技术领域
本发明涉及一种形成生物体内分子标记物，特别是鉴别标记物的方法。该方法还涉及将一种选择性标记物引入生物体的种质中，以及该标记物在例如植物育种过程中的用途。
背景技术
数十年来，DNA标记物技术正显著地提高着植物育种的效率，其是通过基于容易的试验标记物的选择而非通常困难的表型性状的选择而实现的。然而，这样的鉴别标记物的形成以及使用这些标记物的效率往往是费力并且费时的过程。首先，鉴别标记物的形成遵循由以下程序起始的过程
1)绘制目标性状之下的基因的遗传位置图谱，
2)识别侧翼标记物，
3)通过紧密连接的标记物的识别精细绘制基因图谱，
4)确定最相关标记物的DNA标记物序列，
5)确定用于绘制目标基因图谱的亲代系之间标记物基因座上的序列变异，
6)形成简单的PCR分析，
7)测定植物材料的遗传背景(种质)中的预测值，其中测定鉴别标记物。
这里所用的种质是用于描述遗传资源或者更确切地讲生物体的DNA，以及这些材料的收集物的术语。育种者使用术语种质以表明它们的遗传物质收集物，从种质中它们能够产生变种。
幸运的是，近来的进展已经显著加快了步骤1-4(Morgante和Salamini 2003 Curr.Opinion in Biotechnol 14：214-219；Varshney等，2005 TiPS 10：621-630)，特别是当处理单基因性状时。步骤5-6依赖于序列变种(SNP)周围独特DNA标记序列片段(stretch)的存在，所述序列变种用于开发鉴别分析。植物基因组被重复序列完全地分散，所述重复序列严重妨碍了形成鉴别标记物分析的可能性。尤其是对于具有较大基因组尺寸的农作物，低拷贝DNA片段的识别就好比是大海捞针了。最后，步骤7非常依赖于1)农作物的繁育方式，和2)农作物基因组中的遗传变异性水平。当发生功能性变异时，该变异会位于其他预成DNA多态性的单倍体上。由于性状会通过随机杂交的后代传递，因此会发生很多重组事件，所述重组事件将使得原始单倍体成为小连锁障碍。这将引起性状基因从大部分其原始单倍体的特定等位基因上分离。这样的结果是只有具有与性状基因极端紧密连结的DNA多态性或甚至性状基因多态性自身可用于转化成有用的DNA标记物。作为远系杂交种随机杂交种群的一个例子，重组和重组事件的高交换率产生了含有性状的区域，该区域是(理论上讲)非常小的。因此，与基因完美相关的DNA标记物是很难找到的。作为相反的一个例子，自交种种群中的连锁障碍趋于相对较大，因为自交增加了纯和性，从而限制了杂合体的数量，而杂合可以被重组所搅乱。然而，对于栽培种的遗传基础非常窄的农作物来讲，鉴别任何作为DNA标记物形成的起始点的DNA多态性都是困难的，尽管存在有相对较大的连锁障碍。
发明内容
本发明人旨在开发一种产生选择性标记物的方法，所述方法避免了上述问题。
在本申请中，所述方法在目标区域引入了独特的、人造的和选择性的标记物，而不是鉴别和开发自然产生的序列变种。本方法的原理是，基于潜在标记物基因座上的序列知识，可以设计独特的标记物，并且将它们引入含有目标性状的种系中。优选的这些标记物的适用性是，连续几代之后新引入的标记物与目标性状始终如一地共分离。本发明人已经发现了一种以这种方式在目标区域中引入标记物的方法，该标记物作为具有广泛预测价值的标记物是有用的。
本发明人发现一种基于鉴别和/或选择DNA片段并且将该片段转换成为选择性分子标记物，进而克服以上困难的策略，所述DNA片段与目标性状密切相关(即具有预定义的与目标特征共分离的一致性)，所述转换使用定向突变、定向核苷酸交换(TNE)方法完成。特别地，本发明人发现了一种用于确定需要作出何种改变并且设计所需标记物的方法，以使任何遗传变异性减少到最小，并且标记物的品质，即其相关性状的预测值在种质内是最佳的，但是相比标记物最初由其形成的种质，其在不同的种质中也是有用的。
因此，本发明涉及一种用于在种质中引入一种或多种(独特的并且选择性的)分子标记物的方法，所述标记物与目标性状紧密关联，并且所述标记物位于基因组中的一个位置，该位置虽然与所希望的性状紧密相关，但是不含有足够的标记物信息。在该DNA片段中，使用TNE产生人造的并且独特的多态性，其随后可以用作选择性的分子标记物。本发明还涉及TNE用于在生物体中产生独特并且选择性标记物的用途。
因此，在第一个方面，本发明涉及在生物体中形成鉴别标记物的方法，包括步骤：
-选择目标性状；
-确定与该性状相关的基因座；
-确定基因座的遗传图位；
-鉴别位于基因座遗传距离内的标记物；
-提供生物体种群，其中种群的各个成员含有该标记物；
-确定种群的各个成员的标记物的核苷酸序列；
-比对标记物的核苷酸序列；
