一种丹酚酸A纯化方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210487600.6 (22)申请日 2012.11.20 C07C 69/732(2006.01) C07C 67/48(2006.01) C07C 67/56(2006.01) C07C 67/58(2006.01) (73)专利权人 江西青峰药业有限公司 地址 341000 江西省赣州市沙河工业园站东 大道 8 号 (72)发明人 刘地发 张功俊 王振 汤新乾 刘尧奇 廖祝元 CN 100999470 A,2007.07.18, 说明书第 2-3 页， 第 1 页最后一段 . JP H02131423 A,1990.05.2。

2、1, 全文 . EP 1371368 A1,2003.12.17, 全文 . JP 4868199 B2,2012.02.01, 全文 . CN 100998552 A,2007.07.18, 全文 . CN 102219685 A,2011.10.19, 全文 . CN 101353306 A,2009.01.28, 全文 . CN 102249920 A,2011.11.23, 全文 . CN 102212004 A,2011.10.12, 全文 . (54) 发明名称 一种丹酚酸 A 纯化方法 (57) 摘要 本发明涉及一种丹酚酸 A 纯化方法， 将含有 丹酚酸 A 的洗脱液或提取液 ；。

3、 调 pH 至 2.5 4.5， 离心， 上清液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析 分离， 用水洗脱后， 用洗脱剂洗脱， 高效液相检测 丹酚酸 A， 收集含有丹酚酸 A 的洗脱液 ； 将得到的 洗脱液用葡聚糖凝胶 LH-20 或 ODS-C18 或聚酰胺 层析柱分离， 用洗脱剂洗脱， 高效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹酚酸 A 的洗脱液 ； 将得到的洗脱液 调 pH 至 2.0 4.0， 经有机溶剂萃取， 分离有机溶 剂相 ； 将得到的溶液用硅胶层析柱分离， 用洗脱 剂洗脱， 高效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹酚酸 A 的洗脱液 ； 将得到的洗脱液， 减压回收洗脱剂， 再加水溶解， 微波真空干。

4、燥， 得进一步纯化的丹酚 酸 A。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘鑫 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书9页 (10)授权公告号 CN 102993015 B (45)授权公告日 2015.04.08 CN 102993015 B 1/1 页 2 1.一种丹酚酸A纯化方法， 其特征在于 ： 将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液 ； 采用如下 步骤进一步纯化 ： 步骤一将所述洗脱液或提取液减压浓缩至每 1mL 含丹酚酸 Al-10mg， 调 pH 至 2.5 4.5， 离心， 上清液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离， 所述丹酚酸 A 。

5、上样量与大孔吸 附树脂比为 1 (35 70)， 树脂柱径高比为 1 (4 30)， 用水洗脱后， 用洗脱剂洗脱， 高 效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹酚酸 A 的洗脱液 ； 步骤二将步骤一得到的洗脱液浓缩至每 mL 含 1-10mg 丹酚酸 A 的溶液， 用葡聚糖凝胶 LH-20 或 ODS-C18 或聚酰胺层析柱分离， 所述丹酚酸 A 上样量与层析柱比为 1 (5 25)， 树脂柱径高比为 1 (4 25)， 用洗脱剂洗脱， 高效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹酚酸 A 的洗脱液， 洗脱液减压回收并浓缩成水溶液 ； 步骤三将步骤二得到的水溶液调 pH 至 2.0 4.0， 经有机溶剂萃取。

6、， 分离有机溶剂相， 所述的有机溶剂为叔丁基甲基醚、 乙酸甲酯、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯或甲酸乙酯 ； 步骤四将步骤三得到的溶液减压回收有机溶剂， 制成每 1mL 含丹酚酸 A500 10000mg 的萃取液， 用硅胶层析柱分离， 用洗脱剂洗脱， 高效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹酚酸 A 的 洗脱液， 其中所述洗脱剂为石油醚、 正戊烷、 正庚烷、 乙酸甲酯、 甲酸乙酯、 叔丁基甲基醚组 成的两相溶剂 ； 步骤五将步骤四得到的洗脱液， 减压回收洗脱剂， 再加水溶解， 微波真空干燥， 所述微 波真空干燥温度 ： 20-100， 回差温度 1-5， 真空度 -0.07MPa 以上， 微波功率 1-。

