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1、(10)申请公布号 CN 102168152 A (43)申请公布日 2011.08.31 CN 102168152 A *CN102168152A* (21)申请号 201110126274.1 (22)申请日 2011.05.17 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 首都医科大学附属北京佑安医院 地址 100069 北京市丰台区右安门外大街西 头条 8 号 (72)发明人 刘志英 李岚 张彤 魏飞力 焦艳梅 石英 陈德喜 吴昊 (74)专利代理机构 北京北新智诚知识产权代理 有限公司 11100。
2、 代理人 景志 (54) 发明名称 单管多引物小型集合 HIV 核酸检测试剂盒 (57) 摘要 本 发 明 建 立 单 管 多 引 物 小 型 集 合 （mini-pool， MP） 艾滋病病毒 （HIV） RNA反转录-聚 合酶链反应 （RT-PCR） 和巢式 PCR 结合的 HIV 核酸 检测技术 （NAT） ， 并将其应用于男男同性恋 （MSM） 及其他高危人群窗口期的检测。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 CN 102168157 A1/1 页 2 1. 一一种单管多引。
3、物小型集合 HIV 核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒组成如 下 ： 试剂盒组成成分 包装量 （50 人份） 一管式病毒 RNA 提取试剂 病毒 RNA 裂解液 50mL 一步法 RNA PCR Kit (AMV) AMVReverse Transcriptase XL (5 U/l) 50 l RNase Free ddH2O 1 ml 2 支 RNase Inhibitor (40 U/l) 50 l AMV-Optimized Ta q (5 U/l) 50 l 10 One Step RNA PCR Buffer 250 l dNTP Mixture( 各 10 mM) 250。
4、 l MgCl 2 (25 mM) 500 l 引物组合 SEQ ID No.1 至 8（各 20M） 50l。 2. 一种单管多引物小型集合 HIV 核酸检测引物组， 其特征在于， 所述引物组包括三个 引物对， 引物对一的上下游序列分别如SEQ ID No.1和2所示 ； 引物对二的上下游序列分别 如SEQ ID No.3和4所示 ； 引物对三的上下游序列分别如SEQ ID No.5和6所示 ； 引物对四 的上下游序列分别如 SEQ ID No.7 和 8 所示。 3. 权利要求 2 所述的引物组在制备检测小型集合 HIV 核酸试剂盒中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102168152 。
5、A CN 102168157 A1/5 页 3 单管多引物小型集合 HIV 核酸检测试剂盒 0001 技术领域 0002 本发明涉及一种检测试剂盒， 具体地说是一种单管多引物小型集合 HIV 核酸检测 试剂盒。 背景技术 0003 HIV 感染后抗体出现之前的急性感染者， 血液中病毒载量很高， 且未意识到其感染 状态， 传播 HIV 的危险性远远高于慢性感染者， 因此早期发现这些感染者具有非常重要的 公共卫生意义。目前我国艾滋病疫情正在从高危人群向一般人群扩散， 性传播成为艾滋病 传播主要途径。 男男同性恋 （MSM） 是HIV感染的高危人群， 及早发现其中的感染者进行干预 可以达到事半功倍的。
6、效果。对于这些人群的早期发现主要依靠检测病毒抗原和核酸检测。 近年开发出了针对献血人群 HIV 感染筛查的核酸检测技术 （nucleic acid amplification technology， NAT） ， 采用小型集合 （mini-pool， MP） 样本检测和核酸定量检测技术相结合的 方法， 将数量不等的待检样本混合成一份样品进行检测， 如阴性就放行， 如阳性就将混合样 本逐一进行单份检测， 以确定是哪一份标本阳性， 采用这种方法可以显著降低大样本量 HIV 感染筛查的成本。目前该方法已在欧美一些发达国家应用于血浆样本的筛查， 但是相对于 发展中国家， 成本依然较高， 需要特殊仪器，。