-选择标记物序列中至少一个位置，其在种群的所有标记物中含有相同的核苷酸；
-设计可以与至少一个位置的两侧邻近的标记物序列杂交的寡核苷酸，并且其中该寡核苷酸在至少一个位置上还包含与标记物中至少一个位置上的核苷酸不同的核苷酸(标记物核苷酸)；
-使用寡核苷酸的定向核苷酸交换将标记物核苷酸引入生物体的DNA中，从而将独特的并且选择性的SNP引入与性状相关的标记物中。
因此，与目标性状有关的基因紧密连接的DNA片段(标记物)的鉴别，其中所述片段在种质中含有一实质上恒定的核苷酸组成(是低多态性的)的部分，DNA片段中核苷酸水平(A、C、T或G)的变异的确定(或种质内标记物中恒定核苷酸组成的区域的确定)，片段中在该位置含有低水平，优选地最低水平的变异的位置的选择，选择一个与存在于该位置上核苷酸(包括那里的任何变异)不同的核苷酸，即在该位置上具有最低存在，设计一个可以与所述位置两侧毗邻的序列杂交的寡核苷酸，以及通过定向核苷酸交换在生物体DNA中的所述位置上引入选择的核苷酸(标记物核苷酸)产生了独特的(在种质中)选择标记物。
定向核苷酸交换(TNE)是一个定向诱变过程，其中突变是通过寡核苷酸序列中设计的错配碱基引入的。TNE在植物、动物和酵母细胞中已经有过描述。第一个TNE报告使用了一种包含自补寡核苷酸的所谓的嵌合体，所述自补寡核苷酸设计用于嵌入到染色体靶位上。嵌合体包含一错配的核苷酸，其形成了在染色体靶位引入突变的模板。为了选择TNE事件，大多数研究试图在内源性基因中引入单个核苷酸变化，所述内源性基因可以导致除草剂抵性。使用嵌合体的最初的例子来自人细胞(参见综述Rice等，Nat.Biotech.19：321-326)。嵌合体的应用也已经在植物种类烟草、大米和玉米中获得成功(Beetham等，1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；Kochevenko等，2003 Plant Phys.132：174-184；Okuzaki等，2004 Plant Cell Rep.22：509-512)。同时，单链(SS)寡核苷酸的TNE的活性已经得到测试。人们已经发现，在小麦、酵母和人细胞中给出更多的重现性结果(Liu等，2002 Nuc.Acids Res.30：2742-2750；综述，Parekh-Olmedo等，2005 Gene Therapy 12：639-646；Dong等，2006 Plant Cell Rep.25：457-65)。定向诱变(TNE)还在许多专利申请中有描述，例如WO2005108622、WO2005049795、WO2004033708、WO03075856、WO03027765、WO0210364、WO0192512、WO0187914、WO0173002、WO0114531、WO9515972。迄今为止，已经有将TNE用于通过敲入或敲除基因而改变基因表达的目的的描述。本领域还没有提供将TNE用于将独特的选择性标记物引入种质的可行方法。
在本方法的第一步骤中，选择目标性状。性状可以是单基因或多基因性状，或者由基因复合物控制的性状，抗病性相关的性状或产量相关的性状等等。
在第二个步骤中，选择与目标性状关联的基因座或遗传区域。当然，当性状是多基因的时，可以选择基因座之一。
然后，确定遗传图上基因或遗传区域的位置。遗传图位置的确定包括发生法(generic method)，其称为连锁分析或遗传作图(参见，例如Griffiths AJF等，2005 Introduction to Genetic Analysis，8th ed.W.H.Freeman and Cie，New York pp.115-137)。遗传作图的一个必要前提是两亲代系的遗传作图群，所述亲代系在目标性状上有区别，并且根据亲代系可以获得一个种群，其中目标性状在子代中分离。另外可选地，在单基因性状情况中，通过使用群体分离分析法BSA，在性状区间可以非常有效地进行放大(Michelmore等，1991 PNAS 88：9828-9832)。通过使用BSA，不需要构建遗传图。
潜在标记物序列在目标种质(含有可以用于育种的遗传变异性的生物体种群)内得到鉴别，其位于(预定的)基因的遗传距离内，即位于性状的临近区域内。一般地，其位于基因的1cM内，但是这在农作物之间可以是不同的。这样的标记物还可以称为侧翼标记物。目标性状的临近区域内的分子标记物的遗传作图和鉴别优先地通过多重标记物技术(multiplex marker technologies)完成。多重标记物技术可以在单个分析内鉴别多个标记物。关于分子标记物技术存在多个综述(a.o.Rafalski A.2002 Curr Opin.Plant Biol.5 94-100，Peters J.等，2003 TiPS 8 484-491，Varshney R.等，2005 TiPS 10 621-630)。
