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发明领域
本发明涉及可用于治疗血管性血友病(von Willebrand Disease，vWD)的因子VIII(FVIII)突变蛋白及其衍生物。FVIII突变蛋白容许在限定位点处偶联至一种或多种生物相容性聚合物诸如聚乙二醇。另外，提供了用于治疗目的的其相关配制剂、剂量、和施用方法。这些经修饰的FVIII变体、及相关组合物和方法可用于为罹患血管性血友病的个体提供具有降低的注射频率和降低的免疫原性响应的治疗选项。
发明背景
vWD是一项描述各种病因学的一簇遗传性或获得性疾病的术语。许多类型的vWD的基础在于von Willebrand因子(vWF)的功能，所述von Willebrand因子(vWF)是一系列多聚体血浆糖蛋白，其除其它特性外还结合促凝血性FVIII，而且延长天然FVIII在血液循环中的半衰期(参见例如Federici，Haemophilia 10(suppl 4)：169，2004；Denis等，Thromb.Haemost.99：271，2008)。在正常人中，FVIII的半衰期是没有vWF情况中的约8分钟和存在vWF情况中的8小时。
在轻度形式(1型)中，vWD是非常常见的，影响着群体中100人中多至1名，而且相等地影响着男性和女性。
2型vWD可以是一种严重形式的vWD，而且已知处于5种亚型：2A、2B、2C、2M和2N。这些之中，2N型以缺乏FVIII对vWF的结合表征。如此，在2N型vWD患者中，FVIII被快速降解，并且循环中的水平是低的。vWF 2N型是由损害对FVIII结合的纯合的或复合杂合的vWF突变引起的。因为不与vWF形成复合物的游离FVIII自循环快速清除，所以vWD 2N伪装为常染色体隐性形式的血友病A。然而，患者通常具有正常水平的vWF抗原和用于vWF-血小板GP1b结合的瑞斯托菌素辅因子活性(vWF:RCo活性)，但降低的FVIII水平。
3型vWD(即Eric von Willebrand最初在一个芬兰人家庭中描述的形式)是vWF的纯合缺乏(缺陷)(deficiency)或双杂合缺乏。vWD 3型是由无义突变或由于进入编码vWF的核酸中的小插入或缺失所致的移码引起的，这导致vWF的完全或几乎完全缺乏。在大多数情况中，vWF:RCo和vWF:Ag是检测不到的，而FVIII水平是深深地降低的。3型vWD患者可以具有关节血肿(hemarthroses)和出血入关节或间隙中，这很像血友病。
获得性vWD通常是由自身免疫清除(这是由于形成抗vWF抗体)、流体剪应力诱导的蛋白酶解或升高的对血小板或其它细胞的结合引起的。获得性vWD综合征与那些vWD 3型的相似，具有降低水平的vWF-Ag、vWF:Rco和FVIII。vWD 3型和获得性vWD患者不仅患有作为vWD特征的粘膜出血，而且还患有作为血友病A特征的软组织、肌肉、和关节出血。
血友病A是最常见的遗传性凝固病症，估计的发病率为每5000名男性1名。它是由FVIII(即血液凝固的固有途径的一种至关重要的成分)的缺乏或结构缺陷引起的。对血友病A的目前治疗牵涉静脉内注射人FVIII。人FVIII已经作为约300kD的单链分子重组生成。它由结构域A1-A2-B-A3-C1-C2构成(Thompson，Semin.Hematol.29：11-22，2003)。前体产物在高尔基体中被加工成200kD(重)和80kD(轻)的两条多肽链，其中两条链通过金属离子保持在一起(Kaufman等，J.Biol.Chem.263：6352，1988；Andersson等，Proc.Natl.Acad.Sci.83：2979，1986)。
FVIII的B域似乎是不必要的，因为B域缺失型FVIII(BDD，90kD A1-A2重链和80kD轻链)也已经显示了作为代替疗法用于血友病A是有效的。B域缺失型FVIII序列含有B域的几乎(all but)14个氨基酸的缺失。
目前，通过在需要时静脉内施用FVIII或作为一周数次施用的预防性疗法来治疗血友病A患者。对于预防性处理，一周三次给予15-25IU/kg体重的FVIII。它是患者中不断需要的。由于其在人中的短半衰期，必须频繁施用FVIII。尽管对于全长蛋白质大于300kD的其较大大小，FVIII具有仅约11小时的人中半衰期(Ewenstein等，Semin.Hematol.41：1-16，2004)。对频繁静脉内注射的需要对患者顺从性产生巨大的障碍。对于患者而言会更方便的是，若可以开发出如下的FVIII产品，其具有较长的半衰期，因此需要频率较少的施用。此外，若增加半衰期，则可以降低治疗成本，这是因为那样可以需要更少的剂量。
