邻位连接法显示该菌株与相关种的16S rDNA序列 发育树， 进行1000次的相似度重复计算， 图3中发育树节点只显示Bootstrap值大于50数 值(参见图3。 图3 为本发明菌株与相关种的16S rDNA序列发育树)。 0043 (5)微生物菌种DAN-DNA杂交 0044 本发明生活污水高效脱氮菌与序列相似的模式菌株进行DAN-DNA杂交， 同源性低 于40。 具体地， 。

18、本发明生活污水高效脱氮菌与Pseudomonas alcaliphila AL15-21T的杂 交同源性为35.4， 本发明生活污水高效脱氮菌与 Pseudomonas toyotomiensis HT-3T的 杂交同源性为33.3， 本发明生活污水高效脱氮菌与Pseudomonas chengduensis MBRT的 杂交同源性35.4。 0045 实施例2脱氮效果实验 0046 将本发明生活污水高效脱氮菌菌株接种于100mL不同氮含量的脱氮培养基中， 起 始氨氮浓度分别为50mg/L， 未接菌种的培养基为空白对照， 37， 转速为160rpm， 摇床培养 箱培养30h。 取培养液分别在1。

19、0000rpm下离心6分钟， 经过0.45 m的滤膜过滤， 测定培养液中 的氨氮(ammonia nitrogen)、 硝氮(nitrate nitrogen)、 亚硝酸盐氮(nitrite nitrogen)、 以及总氮(total nitrogen) 的含量。 具体测定结果见图4。 图4为本发明生活污水高效脱氮 菌菌株脱氮效果。 0047 由图4可以看出， 起始氨氮浓度为50mg/L,去除率可以达到100。 且亚硝酸氮累计 均较少， 说明本发明菌株具有较好的硝化反硝化功能。 起始氨氮浓度小于500mg/L的范围均 说明书 3/4 页 5 CN 107177530 A 5 可发挥脱氮功能， 。

20、且起始氨氮浓度小于100mg/L时， 效果最佳。 0048 实施例3农村生活污水降解实验 0049 将本发明生活污水高效脱氮菌菌液直接投加到格栅过滤后的的实际农村生活污 水中， 接种量为10体积。 培养温度为30， 搅拌速度为180rpm。 结果： 处理3天后， 水体中总 氮的去除率可达到80。 说明书 4/4 页 6 CN 107177530 A 6 SEQUENCE LISTING 农业部环境保护科研监测所 一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用 Y161366-OI 1 PatentIn version 3.5 1 1498 DNA 假单胞菌 （Pseudomonas sp. ） 1 aga。

21、gtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60 ggatgagagg agcttgctcc ttgatttatc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct 120 gcctagtggt gggggataac gttccgaaag gaacgctaat accgcatacg tcctacggga 180 gaaagcgggg gatcttcgga cctcgcgcca ttagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt 240 ggtgaggtaa aggctcacca ag。

22、gcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca 300 cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360 atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg gattgtaaag 420 cactttaagt tgggaggaag ggtattcacc taatacgtga gtattttgac gttaccgaca 480 gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa 。

23、tacgaagggt gcaagcgtta 540 atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcgt taagttggat gtgaaagccc 600 cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tggcgagcta gagtacggta gagggtggtg 660 gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg 720 accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattaga。

24、t 780 accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tggaatcctt gagattttag 840 tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 900 aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960 aagaacctta cctggccttg acatgctgag aactttccag agatggattg gtgccttcgg 1020 gaactcagac ac。

25、aggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gtcaccagca cgttatggtg ggcactctaa 1140 ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1200 acggccaggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt 1260 ggagctaatc ccataaaacc gatcgta。

26、gtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320 agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg 1380 tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag aagtagctag tctaaccttc 1440 ggggggacgg ttaccacgga gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtaacc 1498 序列表 1/1 页 7 CN 107177530 A 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 107177530 A 8 图3 图4 说明书附图 2/2 页 9 CN 107177530 A 9 。