一个需要阐明的附加特征是基础标记物序列(underlying marker sequences)的拷贝数。大部分植物基因组富含重复序列(Kumar和Bennetzen JL 1999 Ann Rev Genet 33：479-532)，并且用于常规目的的原始的鉴定的标记物到易于分析的标记物的成功转变依赖于低拷贝DNA序列。克服重复DNA带来的问题的一些方法已经得到发展。拷贝数的确定可以通过例如Southern印迹的杂交技术完成。其他的方法聚焦于例如利用cDNA序列、慢退火高Cot DNA的分离(Yuan等，2003 Plant J 34：249-255)以及甲基化过滤(Rabinowicz PD 2003 Meth.Mol Biol 236 21-36)的基因富集策略。以本发明所述的方式引入独特标记物也以新颖并且创造性的方式解决了基因组中标记物序列的多个拷贝之间的区分问题，并且提供了在基因组中产生单个拷贝标记物的方法。
合适的分子标记物技术是例如AFLP、RAPDs、SSRs、SFPs和SNPs。通过单独或者联合使用这些技术，可以鉴别一大组在目标基因侧翼的标记物。
侧翼标记物组用于选择过程，从而确定位于性状附近区域或者至少在距基因所希望的距离(一般以cM表示)内的标记物。另外可选地，可以使用已知的例如来自文献的标记物。
生物体种群通常以繁殖物种种质的形式提供，或者以其他合适的包含多个可能含有或者可能不含有标记物的成员的种群的形式给出。该种群可以就标记物的存在进行预筛。
标记物从含有标记物的种群的成员分离(例如切下电泳凝胶)并且测序，即确定它们的核苷酸序列。所选标记物组的DNA序列的确定通过例如Sanger双脱氧测序法完成，但其他方法也是可以的。
因此，在选择标记物后，还要在相同生物体的其他成员内鉴别标记物，并且从相同生物体的其他成员中分离标记物，从而获得多种标记物。从这些标记物的部分的每一各或者至少从这些标记物的部分确定序列。将序列比对，并且确定这些标记物的DNA组成的任何变异。这意味着，在标记物序列的任何位置上，各个A、C、T或G的存在都是可知的。标记物被测序的种群成员的数量至少为2，优选地至少为5，更优选地至少为10。在某些具体实施方式中，该数量可以是25或50，这取决于种群的大小和种质中多态性发生的程度。
序列的比对可以手动或者通过广泛可得的软件工具完成。序列的比对提供了不同种群成员的标记物序列之间差异的信息，即其可以鉴别自身标记物序列中的多态性或多态性缺乏。通过这样的操作，可以得到标记物序列中与其他标记物中的区域相比含有较少(或者根本没有)变异的区域的信息。在这样的区域中，可以选择一个或多个核苷酸，其与该区域中的其他核苷酸相比是(相对)稳定的(较少可变的)。甚至可能的是，在标记物序列中存在这样一个区域，其在研究的标记物当中组成恒定。
为了解释这一点，给出以下图表：
标记物X 序列 成员1 XOYQXOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXOOYX 成员2 XOYQYOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXQOYX
成员3 XOYQYOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXOOYX 成员4 XOYQXOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXQOYX 成员5 XOYQYOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXQOYX 成员6 XOYQYOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXQOYX 成员7 XOYQXOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXQOYX 成员8 XOYQYOXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYXQOYX
种群成员1、3、4和7在标记物内含有遗传变异。这并非必须是产生标记物自身的多态性，而可能仅仅是遗传(背景)变异。在序列中有一个区域，‘OXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYX’部分不含有(在研究的种群中)任何遗传变异，所以该区域描述为最低遗传变异的区域，或者描述为在核苷酸中具有最低变异的区域，或者描述为低变异性区域或者甚至试验种质内恒定核苷酸组成的区域。这意味着，在解释性的实施例中，恒定区域的每个核苷酸，‘OXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYX’部分可以作为独特标记物核苷酸的引入位置。
在接下来的步骤中，设计一个可以在潜在标记物核苷酸位置的临近位置杂交标记物序列的寡核苷酸。在上面解释性的例子中，该潜在标记物核苷酸位置可以是例如XOQYYQYOX中第二个Y(有下划线的)位置。通过设计可以杂交标记物序列并且在该位置(YQOXOOXQY)含有O的寡核苷酸，以及通过使用TNE，在基因组中指明的位置上引入互补的O，现在产生了一个独特的标记物序列，即OXQYXOQYOQYOXQYYQXOYYX’。该独特的DNA序列(至少在研究种群内)产生了物种的基因组中特异性并且独特的标记物序列。基因组中特异性标记物的引入现在可以用于育种，从而选择所需的具有比现有已知标记物更高准确度的性状。
图3以标记物到性状的cM距离内的变异的函数的形式预期了BC1和F2种群中的重组体数。在单个标记物的情况中，分别每100个或50个植物期望有至少一个重组体(不具有性状呈现的标记物或反之亦然)。对于要在成千上万的植物中完成选择的育种程序，该比例达到外部极限从而确保鉴别标记物与性状足够相关。在现有标记物形成方法中，需要相当精细的作图工作以在1cM的间隔内鉴别足够的标记物。因此优选地是，在所选的侧翼标记物组中的标记物位于至多2cM的距离内，优选地至多1cM的距离内，更优选地至多0.5cM的距离内。
然而，在两个或多个标记物可以获得的情况中，每100个植物中有1个重组体的比例可以通过为BC1和F2种群分别使用约10cM和约5cM的间距大小而实现。因此，本发明方法引入的两个标记物的使用显著提高了所述方法的效力。至于原种种质中性状的基因渗入，回交策略是优选的(参见图4)，因此，利用TNE形成标记物的的标记物选择标准一般最大限度地定位在与性状10cM间距内的至少2个标记物上。
在形成两个或多个标记物的一个具体实施方式中，(两个)所选侧翼标记物组的距离可以是显著较高的，这可以从图3中看出，优选地至多为10cM，更优选地至多为5cM。
按本文之前所概括的，使用定向诱变(TNE)将寡核苷酸引入到载有目标基因座的生物体的基因组中。所得生物体含有其遗传序列的特异性引入的改变，所述遗传序列与目标基因座紧密连结。该特异性引入的改变现在可以用作标记物，并且以任何常规方式进行分析，不管是利用分子标记物技术、PCR分析、SNP分析，所述SNP分析例如SNPWave，还是其他分析，如测序。
因此，换句话说，在标记物序列中，只要能被测定，在所研究的生物体的所研究的种质中不发生或很少发生的独特核苷酸就可被引入。
因此，所产生的独特的标记物现在可以使用例如PCR分析的简单分析而进行分析。商业相关的遗传背景(种质)中标记物基因座上的DNA序列变异的确定通过利用Sanger双脱氧测序法，在例如种质组(germplasm panel)的群体上利用PCR扩增标记物序列而实现。该种质组可以例如是适当农作物标记物片段中的性状基因座上的遗传变异的代表，或者是繁殖物种的种质的代表。举例来讲，对于90个的育种系，测定DNA序列的标记物基因座M1，同样参见附图。在DNA序列的位置104上，观察到了胞嘧啶(C)或者鸟嘌呤(G)。基于这个认识，选择腺嘌呤(A)作为通过TNE引入的核苷酸，从而产生独特的DNA片段，而该片段不太可能存在于种质中。
在供体植物系中通过TNE引入所设计的序列变体通过所述方法完成(Liu等，2002 Nuc.Acids Res.30：2742-2750，综述，Parekh-Olmedo等，2005 Gene Therapy 12：639-646，Dong等，2006 Plant Cell Rep.25：457-65)。利用TNE，产生了在标记物基因座M1上具有独特DNA序列的育种系，因此称为M1*。
表1显示了相比本发明所述的新方法，在植物中形成鉴别标记物的常规方法的整个时间跨度。新方法的优点在下面给出，但是这不意味着对其进行限定。
-常规鉴别标记物形成的时间跨度相当不牢靠，并且可能需要12-36个月，这取决于性状基因座和农作物物种。与此相反，利用本发明的标记物形成需要13-16个月。
-利用TNE人工引入的标记物是独特的，并且在自然界中是不存在的。以这种方式，包括性状和标记物的基因渗入片段可以是知识产权保护本身的主题，并且它们的使用和应用可以在市场上得到监督。