目前疗法的别的缺点是约25-30％的患者形成抑制FVIII活性的抗体(Saenko等，Haemophilia 8：1-11，2002)。抑制性抗体的主要表位位于A2域内残基484-508处、A3域内残基1811-1818处、和C2域内。抗体形成阻止FVIII作为代替疗法使用，迫使这组患者寻找用高剂量重组因子VIIa和免疫耐受性疗法进行的甚至更昂贵的治疗。
以下研究鉴定了抑制性抗体的FVIII表位。在25份抑制性血浆样品的研究中，发现11份结合凝血酶生成的73kD轻链片段A3C1C2，4份结合A2域，而10份结合这两者(Fulcher等，Proc.Natl.Acad.Sci.2：7728-32，1985)。在另一项研究中，通过重组A2多肽中和来自患者的8种A2域抑制剂之6种(Scandella等，Blood 82：1767-75，1993)。将来自患者的9种抑制剂之6种的表位定位于A2残基379-538(Scandella等，Proc.Natl.Acad.Sci.85：6152-6，1988)。将18种重链抑制剂的表位定位至A2域的相同的N端18.3kD区(Scandella等，Blood74：1618-26，1989)。
一种活性的、重组杂合人/猪FVIII分子(其通过用同源猪序列替换人A2域残基387-604来生成)对患者A2抑制剂有抗性(Lubin等，J.Biol.Chem.269：8639-41，1994)，而且对与患者A2抑制剂竞争对A2结合的鼠单克隆抗体mAB 413 IgG有抗性(Scandella等，Thromb Haemost.67：665-71，1992)。当实验显示了mAB 413 IgG和4种患者抑制剂不抑制A2域残基484-508用猪的残基替换的杂合人/猪FVIII时，将此A2域表位进一步定位至A2域残基484-508(Healey等，J.Biol.Chem.270：14505-14509，1995)。此杂合FVIII对所筛选23份患者血浆的至少一半还更有抗性(Barrow等，Blood 95：564-568，2000)。丙氨酸扫描诱变将残基487鉴定为对于结合所测试的所有5种患者抑制剂是至关重要的，而残基484、487、489、和492对于与mAB 413 IgG的相互作用都是重要的(Lubin，J.Biol.Chem.272：30191-30195，1997)。接受R484A/R489A/P492A突变体，而非R484A/R489A突变体的小鼠中的抑制性抗体效价显著低于接受对照人BDD FVIII的小鼠中的(Parker等，Blood 104：704-710，2004)。总之，A2域的484-508区似乎是FVIII活性的抑制剂的结合位点。
在形成对FVIII的免疫响应外，关于常规疗法的另一个问题在于它需要频繁的剂量给药，这是由于FVIII在体内的短半衰期。自循环清除FVIII的机制已经进行了研究。
已经将FVIII自循环清除部分归因于对低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)(即一种具有广泛配体特异性的肝清除受体)的特异性结合(Oldenburg等，Haemophilia 10 Suppl 4：133-139，2004)。最近，还显示了低密度脂蛋白(LDL)受体在FVIII清除中起作用，诸如通过在调节FVIII的血浆水平上与LRP协作(Bovenschen等，Blood 106：906-910，2005)。这两种相互作用通过结合细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)来促进。小鼠中的血浆半衰期可以在封闭LRP时延长3.3倍或在封闭LRP和细胞表面HSPG两者时延长5.5倍(Sarafanov等，J.Biol.Chem.276：11970-11979，2001)。假设HSPG浓缩细胞表面上的FVIII，而且将其呈递至LRP。已经将FVIII上的LRP结合位点定位至A2残基484-509(Saenko等，J.Biol.Chem.274：37685-37692，1999)、A3残基1811-1818(Bovenschen等，J.Biol.Chem.278：9370-9377，2003)、和C2域中的表位(Lenting等，J.Biol.Chem.274：23734-23739，1999)。