7、100kW， 干 燥 10-200 分钟， 得进一步纯化的丹酚酸 A。 2.根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其中步骤一中所述大孔树脂柱为 HPD-80、 HPD-100、 HPD-100B、 HPD-200A、 HPD-300、 HPD-450、 HPD-722、 HPD-826、 ADS-5、 ADS-8、 ADS-21、 D101 或 AB-8。 3.根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其中步骤一中所述洗脱剂分别为水及不同比例的 水与乙醇， 并且先用水与 10 40乙醇洗脱， 除去杂质， 再用 20 60乙醇洗脱。 4.根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其中步骤二中的所述洗脱剂分别为。

8、水及不同比例 的水与乙醇， 并且先用水、 20 60乙醇溶液洗脱除杂， 再用 40 9乙醇溶液洗脱。 5.根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其中步骤一中所述丹酚酸 A 上样量与大孔吸附树 脂比为 1 (45 55)， 树脂柱径高比为 1 (8 18)。 6.根据权利要求 5 所述的纯化方法， 其中步骤一中所述丹酚酸 A 上样量与大孔吸附树 脂比为 1 50， 树脂柱径高比为 1 10。 7.根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其中步骤二中所述丹酚酸 A 上样量与层析柱比为 1 (8 18)， 树脂柱径高比为 1 (6 20)。 8.根据权利要求 7 所述的纯化方法， 其中步骤二中所述丹酚酸 。

9、A 上样量与层析柱比为 1 10， 树脂柱径高比为 1 8。 9.根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其中步骤一和步骤三中使用的 pH 调节剂为磷酸、 盐酸、 硫酸或醋酸。 权 利 要 求 书 CN 102993015 B 2 1/9 页 3 一种丹酚酸 A 纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及一种丹酚酸 A 纯化方法。 技术背景 0002 丹参制剂是我国心脑血管疾病的基本治疗药物， 因疗效确切， 丹参已成为我国用 量最大、 销售额最高、 制剂生产厂最多， 临床剂型最全的中药之一。丹参有效化学成分主要 有两大类 ： 脂溶性丹参酮类化合物和水溶性酚酸类化合物。研究表明 ： 丹酚酸类在抗肝脏 。

10、损伤、 抗动脉粥样硬化及细胞凋亡以及改善记忆功能障碍等方面有着显著的活性。其中又 以丹酚酸 A(SaivianolicacidA) 抗氧化活性最强。 0003 丹酚酸 A 结构如下 ： 0004 0005 但是， 丹酚酸 A 的天然含量极低 ( 约为丹参药材的 0.01-0.06 )， 使得原药材成 本过高， 分离纯化难度过大， 严重制约着药物的开发和研究， 成为其产业化的瓶颈。现有技 术中， 也一直努力尝试找到一种适于实际生产应用的提取制备丹酚酸 A 的生产工艺。例如， 中国专利 CN101041620A 公开了采用水温浸、 离心、 树脂层析、 萃取、 浓缩干燥制备丹酚酸 A 的方法， 但其。

11、最终提取物得率为3， 产率低， 生产成本高。 又如， 中国专利CN101121658A公 开了水提取、 高温高压反应、 树脂层析、 萃取、 真空干燥或冷冻干燥制备丹酚酸 A 的方法。而 中国专利 CN101480423A 公开了用乙醇 / 水洗脱大孔树脂所得的丹酚酸 A 溶液， 干燥 ( 优选 减压干燥或真空干燥 )， 得到丹酚酸 A 提取物最高含量为 91.26的方法。但上述现有技术 转化过程无法控制， 转化副产物多， 主产物丹酚酸 A 的产率较低。并且对丹酚酸 A 的破坏很 大， 成本极高， 所得的提取物有机溶剂残留严重， 极不易保存与使用。 0006 综上所述， 上述现有技术均存在实际生。

12、产过程中无法克服的缺陷。 发明内容 0007 为克服上述缺陷， 本发明提供了一种进一步纯化丹酚酸 A 并不破坏丹酚酸 A 的纯 化方法。 0008 本发明提供的丹酚酸A纯化方法， 其中将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液 ； 采用如 下步骤进一步纯化 ： 0009 步骤一将所述洗脱液或提取液减压浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A1-10mg， 调 pH 至 2.54.5， 离心， 上清液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离， 所述丹酚酸A上样量与大 说 明 书 CN 102993015 B 3 2/9 页 4 孔吸附树脂比为 1 (35 70)， 树脂柱径高比为 1 (4 30)， 用水洗脱后， 用洗脱剂。