7、 使其推广应用受到限制。因此， 需要开发价廉、 易于操作、 敏感和特异的检测方法。本文报告了一种根据我国主要流行的 HIV 病毒株设计 多套引物， 结合小型集合和 RT-PCR、 巢式 PCR 等技术方法建立的用于 HIV 感染筛查的 NAT， 以及该方法在 MSM 中的检测结果。 0004 HIV 早期诊断主要依靠抗原检测和核酸检测。已经上市并广泛应用的 HIV 核酸定 量检测方法主要有 3 种， 分别是西门子公司的分支 DNA 杂交 （bDNA） 、 罗氏公司 （Roche） 的 RT-PCR和生物梅里埃公司的NucliSens EasyQ HIV-1检测技术。 近几年定量检测技术逐渐 开。
8、始用于 HIV 感染的诊断。但是， 对每一份标本分别检测费用昂贵， 病毒载量检测一般只作 为判断患者病情和 HAART 疗效的指标。一些研究者采用多个样本集合结合定量核酸检测方 法的 NAT 用于 HIV 感染急性期诊断。潘品良等建立了基于 COBAS Amplicor 的 RT-PCR 检测 “窗口期” HIV 感染者的方法， 可达到 50 人份作为一个检测集合， 但是该方法与普通 PCR 相 比成本较高， 且需要特定的仪器设备， 不宜普及推广。且过多的标本混合， 也增加漏检的可 能， 美国 FDA 批准的 Gen-Probe 公司使用每个集合 16 或 8 人份筛查方法， Roche 公司。
9、采用 每个集合 6 人份的筛查技术。小样本集合可能更加灵敏、 也符合成本效益原则。 发明内容 0005 本发明的目的在于提出一种多引物小型集合 HIV 核酸检测试剂盒。 0006 本发明的再一目的在于提出用于检测小型集合 HIV 核酸的引物组。 0007 为 了 实 现 上 述 目 的， 本 发 明 的 发 明 思 路 为 ： 建 立 单 管 多 引 物 小 型 集 合 说 明 书 CN 102168152 A CN 102168157 A2/5 页 4 （mini-pool， MP） 艾滋病病毒 （HIV） RNA 反转录 - 聚合酶链反应 （RT-PCR） 和巢式 PCR 结合的 HIV 。
10、核酸检测技术 （NAT） ， 并将其应用于男男同性恋 （MSM） 及其他高危人群窗口期的检测。 方法 将 10 份待测标本混合组成一个集合， 高速离心富集病毒， 提取病毒 RNA ； 设计覆盖我 国主要 HIV 流行株的 4 对特异性引物， 采用单管多引物一步法 RT-PCR、 巢式 PCR 扩增， 用梯 度稀释的方法确定该方法的灵敏度， 盲法验证该方法的特异性。 0008 本发明的具体技术方案为 ： 一种单管多引物小型集合 HIV 核酸检测试剂盒， 所述试剂盒组成如下 ： 试剂盒组成 成分 包装量 （50 人份） 一管式病毒 RNA 提取试剂 病毒 RNA 裂解液 50mL 一步法 RNA 。
11、PCR Kit (AMV) AMVReverse Transcriptase XL (5 U/l) 50 l RNase Free ddH2O 1 ml 2 支 RNase Inhibitor (40 U/l) 50 l AMV-Optimized Ta q (5 U/l) 50 l 10 One Step RNA PCR Buffer 250 l dNTP Mixture( 各 10 mM) 250 l MgCl 2 (25 mM) 500 l 引物组合 SEQ ID No.1 至 8（各 20M） 50l。 0009 一种单管多引物小型集合 HIV 核酸检测引物组， 所述引物组包括三个引物。
12、对 ； 引 物对一的上下游序列分别如 SEQ ID No.1 和 2 所示 ； 引物对二的上下游序列分别如 SEQ ID No.3 和 4 所示 ； 引物对三的上下游序列分别如 SEQ ID No.5 和 6 所示 ； 引物对四的上下游 序列分别如 SEQ ID No.7 和 8 所示。 0010 上述的引物组在制备检测小型集合 HIV 核酸试剂盒中的应用。 0011 本发明的有益效果 ： 由于 HIV 感染急性期阶段具有高浓度病毒血症， 传播效率最高， 56 92新的感染 是由处在这个时期的感染者传播。及时发现处于 “窗口期” 的急性感染者， 尤其发现 MSM 的 HIV 感染者， 进行行为。
13、干预可减少性途径传播 ； 阻止其献血， 降低血液传播 HIV 危险。在 HIV 感染早期及时进行抗病毒治疗能够有效降低病毒载量的调定点水平， 减缓病程的进展， 显 著改善患者的预后。因此， 对于急性期感染者管理成为预防控制艾滋病重要策略之一。而 对 HIV 早期感染进行有效诊断是对 HIV 感染者进行干预的基础。 附图说明 0012 图 1 为集合 RT-PCR+ 巢式 PCR 产物在结果电泳图。泳道 2 7 是稀释后不同浓度 进行灵敏度检测试验图。箭头指示分别为扩增的 env 区和 gag 区特异性条带。1 ： 阴性血浆 对照 ； 2 ： 3.2 拷贝 /ml ； 3 ： 32 拷贝 /ml。