还通过蛋白酶作用自循环清除FVIII。为了了解此效果，必须了解FVIII牵涉血液凝固的机制。FVIII作为结合vWF的重链和轻链异二聚体循环。vWF结合牵涉FVIII残基1649-1689(Foster等，J.Biol.Chem.263：5230-5234，1998)、和C1(Jacquemin等，Blood 96：958-965，2000)和C2域(Spiegel等，J.Biol.Chem.279：53691-53698，2004)的一部分。FVIII是由凝血酶激活的，所述凝血酶切割残基372、740、和1689后的肽键以生成A1、A2、和A3-C1-C2域的异三聚体(Pittman等，Proc.Natl.Acad.Sci.276：12434-12439，2001)。激活后，FVIII与vWF解离，并通过结合磷脂来浓缩至血小板的细胞表面。磷脂结合牵涉FVIII残基2199、2200、2251、和2252(Gilbert等，J.Biol.Chem.277：6374-6381，2002)。在那里它经由与FVIII残基558-565(Fay等，J.Biol.Chem.269：20522-20527，1994)和1811-1818(Lenting等，J.Biol.Chem.271：1935-1940，1996)的相互作用而结合FIX，并经由与FVIII残基349-372的相互作用而结合FX(Nogami等，J.Biol.Chem.279：15763-15771，2004)，而且充当FIX激活FX(即固有凝固途径的一种重要成分)的辅因子。激活的FVIII(FVIIIa)是由蛋白酶激活蛋白C(APC)经由FVIII残基336和562后的切割部分失活的(Regan等，J.Biol.Chem.271：3982-3987，1996)。然而，失活的主要决定因素是A2域与A1和A3-C1-C2的解离(Fay等，J.Biol.Chem.266：8957-8962，1991)。
一种已经表明增加蛋白质的体内半衰期的方法是PEG化。PEG化是将长链的聚乙二醇(PEG)分子共价附接于蛋白质或其它分子。PEG可以处于线性形式或处于分支形式以产生具有不同特征的不同分子。在增加肽或蛋白质的半衰期外，已经使用PEG化来简化抗体开发，保护蛋白质免于蛋白酶消化，并将材料保持在肾滤液外(Harris等，Clinical Pharmacokinetics 40：539-551，2001)。另外，PEG化还能增加蛋白质的总体稳定性和溶解度。最后，PEG化的蛋白质的持续血浆浓度可以如下降低不利副作用的程度，即降低药物的谷至峰水平，如此消除需要在早期时间点时引入超生理学水平的蛋白质。
已经尝试了通过用大的聚合物诸如PEG和右旋糖苷靶向伯胺(N端和赖氨酸)来随机修饰FVIII，获得了不同程度的成功(WO94/15625、美国专利4970300、美国专利6048720)。1994专利申请(WO94/15625)中公布的最显著改善显示了将全长FVIII与50倍摩尔过量的PEG起反应后的4倍半衰期改善，但是以损失2倍活性为代价。WO2004/075923披露了经由随机修饰创建的FVIII和聚乙二醇的偶联物。在过去，随机PEG化的蛋白质诸如干扰素alpha(Kozlowski等，BioDrugs 15：419-429，2001)已经批准作为治疗剂。
然而，此随机办法对于异二聚体FVIII而言是更加成问题的。FVIII具有数百个潜在的PEG化位点，包括158个赖氨酸、两个N端、和多个组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和酪氨酸，它们都可以用主要靶向伯胺的试剂潜在地PEG化。例如，显示了PEG化的干扰素Alpha-2b的主要位置异构体是组氨酸(Wang等，Biochemistry 39：10634-10640，2000)。此外，对全长FVIII的异质加工可以导致起始材料的混合物，这导致PEG化产物中的进一步复杂性。不控制FVIII上的PEG化位点的别的缺点是潜在的活性降低，若要在重要的活性位点处或附近附接PEG的话，尤其若将超过一个PEG或单个大的PEG偶联至FVIII的话。由于随机PEG化总会生成大量的多PEG化产物，用于仅获得单PEG化产物的纯化会剧烈降低总体产量。最后，产物谱中的巨大异质性会使每批次的一致合成和表征变为几乎不可能。因为良好制造要求一致的、充分表征的产品，产品异质性是商品化的一项障碍。出于所有这些原因，想要用于使FVIIIPEG化的更特异性方法。