13、洗 脱， 高效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹酚酸 A 的洗脱液 ； 0010 步骤二将步骤一得到的洗脱液浓缩至每 ml 含 1-10mg 丹酚酸 A 的溶液， 用葡聚糖 凝胶 LH-20 或 ODS-C18 或聚酰胺层析柱分离， 所述丹酚酸 A 上样量与层析柱比为 1 (5 25)， 树脂柱径高比为 1 (4 25)， 用洗脱剂洗脱， 高效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹酚 酸 A 的洗脱液， 洗脱液减压回收并浓缩成水溶液 ； 步骤三将步骤二得到的水溶液调 pH 至 2.0 4.0， 经有机溶剂萃取， 分离有机溶剂相 ； 0011 步骤四将步骤三得到的溶液减压回收有机溶剂， 制成每 1ml 。

14、含丹酚酸 A500 10000mg 的萃取液， 用硅胶层析柱分离， 用洗脱剂洗脱， 高效液相检测丹酚酸 A， 收集含有丹 酚酸 A 的洗脱液 ； 0012 步骤五将步骤四得到的洗脱液， 减压回收洗脱剂， 再加水溶解， 微波真空干燥， 所述微波真空干燥温度 ： 20-100， 回差温度 1-5， 真空度 -0.07Mpa 以上， 微波功率 1-100KW， 干燥 10-200 分钟， 得进一步纯化的丹酚酸 A。 0013 优选的， 其中步骤一中所述大孔树脂柱为 HPD-80、 HPD-100、 HPD-100B、 HPD-200A、 HPD-300、 HPD-450、 HPD-722、 HPD-。

15、826、 ADS-5、 ADS-8、 ADS-21、 D101 或 AB-8。 0014 优选的， 其中步骤一中所述洗脱剂分别为水及不同比例的水与乙醇， 并且先用水 与 10 40乙醇洗脱， 除去杂质， 再用 20 60乙醇洗脱。 0015 优选的， 其中步骤二中的所述洗脱剂分别为水及不同比例的水与乙醇， 并且先用 水、 20 60乙醇溶液洗脱除杂， 再用 40 9乙醇溶液洗脱。 0016 优选的， 其中步骤三中所述的有机溶剂为叔丁基甲基醚、 乙酸甲酯、 乙酸乙酯、 乙 酸丁酯或甲酸乙酯。 0017 优选的， 其中步骤四中所述洗脱剂为石油醚、 正戊烷、 正庚烷、 乙酸乙酯、 乙酸甲 酯、 甲酸。

16、乙酯、 叔丁基甲基醚组成的两相溶剂。 0018 优选的， 其中步骤一中所述丹酚酸 A 上样量与大孔吸附树脂比为 1 (45 55)， 树脂柱径高比为 1 (8 18)。 0019 更优选的， 其中步骤一中所述丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为150， 树脂柱 径高比为 1 10。 0020 优选的， 其中步骤二中所述丹酚酸A上样量与层析柱比为1(818)， 树脂柱径 高比为 1 (6 20)。 0021 更优选的， 其中步骤二中所述丹酚酸A上样量与层析柱比为110， 树脂柱径高比 为 1 8。 0022 优选的， 其中步骤一和步骤三中使用的 pH 调节剂为磷酸、 盐酸、 硫酸或醋酸。 0023 。

17、本发明通过反复实验比较， 首先确定了对丹酚酸A产率产生重要影响的因素pH值 的范围。 0024 再者， 本发明分别选择了弱极性和非极性大孔吸附树脂进行粗分离， 再选择聚酰 胺等层析柱分离、 有机溶剂萃取、 硅胶分离， 并对不同洗脱液进行测定， 去除杂质部分后， 将 丹酚酸 A 含量从 10左右提高到 80， 至 90， 至 93， 至 96。 0025 进一步， 在显著提高转化率的同时， 本发明通过适于实际产业应用的纯化步骤， 尤 其是通过一系列的分离、 洗脱处理等步骤后， 没有采用传统的减压干燥或真空干燥， 而是采 说 明 书 CN 102993015 B 4 3/9 页 5 用微波真空干燥。