14、 ； 4 ： 162 拷贝 /ml; 5 ： 325 拷贝 /ml ； 6 ： 1625 拷贝 /ml ； 7 ： 3250 拷贝 /ml。 0013 图 2 为 3 份 HIV 阳性标本和 97 份阴性标本混合后检验结果 （图 2-1 左盲法试验 1。 1 ： 阴性血浆对照 ； 2 4 ： 三份待检集合 （10 份 / 集合） ， 泳道 3 中含有 HIV 阳性标本 ； 5 ： 阳 说 明 书 CN 102168152 A CN 102168157 A3/5 页 5 性对照， M ： DL2000 分子量标准。图 2-2 中盲法试验 2。1 ： 阴性血浆对照， 2 4 ： 三份待检 集合 （。
15、10 份 / 集合） ， 泳道 2 中含有 HIV 阳性标本 ； 5 ： 阳性对照， M ： DL2000 分子量标准。图 2-3 右盲法试验 3。1 ： 阴性血浆对照， 2 5 ： 四份待检集合 （10 份 / 集合） ， 泳道 3 中含有 HIV 阳性标本 ； 6 ： 阳性对照， M ： DL2000 分子量标准。 ） 。 具体实施方式 0014 1资料来源 ： 用于建立方法的标本 ： 30 份来源于 MSM 感染者队列的 HIV 抗体阳 性和已知感染 HIV 亚型和病毒载量的样本 （CRF01-AE 15 例、 B 亚型 10 例 、 CRF07-BC 4 例 ； CRF15-01B 1。
16、 例， 亚型鉴定相关文章已经另文发表 5,6） 、 3 份已经过商用核酸检测方法 （Easy Q 和 bDNA） 确诊为窗口期病人标本和 97 份正常人 HIV 阴性样本均来自北京佑安医 院 -80库存的血浆 ； 1005 份待检测样本来自北京佑安医院采集的 MSM 队列及少量其他高 危人群 HIV 抗体阴性或者不确定的血浆， 高危人群均为男性， 年龄 18-56 岁。 0015 2实验试剂和引物设计 一管式病毒 RNAout 提取试剂盒购自北京天恩泽基因科 技有限公司， 一步法 RT-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司。利用 Oligo 6.0 引物设计软件， 设计 针对我国境内流行亚型。
17、 （B 亚型、 BC 重组株和 AE 重组株） 代表株的保守区引物， 扩增条带分 别位于 HIV-1 HXB2 的 nt5783-nt6228 和 nt1235-nt2113 对应位置。鉴于 HIV 高度变异， 设 计含有简并碱基引物。并且针对两个不同区域设计两套引物， 只要有一套引物扩增得到阳 性结果， 即判断为阳性， 只有两套引物区都出现变异时， 才易出现假阴性， 减少不同亚型毒 株由于遗传差异致引物结合区存在突变影响检测结果的可能。引物由上海生工公司合成。 引物位置和序列见表 1。 0016 表 1 引物序列表 引物名称及位置引物序列 （5 -3 ）基因位置 目的片段 （5783 580。
18、4*）TTGGGTGTCAACATAGCAGAATAGGvpr T1RS（6228 6210）CTCTCATTGCCACTGTCTTCTGvpu446bp T1 FS（5958 5978）GCTTAGGCATCT(TC)CTATGGCAGGAtat T1 RS（6221 6203）TGCCACTGTCTTCTGCTCTTTCvpu264bp T2FS（1235 1256）CACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTgag T2RS（2012 1992）CTAGGGGCCCTGCAATTT(TC)TGGCTgag778bp T2 FS（1635 1655）CATTCTGGACATAA(GA。
19、)ACAAGG(GA)CCgag T2 RS（1756 1737）GGACCAACAAGGTTTCTGTCATCgag122bp * 引物核苷酸位置为参照序列 HIV HXB2 对应位置 3方法 3.1病毒 RNA 的提取 既往报道 NAT 中， 用采用 6 至 50 人份标本作为一个集合， 然后 离心富集病毒。 同一管富集标本份数增多， 需要降低每份标本用量， 可能导致阳性标本中病 毒过度稀释， 含有低拷贝病毒的标本漏诊。 每个集合病例数过少， 会增加工作量， 增加成本。 考虑到灵敏性和成本效益等因素， 美国 FDA 认可 Gen-Probe 公司 Chiron Procleix Assay。