已经在最近的综述中汇总了各种定点蛋白质PEG化策略(Kochendoerfer等，Curr.Opin.Chem.Biol.9：555-560，2005)。一种办法牵涉通过化学合成或重组表达将非天然氨基酸掺入蛋白质中，接着添加PEG衍生物，其会特异性与非天然氨基酸起反应。例如，非天然氨基酸可以是含有天然蛋白质中没有找到的酮基的。然而，蛋白质的化学合成对于与FVIII一样大的蛋白质而言是不可行的。肽合成的目前限度是约50个残基。可以连接数个肽以形成较大片段的多肽，但是为了生成即使B域缺失型FVIII也会要求大于20次连接，其即使在理想的反应条件下也会导致小于1％回收。迄今为止，具有非天然氨基酸的蛋白质的重组表达主要限于非哺乳动物表达系统。预期此办法对于需要在哺乳动物系统中表达的大的且复杂的蛋白质诸如FVIII是成问题的。
另一种用于蛋白质的位点特异性PEG化的办法是通过用PEG-醛靶向N端主链胺。然而，相对于其它胺基在此方法下实现特异性所需要的低pH与FVIII稳定性所需要的窄的近中性pH范围不相容(Wang等，Intl.J.Pharmaceutics 259，第1页-第15页，2003)。此外，FVIII的N端PEG化不可导致改善的血浆半衰期，若此区域不牵涉血浆清除的话。
WO90/12874披露了如下位点特异性修饰人IL-3、粒细胞集落刺激因子和红细胞生成素多肽，即插入半胱氨酸或用半胱氨酸取代另一种氨基酸，然后添加具有巯基反应性基团的配体。配体选择性偶联半胱氨酸残基。没有披露对FVIII或其任何变体的修饰。
EP 0 319 315披露了具有导致vWF结合降低的vWF结合位点缺失或改变的FVIII突变蛋白。EP 0 319 315进一步披露了通过施用此类突变蛋白质来缓解源自vWF抑制性活性的FVIII缺陷(deficiency)。
Rottensteiner等披露了对FVIII中的赖氨酸残基的随机化学修饰以与聚乙二醇或聚唾液酸形成偶联物。Blood 110(11)，3150A(2007)。Rottensteiner等进一步提示了经随机修饰的FVIII在vWD 2N型中可以是有用的。
出于上文所陈述的原因，需要如下的改善的FVIII变体，其拥有较大的体内作用持续时间和降低的免疫原性，同时保留功能活性。此外，想要的是，此类蛋白质以一致的方式作为同质产物生成。
发明概述
本发明的目标是提供一种治疗vWD的方法，包括施用偶联有生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其具有改善的药动学特征和治疗特征。
还有，本发明的目标是提供一种用于治疗vWD的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的具有FVIII促凝血活性而且能够改正人FVIII缺陷的偶联物，所述偶联物包含在所述多肽上的一个或多个预定位点处共价附接于一种或多种生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述预定位点是通过所述多肽的氨基酸序列中的数字位置鉴定的特定氨基酸残基，而且不是N端胺。血管性血友病可以以von Willebrand因子的缺乏和/或异常表征。
本发明的另一个目标是提供一种制备用于治疗vWD的药物的方法，包括生成具有FVIII促凝血活性而且能够改正人FVIII缺陷的偶联物，所述偶联物包含在所述多肽上的一个或多个预定位点处共价附接于一种或多种生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述预定位点是通过所述多肽的氨基酸序列中的数字位置鉴定的特定氨基酸残基，而且不是N端胺。