18、， 从而彻底克服了以往干燥温度过高， 干燥时间过长， 冷冻干燥时间过长， 成本极高且冷冻干燥所得的提取物过度蓬松， 不易保存与使用以及对丹酚酸 A 的破坏大的 缺陷。 0026 并且， 由于本发明要解决的是如何进一步纯化丹酚酸 A 并不破坏丹酚酸 A 的纯化 方法。因此， 本发明的纯化原料并不局限于某一特定方法获得的含有丹酚酸 A 的洗脱液或 提取液。 例如可以采用背景技术中CN101041620A公开的 “将丹参饮片或粉碎的丹参采用水 或浓度 10-95的乙醇作为提取溶剂， 采用温浸、 回流法提取， 采用过滤、 自然沉淀或离心方 法初步除去固体杂质” 得到的提取液 ： 也可以采用 CN101。

19、121658A 中公开的 “向丹参饮片或 粉碎的丹参中加入适量的溶剂作为溶媒， 经过提取后， 进行固液分离” 得到的提取液 ； 还可 以是 CN101480423A 中公开的 “向丹参饮片或初粉中加入适量的提取溶剂进行回流提取或 渗漉 ； 过滤” 得到的提取液。当然， 也包括采用常规方法获得的洗脱液。总之， 本发明中使 用的含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液原料可以是本技术人员熟知的任意常规方法提取获 得的洗脱液或提取液。在此基础上， 再进一步采用本发明提供的进一步纯化丹酚酸 A 的工 艺方法， 能极大的提高丹酚酸 A 的产率。 0027 综上所述， 本发明提供了一种非常适合产业应用且生产成本较。

20、低的新的制备丹酚 酸 A 的工艺方法。 具体实施方式 0028 实施例 1 0029 将含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液用 20磷酸调 pH 值至 2.5， 离心， 上清液减压 浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A3mg， 经 HPD-100 大孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与大孔吸 附树脂比为 1 50， 树脂柱径高比为 1 10， 分别用 3 倍柱体积水、 5 倍柱体积 25乙醇洗 脱， 除去杂质， 再用 4 倍柱体积 40乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚酸 A 的 40乙醇洗 脱部分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味 ； 水溶液浓缩至每 ml 含 5mg 丹酚酸 A 的溶液， 通。

21、过 聚酰胺层析柱分离， 丹酚酸 A 上样量与聚酰胺比为 1 10， 树脂柱径高比为 1 8， 分别用 3 倍柱体积水、 12 倍柱体积 40乙醇溶液洗脱除杂， 再用 8 倍柱体积 60乙醇溶液洗脱， 收 集含有丹酚酸 A 的 60乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A15mg 水溶 液 ； 水溶液用 20磷酸调 pH 至 2.5， 用水溶液 3 倍量的叔丁基甲基醚， 分 3 次萃取， 分离有 机层， 减压回收叔丁基甲基醚， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.5g 的萃取液， 加入 1 3 倍量硅胶， 搅拌， 挥干 ； 把搅拌样硅胶加到已装好的 15 倍量干硅胶柱上， 硅胶柱。

22、径高比为 1 10， 以正 戊烷 - 叔丁基甲基醚为洗脱剂， 梯度洗脱， 分别用正戊烷 - 叔丁基甲基醚 (4 6) 洗脱 10 倍柱体积， 正戊烷 - 叔丁基甲基醚 (6 4) 洗脱 10 倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加 10 倍 量水溶解， 用微波真空干燥， 干燥温度80， 回差温度3， 真空度-0.05Mpa以上， 微波功率 60KW， 干燥 150 分钟， 得丹酚酸 A， 测得含量为 96.62。 0030 实施例 2 0031 将含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液用 15盐酸调 pH 值至 2.5， 离心， 上清液减压 浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A5mg， 经 HPD-100 大。

23、孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与大孔吸 附树脂比为 1 45， 树脂柱径高比为 1 8， 分别用 3.5 倍柱体积水、 4 倍柱体积 25乙醇 洗脱， 除去杂质， 再用 5 倍柱体积 45乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚酸 A 的 45乙醇 说 明 书 CN 102993015 B 5 4/9 页 6 洗脱部分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味 ； 水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液， 通过 聚酰胺层析柱分离， 丹酚酸 A 上样量与聚酰胺比为 1 9， 树脂柱径高比为 1 7， 分别用 4 倍柱体积水、 10 倍柱体积 40乙醇溶液洗脱除杂， 再用 8 倍柱体积 65乙醇溶。