-对于很难找到任何多态性标记物的低多态性农作物，例如棉花、大豆、栽培的番茄、西瓜和黄瓜，可以利用所述方法产生标记物。
-TNE可以在育种过程期间在植物材料中引入标记物。甚至可能在现存的、性状良好的材料中产生标记物。
表1：用于植物育种的形成鉴别标记物的常规方法与本发明所述新方法的对照。就单基因性状的标记物形成中每个独立步骤的时间跨度进行评估。
1*)常规方法步骤2中利用BSA的精细作图是鉴别1cM间距内的标记物必需的。在不同基因座上的等位基因之间的相互关系通常较低(即整个连接不平衡程度较低)的农作物中，只有具有与性状基因座极端紧密连接的DNA变种可能与性状显著相关。在一些情况中，这可能需要克隆相应的基因本身。
2*)简单PCR分析的设计和建构依赖于识别作为标记物转变目标的低拷贝DNA序列中的可行性。特别是在具有庞大基因组的农作物，如小麦、大麦、玉米、胡椒和莴苣中，用于共存标记物形成的低拷贝序列的鉴别不是不重要的。
附图说明
图1：对于从外来背景基因渗入的性状的基因座M1和M2上形成标记物的示意图。条带代表单个染色体。
图2：在产生用于性状R分析的标记物M1*和M2*的基因座M1和M2上新序列变体的示意图。
图3a和3b：以标记物到性状的cM距离的函数预期了在BC1和F2种群中的重组体数。重组体数通过将找到重组体的概率乘以种群中植物的数量而计算得到。找到重组体的概率通过使用Kosambi作图函数将cM距离转化成重组分数而确定，所述函数被乘以适当种群类型中重组体配子存在的几率。Kosambi作图函数是基于关于作为物理距离变化的双交换比例的经验数据。Kosambi函数基于改变双交换比例的干扰调整图谱距离。Kosambi，D.D.1944.″The estimation of map distances from recombination values.″Ann.Eugen.12：172-75.
图4：在原种背景中引入性状R的BC1选择的实施例。在该实施例中，使用性状R的杂合的供体亲本。每个植物类型，绘制了两组同源染色体(染色体1＝大，染色体2＝小)。选择的BC1植物在染色体1的杂合构型中含有性状R，而染色体2的组成与回归亲本的组成相同。
图5：氯磺隆处理25天后观察到的种系25的敏感、半抗性和全抗性植物。
图6：
具体实施方式
实施例
现有发明的原理是在目标性状附近区域产生标记物。这些标记物在种质中是独特的，并且是基于对选择的DNA片段可用的序列知识设计的。
作为描述起始环境的第一个实施例，已经形成了抗病性性状R的STS标记物M1和M2，该性状得自目标农作物的野生祖先(图1)。该抗病性性状R源自亚洲种系(Asian accession)(“类型5”)，并且已经渗入到栽培的欧洲背景中，从而产生了欧洲育种系“类型4”。STS标记物M1和M2基于位于R基因侧翼的标记物基因座M1和M2的序列形成的。只有标记物M1在欧洲商用的目标农作物的片段中具有良好的性状R的预测值。欧洲背景中含有亚洲抗性单倍体的连锁障碍相对较大。
当使用M1和M2测试亚洲商用部分中目标农作物的抗性和敏感物质时，观察到标记物和疾病性状之间弱的相关性。在亚洲背景中含有抗性单倍体的连锁障碍相对较小。对于起始环境中标记物的形成，可以寻找与基因更紧密连接的标记物，或者依赖于农作物中连接不平衡的程度，需要克隆相应的基因，从而最终分析性状R的起因(causal)多态性。
本发明公开了在标记物基因座M1和M2上开发序列信息，而不是在亚洲种质中就R重复启动标记物鉴别和转换过程。在标记物基因座M1和M2上的序列变异的知识可以用来设计和产生独特的序列重组，其完全地与性状R相关。在图2中，绘制了假设的情况，其中育种系“类型5”用于产生育种系“类型8”，育种系“类型8”在基因座M1和M2上带有新的序列变体，这在与抗病性性状R组合的目标农作物的种质中是独特的。新产生的标记物M1*和M2*是在欧洲和亚洲种质二者中筛选性状R的理想工具。由于它们是人工产生的，因此它们在自然界中偶然产生的几率是可以忽略不计的。因而，标记物M1*和M2*是筛选引入了标记物M1*和M2*的种系的后代中性状R的理想鉴别标记物。
实施例：
产生用于烟草基因组的预定义SNP标记物分析
原生质体分离