20、 使用每个集合16或8人份和Roche 公司COBAS TaqScreen MPX Test每个集合6人份的筛 查技术。本研究结合以往文献， 为防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检， 方便实验操作， 每人 份取 150l 血浆， 将 10 人份血浆混合， 放入 1.5ml 无 RNA 酶的离心管 ； 4条件下， 24000g 离心 1 小时， 富集病毒颗粒。操作方法严格按照一管式 RNAout 提取试剂盒说明书进行操 作， 实验前一个小时用 RNASE 抑制剂对操作台进行清洁。 说 明 书 CN 102168152 A CN 102168157 A4/5 页 6 0017 3.2 单管多引物 RT-。
21、PCR 扩增及巢式 PCR 扩增 RT-PCR 按照 TaKaRa 一步法 RT-PCR 试剂盒说明书操作， 将两对外侧引物 （T 1 FS、 T 1 RS、 T 2 FS、 T 2 RS） 同时加入 PCR 反应系统中， 引物终浓度为 0.4 mol/L， RNA 模板 10 l， 反应体系为 25l ； 反应条件为 50， 30 分钟 （反转录） ； 94， 2 分钟 ； 94， 30 秒 ； 52， 30 秒 ； 72， 1.5 分钟 ； 30 个循环 （PCR 扩增） ； 最后 72延伸 5 分钟。第二轮 PCR 反 应 ： 引物组合为 T 1 FS、 T 1 RS ； T 2 FS、。
22、 T 2 RS， 反应终浓度为 0.4 mol/L， 模板 （第 一轮RT-PCR产物模板1 l） ， 反应体系为30 l。 反应条件为94， 3 分钟 ； 94， 30 秒 ； 52， 30 秒 ； 72， 30 秒 ； 最后 72延伸 5 分钟。 0018 3.3 结果判断标准 PCR 产物进行 3% 琼脂糖凝胶电泳， 两个目标条带区均未出现阳性条带， 判断为阴性 ； 如 果两个目标区任意出现一条带阳性或两条带区均出现阳性， 就判断为阳性， 则将该集合中 10份标本中每一份单独进行RT-PCR和巢式PCR扩增， 寻找出阳性标本。 对其用商用核酸检 测方法进行验证， 并随访 HIV 抗体检测。
23、以确诊。 0019 3.4 灵敏度实验 将一份含有 HIV CRF01-AE 亚型、 病毒载量为 3250 拷贝 /ml 的血浆做 2 倍稀释， 得到 1625 拷贝 /ml 血浆， 再将 1625 拷贝 /ml 血浆做 5 倍稀释得到 325 拷贝 /ml 血浆样本， 将后 者再做倍比稀释得到 162 拷贝 /ml 血浆样本， 直至 32 个拷贝 /ml、 3.2 拷贝 /ml。分别将上 述不同病毒载量梯度的血浆标本与 9 份已知的 HIV RNA 阴性标本混合成一个组合， 按照病 毒富集的方法提取病毒 RNA， 进行 RT-PCR 扩增和巢式 PCR 扩增。同时设正常人血浆作为阴 性对照。。
24、 0020 3.5 对 3 份窗口期感染标本的单盲实验 将 3 份 HIV RNA 阳性、 抗体阴性的标本和 97 份 HIV 阴性标本交由不清楚标本来源的技 术人员检测验证。每组 10 份血浆进行混合， 组成 10 个集合 ； 已知 HIV RNA 和抗体双阳的血 浆和已知来自正常人HIV阴性血浆分别作为阳性和阴性对照， 提取RNA。 进行RT-PCR扩增。 盲性组合中的阳性结果再拆分为 10 个单份标本进行 RT-PCR 检测。 0021 3.6 对 HIV-1 抗体阳性和阴性的 MSM 患者的检测 对 30 例 HIV 抗体阳性的已经 明确感染 HIV-1 亚型的 MSM 人群的血浆样本。
25、进行单样本 RT-PCR 检测， 以验证引物的扩增性 能 ； 用集合法对 1005 例 HIV-1 抗体阴性 MSM 人群的血浆扩增， 检测有无窗口期感染者。 0022 结果 1集合 RT-PCR 及巢式 PCR 的 NAT 的建立 可以成功扩增出了针对对应目标区的特异 性 HIV 目的片段， 条带清晰， 易于判断。见图 1。 0023 2灵敏度测定结果 阴性对照、 3.2 拷贝 /ml 和 32 拷贝 /ml 均未扩增出任何条 带， 而含 162 拷贝 /ml 的血浆样本只扩增出位于目标 1 区的 264bp 片段， 而 325 拷贝 /ml 组 合以上的血浆样本都扩增出了两条特异性的 HI。