24、液洗脱， 收 集含有丹酚酸 A 的 65乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A12mg 水溶 液 ； 水溶液用 15盐酸调 pH 至 2.6， 用 4 倍量的叔丁基甲基醚， 分 4 次萃取， 分离有机层， 减 压回收叔丁基甲基醚， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.8g 的萃取液， 加入 2 3 倍量硅胶， 搅拌， 挥 干 ； 把搅拌样硅胶加到已装好的 13 倍量干硅胶柱上， 硅胶柱径高比为 1 8， 以正庚烷 - 乙 酸乙酯为洗脱剂， 梯度洗脱， 分别用正庚烷-乙酸乙酯(46)洗脱8倍柱体积， 正庚烷-乙 酸乙酯 (7 3) 洗脱 8 倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加 。

25、8 倍量水溶解， 用微波真空干燥， 干 燥温度70， 回差温度5， 真空度-0.06Mpa以上， 微波功率80KW， 干燥120分钟， 得丹酚酸 A， 测得含量为 95.79。 0032 实施例 3 0033 将含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液用 15硝酸调 pH 值至 2.8， 离心， 上清液减压 浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A6mg， 经 HPD-100B 大孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与大孔吸 附树脂比为 1 40， 树脂柱径高比为 1 7， 分别用 4 倍柱体积水、 4 倍柱体积 25乙醇洗 脱， 除去杂质， 再用 5 倍柱体积 40乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚。

26、酸 A 的 40乙醇洗 脱部分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味 ； 水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液， 通过聚 酰胺层析柱分离， 丹酚酸 A 上样量与聚酰胺比为 1 8， 树脂柱径高比为 1 8， 分别用 4 倍 柱体积水、 9 倍柱体积 40乙醇溶液洗脱除杂， 再用 7 倍柱体积 65乙醇溶液洗脱， 收集含 有丹酚酸 A 的 65乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A10mg 水溶液 ； 水溶液用 15硝酸调 pH 至 2.6， 用 4 倍量的乙酸甲酯， 分 4 次萃取， 分离有机层， 减压回收 乙酸甲酯， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.7g 的萃取液， 加入 。

27、3 倍量硅胶， 搅拌， 挥干 ； 把搅拌样硅 胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上， 硅胶柱径高比为17， 以石油醚、 甲酸乙酯为洗脱剂， 梯度洗脱， 分别用石油醚 - 甲酸乙酯 (4 6) 洗脱 8 倍柱体积， 石油醚 - 甲酸乙酯 (6 4) 洗脱 9 倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加 8 倍量水溶解， 用微波真空干燥， 干燥温度 75， 回 差温度 4， 真空度 -0.04Mpa 以上， 微波功率 50KW， 干燥 160 分钟， 得丹酚酸 A， 测得含量为 96.13。 0034 实施例 4 0035 将含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液用 20硫酸调 pH 值至 2.6， 离心， 上清液。

28、减压 浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A5mg， 经 HPD-826 大孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与大孔吸 附树脂比为 1 40， 树脂柱径高比为 1 7， 分别用 4 倍柱体积水、 4 倍柱体积 25乙醇洗 脱， 除去杂质， 再用 5 倍柱体积 40乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚酸 A 的 40乙醇洗 脱部分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味 ； 水溶液浓缩至每 ml 含 6mg 丹酚酸 A 的溶液， 通过 ODS 层析柱分离， 丹酚酸 A 上样量与 ODS 比为 1 10， 树脂柱径高比为 1 15， 分别用 4 倍 柱体积水、 7 倍柱体积 35乙醇溶液洗脱除杂， 再用 。

29、6 倍柱体积 60乙醇溶液洗脱， 收集含 有丹酚酸 A 的 60乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A12mg 水溶液 ； 水溶液用 20硫酸调 pH 至 2.8， 用 4 倍量的乙酸丁酯， 分 4 次萃取， 分离有机层， 减压回收 乙酸丁酯， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.5g 的萃取液， 加入 2.5 倍量硅胶， 搅拌， 挥干 ； 把搅拌样 硅胶加到已装好的 9 倍量干硅胶柱上， 硅胶柱径高比为 1 8， 以正戊烷、 乙酸甲酯为洗脱 说 明 书 CN 102993015 B 6 5/9 页 7 剂， 梯度洗脱， 分别用正戊烷 - 乙酸甲酯 (4.5 5.5) 洗脱 。

30、8 倍柱体积， 正戊烷 - 乙酸甲酯 (6.53.5)洗脱8倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加10倍量水溶解， 用微波真空干燥， 干燥 温度 70， 回差温度 2， 真空度 -0.04Mpa 以上， 微波功率 110KW) 干燥 200 分钟， 得丹酚酸 A， 测得含量为 94.95。 0036 实施例 5 0037 将含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液用 20醋酸调 pH 值至 2.6， 离心， 上清液减压 浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A5mg， 经 HPD-826 大孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与大孔吸 附树脂比为 1 35， 树脂柱径高比为 1 8， 分别用 3 倍柱体积水、 4。