烟草(Nicotiana tabacum)cv Petit Havana系SR1的体外芽培养物在高玻璃瓶中的具有含0.8％Difco琼脂的MS20培养基上，在25℃和60-70％RH下以2000lux的16/8h的光周期进行维持。MS20培养基是含有2％(w/v)蔗糖、无添加的激素和含有0.8％Difco琼脂的碱性Murashige和Skoog培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)。采集3-6周大的芽培养物的完全展开的叶片。将叶片切成1mm厚的切片，其然后转到含有45ml MDE基础培养基的大(100mm×100mm)陪替培养皿中进行30分钟预质壁分离处理。MDE基础培养基在900ml的总体积中含有0.25g KCl、1.0gMgSO4·7H2O、0.136g KH2PO4、2.5g聚乙烯吡咯酮(MW 10,000)、6mg萘乙酸和2mg 6-苯甲酸嘌呤。将溶液的重量克分子渗透压浓度用山梨糖醇调整到600mOsm.kg-1，pH调整到5.7。然后加入5ml酶贮液SR1。每100ml酶贮液包括750mg纤维素酶Onozuka R10、500mg崩溃酶和250mg浸解酶R10，用Whatman滤纸过滤，并且过滤消毒。叶片组织的消化在25℃下于黑暗中过夜进行。消化的叶片用50μm尼龙滤网过滤入无菌烧杯。使用等体积的冷KCl洗涤介质冲洗滤网，然后与原生质体悬浮液混合。每升KCl洗涤介质包括2.0g CaCl2·2H2O和足够量的将重量克分子渗透压浓度调整到540mOsm.kg-1的KCl。将悬浮液转移到10mL的试管中，将原生质体在4℃ 85xg下沉淀10分钟。排出上清液，将原生质体沉淀小心地再悬浮于5mL冷MLm洗涤介质中，其是MS培养基的一半当量浓度的大型滋养物(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)，每升含有2.2gCaCl2·2H2O，以及将重量克分子渗透压浓度调整到540mOsm.kg-1的甘露醇量。将2个试管的内容物混合，并且在4℃下85xg离心10分钟。将上清液除去，将原生质体沉淀小心地再悬浮于5mL冷MLm洗涤介质中，其是用蔗糖代替甘露醇的MLm培养基。
将MLs洗涤介质中的2试管的原生质体内容物混合，在蔗糖溶液上加入1mL KCl洗涤介质，注意不要搅动下层的相。然后在4℃下85xg再次离心原生质体。小心收集含有活原生质体的蔗糖和KCl溶液之间的相界面。加入等体积的KCl洗涤介质，小心混合。用血细胞计数器测定原生质体密度。
寡核苷酸
利用Eurogentec(Seraing，比利时)合成所有的寡核苷酸，利用反相HPLC纯化，并且重悬入无菌milliQ水。在使用之前，将寡核苷酸加热到95℃中5分钟。设计寡核苷酸06Q262，以在烟草SurA基因(登录号X07644)中密码子位置P194上引入单个错配(有下划线的核苷酸)，这会导致CCA到CAA(P194Q)的转变。相似地，其他寡核苷酸可以设计用来产生CCA到CTA(P194L)或CCA到CGA(P194R)的转变(寡核苷酸06Q263和06Q264)。
06Q262
5’TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID 1]
06Q263
5’TCAGTACCTATCATCCTACGTAGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID 2]
06Q264
5’TCAGTACCTATCATCCTACGTCGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID 3]
原生质体的PEG转化
在5℃85x g下离心原生质体悬浮液10分钟。将上清液除去，原生质沉淀在KCl洗涤介质中再悬浮到106.mL-1的终浓度。在一个10mL的试管中，将250μL原生质体悬浮液、1.6纳摩尔寡核苷酸和250μlPEG溶液小心但是完全地混合。室温下培养20分钟后，滴入5mL冷的0.275M Ca(NO3)2。在4℃85x g离心原生质体悬浮液10分钟。将上清液除去，小心地将原生质沉淀再悬浮于1.25mL补充有50μg.mL-1氨噻肟头孢菌素和50μg.mL-1万古霉素的To培养基中。T0培养基包含(每升，pH5.7)950mg KNO3、825mg NH4NO3、220mg CaCl2·2H2O、185mg MgSO4·7H2O、85mg KH2PO4、27.85mg FeSO4·7H2O、37.25mg Na2EDTA·2H2O，根据Heller′s培养基(Heller，R.，Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14：1-223，1953)的微量滋养物，根据Morel和Wetmore培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、2％(w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、1mg 6-苄氨基嘌呤和将重量克分子渗透压浓度调整到540mOsm.kg-1的量的甘露醇。