26、V 条带， 分别是位于位于目标 1 区的 264bp 和目标 2 区的 122bp ； 实验灵敏度可以达到 162 拷贝 /ml 血浆， 即 PCR 反应的灵敏度可达到 25 拷贝 / 反应管， 引物 1 比引物 2 区更为敏感。见图 1。 0024 3 盲法验证结果 技术人员的检测结果与实际期望结果吻合， 三次盲法实验阳性 结果拆分完之后与预期一样， 三份窗口期 HIV 感染者标本全部检出为阳性。见图 2。 0025 4MSM 人群的检测结果 对不同亚型感染的 30 例 HIV 抗体阳性的男男同性恋人 说 明 书 CN 102168152 A CN 102168157 A5/5 页 7 群进。
27、行检测， 阳性率100， 均为两个目标条带阳性。 对1005份来自MSM及其他高危人群的 HIV抗体阴性标本检测， 发现一例窗口期感染者， 跟踪随访一周后， 抗体转阳。 对其中两例初 次抗体疑似阳性的患者做 RT-PCR 追踪检测， 发现是阴性结果， 之后再次随访， 抗体也排除， 该两例患者并未真正感染。 0026 结果讨论 我们初步将 10 人份高危人群作为一个检测的集合， 结果良好。根据已有的经验，“窗口 期” 感染者的病毒载量一般不低于 1104拷贝 /ml， 而本方法的灵敏度可以达到 162 拷贝 / ml， 而每个 PCR 反应管的灵敏度可以达到 HIV RNA 25 拷贝 /ml。。
28、 0027 PCR 检测易受污染从而导致试验的失败。因此利用 PCR 的方法来判断有无 HIV 的 感染， 传统上一般是需要分别设计针对 HIV 不同基因区域的特异性引物， 再分别用此特异 性引物进行 PCR 扩增， 但这样做工作量和成本都会成倍增加。本试验中将覆盖我国同性恋 中主要流行亚型 （B 亚型、 BC 重组株和 AE 重组株） 的 gag 区和 env 区前面比较保守的基因 区的两套引物放入一个 PCR 反应管内扩增， 成功扩增出了两段不同大小的特异性 PCR 产物 片段， 使得 PCR 结果的判断更为精准与特异， 且减轻试验的成本和工作量。同时每次试验均 设置阴性对照和阳性对照， 。
29、做到良好的质量控制。 0028 本研究对 30 例抗体阳性的来源于 MSM 的不同 HIV-1 亚型标本用该方法进行检测， 阳性率为 100。MSM 感染者的 HIV 基因型比较复杂， 目前已知的 MSM 人群的流行亚型主要 为 CRF01-AE、 B 亚型、 B 亚型和 CRF07-BC 等， 基本涵盖了我国境内主要的流行亚型。结果 证实本方法基本可以涵盖这些主要 HIV 流行株， 具有较高敏感性。 0029 本研究初步证实建立的小型集合 HIV 核酸检测技术具有较高敏感性， 可用于筛查 HIV 窗口期感染者。然而， 既往报道显示， 采用小型集合 PCR 筛查阴性仍可能漏检 HIV 阳性 标。
30、本， 导致 HIV 传播。此外， 本研究中采用的定性 PCR 检测方法， 主要用于对于高危人群的 筛查， 发现可能的感染者， 不能作为确诊手段， 对阳性标本需要按照 全国艾滋病检测技术 规范 （2009 年修订版） 要求进行定量核酸检测以及随访抗体检测等以明确诊断。本方法 作为研究或辅助诊断技术， 仍需要对更多的 HIV 抗体阳性人群标本检测， 以进一步的验证 其对各类高危人群筛查的应用推广价值。 说 明 书 CN 102168152 A CN 102168157 A1/2 页 8 序列表 刘志英 单管多引物小型集合 HIV 核酸检测试剂盒 8 PatentIn version 3.3 1 2。
31、5 DNA 人工序列 1 ttgggtgtca acatagcaga atagg 25 2 22 DNA 人工序列 2 ctctcattgc cactgtcttc tg 22 3 25 DNA 人工序列 3 gcttaggcat cttcctatgg cagga 25 4 22 序 列 表 CN 102168152 A CN 102168157 A2/2 页 9 DNA 人工序列 4 tgccactgtc ttctgctctt tc 22 5 25 DNA 人工序列 5 cacctagaac tttaaatgca tgggt 25 6 25 DNA 人工序列 6 ctaggggccc tgcaattttc tggct 25 7 26 DNA 人工序列 7 cattctggac ataagaacaa gggacc 26 8 23 DNA 人工序列 8 ggaccaacaa ggtttctgtc atc 23 序 列 表 CN 102168152 A CN 102168157 A1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102168152 A 。