31、.5 倍柱体积 25乙醇 洗脱， 除去杂质， 再用 6 倍柱体积 40乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚酸 A 的 40乙醇 洗脱部分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味 ； 水溶液浓缩至每ml含8mg丹酚酸A的溶液， 通过 ODS 层析柱分离， 丹酚酸 A 上样量与 ODS 比为 1 12， 树脂柱径高比为 1 18， 分别用 4 倍 柱体积水、 8 倍柱体积 30乙醇溶液洗脱除杂， 再用 5 倍柱体积 65乙醇溶液洗脱， 收集含 有丹酚酸 A 的 65乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A15mg 水溶液 ； 水溶液用 20醋酸调 pH 至 2.7， 用 5 倍量的。

32、乙酸乙酯， 分 5 次萃取， 分离有机层， 减压回收 乙酸乙酯， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.5g 的萃取液， 加入 2 倍量硅胶， 搅拌， 挥干 ； 把搅拌样硅 胶加到已装好的 10 倍量干硅胶柱上， 硅胶柱径高比为 1 10， 以正戊烷、 乙酸甲酯为洗脱 剂， 梯度洗脱， 分别用正戊烷 - 乙酸甲酯 (4.5 5.5) 洗脱 8 倍柱体积， 正戊烷 - 乙酸甲酯 (6.53.5)洗脱8倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加12倍量水溶解， 用微波真空干燥， 干燥 温度 45， 回差温度 1， 真空度 -0.02Mpa 以上， 微波功率 20KW， 干燥 150 分钟， 得丹酚酸 A， 测得。

33、含量为 95.77。 0038 实施例 6 0039 将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用10氢氧化钠调pH至5.6， 加入0.5CuCl2 作为催化剂， 在133温度加热转化4.5小时， 转化液用10盐酸调pH值至2.7， 离心， 上清 液减压浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A5mg， 经 HPD-D101 大孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与 大孔吸附树脂比为 1 40， 树脂柱径高比为 1 9， 分别用 4 倍柱体积水、 4 倍柱体积 22 乙醇洗脱， 除去杂质， 再用 6 倍柱体积 43乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚酸 A 的 43 乙醇洗脱部分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味。

34、 ； 水溶液浓缩至每 ml 含 10mg 丹酚酸 A 的溶 液， 通过 ODS 层析柱分离， 丹酚酸 A 上样量与葡聚糖凝胶 LH-20 比为 1 15， 树脂柱径高比 为 1 20， 分别用 4 倍柱体积水、 8 倍柱体积 30乙醇溶液洗脱除杂， 再用 5 倍柱体积 60 乙醇溶液洗脱， 收集含有丹酚酸 A 的 60乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每 1ml 含 丹酚酸 A12mg 水溶液 ； 水溶液用 10盐酸调 pH 至 2.8， 用 5 倍量的乙酸甲酯， 分 5 次萃取， 分离有机层， 减压回收乙酸甲酯， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.5g 的萃取液， 加入 3 倍量硅胶， 搅 。

35、拌， 挥干 ； 把搅拌样硅胶加到已装好的 12 倍量干硅胶柱上， 硅胶柱径高比为 1 10， 以正戊 烷、 乙酸甲酯为洗脱剂， 梯度洗脱， 分别用正戊烷 - 乙酸甲酯 (4 6) 洗脱 6 倍柱体积， 正戊 烷 - 乙酸甲酯 (6 4) 洗脱 7 倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加 10 倍量水溶解， 用微波真空 干燥， 干燥温度25， 回差温度13， 真空度-0.03Mpa以上， 微波功率30KW， 干燥140分钟， 得丹酚酸 A， 测得含量为 95.28。 0040 实施例 7 0041 将含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液用 15硫酸调 pH 值至 3.0， 离心， 上清液减压 说 明 书。