将悬浮液转移到35mm的陪替培养皿中。加入等体积的To琼脂糖培养基，并且轻轻地混合。在25℃下于黑暗中孵育样品，并且按照下面所述方法进一步孵育样品。
原生质体培养
培养10天后，将琼脂糖厚片切成6个相同部分，并且转移到含有补充有20nM氯磺隆的22.5mL MAP1AO培养基的陪替培养皿。该培养基包括(每升，pH 5.7)950mg KNO3、825mg NH4NO3、220mgCaCl2·2H2O、185mg MgSO4·7H2O、85mg KH2PO4、27.85mgFeSO4·7H2O、37.25mg Na2EDTA·2H2O、根据Murashige和Skoog培养基的十分之一原始浓度的微量滋养物(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)、根据Morel和Wetmore培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、6mg丙酮酸盐、苹果酸和富马酸和柠檬酸各12mg、3％(w/v)蔗糖、6％(w/v)甘露醇、0.03mg萘乙酸和0.1mg 6-苄氨基嘌呤。在25℃低光线下孵育样品6-8周。然后将生长的愈合组织转移到MAP1培养基，并且再发育2-3周。MAP1培养基具有与MAP1AO相同的组分，只是使用3％(w/v)的甘露醇而不是6％，和46.2mg.l-1组氨酸(pH 5.7)。然后用0.8％(w/v)Difco琼脂将其固化。
然后用无菌镊子将氯磺隆抗性愈合组织转移到RP培养基。RP培养基包括(每升，pH 5.7)273mg KNO3、416mg Ca(NO3)2·4H2O、392mgMg(NO3)2·6H2O、57mg MgSO4·7H2O、233mg(NH4)2SO4、271mgKH2PO4、27.85mg FeSO4·7H2O、37.25mg Na2EDTA·2H2O、根据Murashige和Skoog培养基的五分之一公开浓度的微量滋养物、根据Morel和Wetmore培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、0.05％(w/v)的蔗糖、1.8％(w/v)的甘露醇、0.25mg玉米素和41nM氯磺隆，其使用0.8％(w/v)Difco琼脂固化。2-3周后，将＞2cm高且清晰显示了叶片和顶端分生组织的成熟的芽转移到由MS20培养基组成但不含任何生长调节剂的生根培养基中。
ALS的PCR扩增和测序
使用DNeasy试剂盒(Qiagen)从氯磺隆抗性烟草愈合组织中分离DNA，并且该DNA作为PCR反应中的模板。烟草SurA基因中的定向密码子的转换使用引物5’GGTCAAGTGCCACGTAGGAT[SEQ ID 4]和5’GGGTGCTTCACTTTC TGCTC[SEQ ID 5]检测，所述引物扩增了该基因的包括密码子194的776bp片段。除草剂抗性的烟草愈合组织中的核苷酸转变通过将PCR产物克隆到pCR2.1::TOPO(Invitrogen)并且对个体质粒测序而确认。烟草包含ALS的2个等位基因(SurA和SurB)。这些基因座的任意一个的P194密码子上的核苷酸转变均足以赋予氯磺隆抗性。由于烟草是一种异源四倍体物种，因此在烟草中有8个可能的靶位，在靶位上可能已经发生定向诱变。期望的是，8个Sur等位基因中只有一个经受了变化从而提供了氯磺隆抗性。因此，七个野生型等位基因还可以利用未改变的序列检测到。与此一致的是，必须将＞10个的含有PCR产物的质粒克隆进行测序以检测具有密码子194碱基转变的一个质粒克隆。通过在来源于若干烟草原生质体转染实验的氯磺隆抗性的愈合组织上使用该方法，可以鉴别6个独特的愈合组织，每个愈合组织均在SurA或SurB中具有不同的碱基变化(表1)。
表1：6个独特的烟草植物，每个在SurA或SurB基因的密码子194上具有不同的碱基转变。
植物ID P194上的突变 surA 02 CCA →CGA(P194R) surA 29 CCA→CGA(P194R) surB 25 CCA→CAA(P194Q) surA 06 CCA→CAA(P194Q) surB 15 CCA→CTA(P194L) surA
13 CCA→CTA(P194L) surB
自交，种子收集和表型
从显示在表1中的三个种系获得种子。来自该3个种系的每一个种系的96个自交种子(M1)播种在土壤中，并且在温室中栽培。种植36天后，从每个烟草种系的48株植物收获叶片材料，用于DNA分离。然后将37天龄的植物用0.2％Tween-20、10％丙酮和140μM氯磺隆的溶液进行喷洒。氯磺隆抑制了SurA和SurB基因座编码的酶(乙酰乳酸合酶；ALS)；ALS催化了导致氨基酸Leu、Ile和Val合成的最初生物合成步骤。P194突变ALS导致了ALS酶的改变的形式，其是氯磺隆不敏感的。所有喷洒的植物相比没有喷洒的植物变黄了几分，并且一些叶片显示出镶嵌样图象，但这是先前所述的一种暂时现象(“黄色闪现”(yellow flash))。喷撒20天后，可以将植物分成三类：敏感的，半抗性的和完全抗性的(图1)。敏感的植物在喷洒后表现出不再生长，并且某些植物甚至死亡。半抗性的植物表现出减慢的生长，并且新形成的叶片显现出“鞋带”样的形态。完全抗性的植物与未喷撒的对照植物表型相同。表型数据显示在表2中。
表2：计分的氯磺隆处理后的自交后代烟草种系的表型数量的概述。完全抗性植物(F-R)，半抗性植物(S-R)和敏感植物(S)。
三种烟草种系的表型计分符合孟德尔遗传特征(表2)。
qPCR SNP标记物分析的形成
基于SurA基因中产生的不同突变，使用AlleleID软件设计等位基因特异性的序列多态性衍生的(AS SPD)引物，所述引物的特征为在它们的3′-末端具有单个的、等位基因选择性的LNA碱基，并且购自Eurogentec。包含LNA(有下划线的)的等位基因特异性的反义引物是：
检测野生型C等位基因的
Sur-581-C：5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTG3’，
和分别检测突变的G、T和A等位基因的
Sur-581-G：5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTC 3’，
Sur-581-T：5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTA 3’和
Sur-581-A：5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTT 3’。
等位基因特异性引物与正向引物Sur-F：5’CGCCACCAATCTCGTCAG 3’相结合，用于扩增来自所有幼苗植物基因组DNA的片段。使用LightCycler 480实时PCR系统在384孔的PCR组块中进行PCR。在10μl PCR反应中，反应包括5μl 2X SYBR green master mix(Roche)、25-50ng基因组DNA、各5μM的引物。所用的反应条件为：95℃10分钟，然后95℃下10秒、66℃下20秒(每次循环减少0.5℃)、72℃20秒，循环18次，然后95℃10秒、59℃20秒、72℃20秒，循环22次。
扩增之后，绘制解链曲线，从而检查形成的产物的特异性。然后将Ct(循环阙值(cycle treshold))值用于分析。
使用SNP标记物分析测定M1种群并与表型关联
设计基于SurA序列并与SurB序列在一个核苷酸上(远离ALS突变位点的13个核苷酸)不同的qPCR的等位基因特异性引物。来自在SurB中含有突变的种系06和13的qPCR结果显示了野生型等位基因(CCA)和突变的等位基因(CAA/CTA)的扩增。使用这些基于SurA的引物不可能区分杂合和纯合植物间的SurB中引入的突变。源自种系25的qPCR结果显示了野生型等位基因(CCA)和突变等位基因(CAA)的扩增，并且也可以区别杂合抗性植物和纯合抗性植物。相比于杂合抗性植物的Ct值，源自纯合抗性植物的qPCR结果显示突变的等位基因中较低的Ct值以及野生型等位基因中较高的Ct值。
表3：基于等位基因特异性qPCR数据的计分。纯和抗性植物(HO-R)，杂合抗性植物(HE-R)和敏感植物(S)。
三种烟草种系的等位基因特异性qPCR计分符合孟德尔遗传特征
(表3)。此外，在植物的遗传型(诱导的突变为纯合或杂合)和除草剂处理之后这些植物的表型与杂合型突变的半抗性植物和纯合型突变的完全抗性的植物之间具有明显的关联。
每个植物的表型计分结果与Q-PCR结果对比，并且这些结果有98％的相关性(表4)。表4中的非常低的卡方值还显示，表型计分和Q-PCR结果相关。因此，个体表型可以通过在序列的独特部分中精密引入的标记物的标记物分析准确预测，反之亦然。
表4：相比qPCR计分的表型计分。
总之，我们已经显示，DNA标记物可以被引入到特异性的植物等位基因中，并且这可以使用沿用已久的SNP检测方法检测，而且标记物可以用于预测/选择下一代中所期望的表型分离物。