36、 CN 102993015 B 7 6/9 页 8 浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A5mg， 经 AB-8 大孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与大孔吸附树 脂比为 1 36， 树脂柱径高比为 1 9， 分别用 3 倍柱体积水、 4 倍柱体积 25乙醇洗脱， 除 去杂质， 再用 5 倍柱体积 45乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚酸 A 的 45乙醇洗脱部 分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味 ； 水溶液浓缩至每 1ml 含 6mg 丹酚酸 A 的溶液， 通过聚酰 胺层析柱分离， 丹酚酸 A 上样量与聚酰胺比为 1 10， 树脂柱径高比为 1 10， 分别用 4 倍 柱体积水、 8 倍柱。

37、体积 45乙醇溶液洗脱除杂， 再用 8 倍柱体积 65乙醇溶液洗脱， 收集含 有丹酚酸 A 的 65乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A10mg 水溶液 ； 水溶液用 15硫酸调 pH 至 2.7， 用 4 倍量的叔丁基甲基醚， 分 4 次萃取， 分离有机层， 减压 回收叔丁基甲基醚， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.6g 的萃取液， 加入 3 倍量硅胶， 搅拌， 挥干 ； 把 搅拌样硅胶加到已装好的 10 倍量干硅胶柱上， 硅胶柱径高比为 1 8， 以正戊烷、 乙酸乙酯 为洗脱剂， 梯度洗脱， 分别用正戊烷 - 乙酸乙酯 (4 6) 洗脱 8 倍柱体积， 正戊烷 - 。

38、乙酸乙 酯 (6 4) 洗脱 8 倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加 8 倍量水溶解， 用微波真空干燥， 干燥温 度 45， 回差温度 4， 真空度 -0.05Mpa 以上， 微波功率 35KW) 干燥 130 分钟， 得丹酚酸 A， 测得含量为 95.47。 0042 实施例 8 0043 将含有丹酚酸 A 的洗脱液或提取液用 10盐酸调 pH 值至 2.8， 离心， 上清液减压 浓缩至每 1ml 含丹酚酸 A5mg， 经 HPD-300 大孔树脂柱层析分离， 丹酚酸 A 上样量与大孔吸 附树脂比为 1 45， 树脂柱径高比为 1 10， 分别用 5 倍柱体积水、 6 倍柱体积 20乙醇洗 。

39、脱， 除去杂质， 再用 5 倍柱体积 45乙醇洗脱， HPLC 检测， 收集含有丹酚酸 A 的 45乙醇洗 脱部分， 减压回收乙醇并浓缩至无醇味 ； 水溶液浓缩至每 1ml 含 8mg 丹酚酸 A 的溶液， 通过 聚酰胺层析柱分离， 丹酚酸A上样量与聚酰胺比为112， 树脂柱径高比为18， 分别用3 倍柱体积水、 6 倍柱体积 45乙醇溶液洗脱除杂， 再用 8 倍柱体积 55乙醇溶液洗脱， 收集 含有丹酚酸A的55乙醇溶液部分， 减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液 ； 水溶液用 15盐酸调 pH 至 2.9， 用 5 倍量的叔丁基甲基醚， 分 5 次萃取， 分离有机层， 减压。

40、 回收叔丁基甲基醚， 制成每 1ml 含丹酚酸 A0.6g 的萃取液， 加入 2.5 倍量硅胶， 搅拌， 挥干 ； 把搅拌样硅胶加到已装好的 12 倍量干硅胶柱上， 硅胶柱径高比为 1 8， 以正戊烷、 叔丁基 甲基醚为洗脱剂， 梯度洗脱， 分别用正戊烷 - 叔丁基甲基醚 (4 6) 洗脱 8 倍柱体积， 正戊 烷 - 叔丁基甲基醚 (6 4) 洗脱 8 倍柱体积， 减压回收洗脱剂， 再加 9 倍量水溶解， 用微波 真空干燥， 干燥温度85， 回差温度5， 真空度-0.07Mpa以上， 微波功率60KW， 干燥120分 钟， 得丹酚酸 A， 测得含量为 95.62。 0044 实验例 1 ： 。

41、丹酚酸 A 的大孔吸附树脂纯化 0045 取实施例 1 中含丹酚酸 A 的提取液 13 份， 置预处理好的各型号大孔树脂 100g 中， 摇床动态吸附 8 小时后， 装柱， 依次用水洗洗脱 3 个柱体积、 20乙醇洗脱 5 个柱体积、 70 乙醇洗脱 5 个柱体积， 收集 70乙醇含丹酚酸 A 洗脱液部分， 进行丹酚酸 A 含量测定， 洗脱 液蒸干计算干膏量， 结果见表 1。 0046 表 1. 大孔树脂型号的确认 0047 说 明 书 CN 102993015 B 8 7/9 页 9 0048 0049 结果表明 ： 以上 13 种大孔树脂对丹酚酸 A 的吸附效果良好， 且用不同浓度的乙醇 。

42、梯度洗脱可以很好的去除杂质， 得到含量大于 75的丹酚酸 A 洗脱液。 0050 实验例 2 ： 丹酚酸 A 的柱层析纯化 0051 取上述丹酚酸 A 一次柱色谱溶液 3 份， 置预处理好的各型号树脂 100g 中， 摇床动 态吸附 8 小时后， 装柱， 依次用水洗洗脱 3 个柱体积、 20乙醇洗脱 5 个柱体积、 70乙醇洗 脱 5 个柱体积， 收集 70乙醇洗脱液进行丹酚酸 A 含量测定， 部分洗脱液蒸干计算干膏量， 结果见表 2。 0052 表 2. 树脂型号的确认 0053 0054 结果表明 ： 以上3种树脂对丹酚酸A的吸附效果良好， 且用不同浓度的乙醇梯度洗 脱可以很好的去除杂质，。

43、 得到含量约为 90的丹酚酸 A 洗脱液。 0055 实验例 3 ： 丹酚酸 A 的萃取纯化 说 明 书 CN 102993015 B 9 8/9 页 10 0056 将上述 70乙醇洗脱液减压回收乙醇， 调 pH 值 2.0 4.0， 再用正丁醇、 叔丁基 甲基醚、 乙酸甲酯、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 甲酸乙酯、 乙醇提取 5 次， 分离有机溶剂相， 回收溶 剂， 干燥， 得丹酚酸 A 提取物， 测定丹酚酸 A 含量， 结果见表 3。 0057 表 3. 萃取用有机溶剂的确认 0058 0059 表 3 结果表明 ： 正丁醇由于极性大， 丹酚酸 A 提取物量最多， 但其丹酚酸含量没得 到明显。

44、提高， 乙醚由于极性偏小， 水溶性杂质少， 丹酚酸A含量高， 但得到的丹酚酸A提取物 量少， 其他提取溶剂叔丁基甲基醚、 乙酸甲酯、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 甲酸乙酯得到的丹酚酸 A 提取物量较大， 丹酚酸 A 含量均得到提高。 0060 实验例 4 ： 丹酚酸 A 的硅胶柱层析纯化 0061 取上述丹酚酸 A 二次柱色谱洗脱液 12 份， 每份含丹酚酸 A10g， 用叔丁基甲基醚萃 取后， 分离有机层， 加入20g的硅胶， 搅拌， 挥干 ； 把搅拌样硅胶加到已装好的100g干硅胶柱 上， 分别以石油醚、 正戊烷、 正庚烷、 乙酸乙酯、 乙酸甲酯、 甲酸乙酯、 叔丁基甲基醚组成的两 相溶剂为洗。

45、脱剂， HPLC 或薄层色谱检测， 收集丹酚酸 A 洗脱液， 进行丹酚酸 A 含量测定， 部 分洗脱液蒸干计算干膏量， 结果见表 4。 0062 表 4. 洗脱剂的确认 0063 0064 说 明 书 CN 102993015 B 10 9/9 页 11 0065 结果表明 ： 丹酚酸 A 用正相硅胶柱色谱时， 采用石油醚、 正戊烷、 正庚烷、 乙酸乙 酯、 乙酸甲酯、 甲酸乙酯、 叔丁基甲基醚组成的两相溶剂为洗脱剂， 梯度洗脱， 可以很好的去 除杂质， 得到高纯度的丹酚酸 A 洗脱液。 0066 实验例 5 ： 丹酚酸 A 干燥方法研究 0067 取上述柱色谱洗脱液 4 份， 每份含丹酚酸 A100g， 浓缩至无稠膏状， 加 10 倍量水溶 解后分别采用真空干燥、 冷冻真空干燥、 喷雾干燥、 微波真空干燥得打丹酚酸 A 提取物， 对 该提取物进行检测， 结果见表 5。 0068 表 5. 丹酚酸 A 干燥方法检测结果 0069 0070 结果表明 ： 采用冷冻真空干燥时间过长， 成本过高， 且有机溶剂残留严重 ； 真空干 燥时间略长， 喷雾干燥时间短但瞬间温度较高 ； 微波真空干燥干燥温度低， 时间短， 所得丹 酚酸 A 各项指标良好。 说 明 书 CN 102993015 B 11 。