本发明的又一个目标是提供一种用于治疗vWD的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的半胱氨酸取代的FVIII变体，其具有FVIII促凝血活性，而且能够改正人FVIII缺陷，所述变体特征在于FVIII序列中具有取代氨基酸的半胱氨酸残基，其中所述取代在半胱氨酸残基不存在于FVIII中的氨基酸位置处引起半胱氨酸残基，所述氨基酸位置参照成熟的、全长人FVIII氨基酸序列SEQ ID NO：1，所述半胱氨酸添加的变体的进一步特征在于具有共价附接于所述取代半胱氨酸残基的生物相容性聚合物。
本发明的另一个目标是提供一种用于治疗vWD的方法，包括对有所需要的受试者施用具有改善的药动学特性的偶联有生物相容性聚合物的B域缺失型FVIII蛋白。
本发明的又一个目标是提供一种用于治疗vWD的方法，包括对有所需要的受试者施用偶联有生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其具有降低的对低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)、低密度脂蛋白(LDL)受体、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)和/或针对FVIII的抑制性抗体的结合。
本发明的又一个目标是提供一种用于治疗vWD的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的拥有较大的体内作用持续时间和降低的免疫原性的改善的FVIII变体，其能够以一致的方式作为同质产物生成。
在本发明的一方面，提供了一种用于治疗vWD的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的具有FVIII促凝血活性的偶联物，其包含在所述多肽上的一个或多个预定位点处共价附接于一种或多种生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述预定位点不是N端胺。
在本发明的另一方面，提供了一种用于在手术前预防性处理的方法，包括在手术前对受试者施用治疗有效量的具有FVIII促凝血活性而且能够改正人FVIII缺陷的偶联物，由此减弱发作性出血(episodic bleeding)，所述偶联物包含在所述多肽上的一个或多个预定位点处共价附接于一种或多种生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述预定位点是通过所述多肽的氨基酸序列中的数字位置鉴定的特定氨基酸残基，而且不是N端胺。所述受试者可以患有vWD，例如3型vWD。有利地，在手术前24小时内、优选地8小时内、最优选地手术前0.5-2小时施用偶联物。
在本发明的又一方面，提供了一种用于治疗外伤的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的具有FVIII促凝血活性而且能够改正人FVIII缺陷的偶联物，由此减弱发作性出血，所述偶联物包含在所述多肽上的一个或多个预定位点处共价附接于一种或多种生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述预定位点是通过所述多肽的氨基酸序列中的数字位置鉴定的特定氨基酸残基，而且不是N端胺。所述受试者可以患有vWD，例如3型vWD。
附图简述
图1：PEG化的FVIII在vWD敲除(KO)小鼠中将FVIII半衰期恢复至正常的效果。该图显示了i)对vWF KO小鼠施用rFVIII(实心圆圈)，ii)对FVIII KO小鼠施用rFVIII(空心圆圈)，iii)对vWF KO小鼠施用PEG化的rFVIII(64kDPEG14，实心正方形)，和iv)对vWF KO小鼠施用不同PEG化的rFVIII(64kDPEG2+14，实心三角形)后的血浆FVIII活性的时间过程。
发明详述
本发明基于如下的发现，即可以在不在N端胺处的预定位点处将具有FVIII活性的多肽共价附接于生物相容性聚合物，及此类多肽基本上保留其促凝血活性。此外，这些多肽偶联物具有改善的循环时间和降低的免疫原性。
本发明进一步基于如下的发现，即在预定位点处与生物相容性聚合物共价连接的FVIII突变蛋白在缺乏vWF的受试者的循环中具有比未修饰的FVIII长的促凝血活性半衰期。使用本发明的偶联物来治疗基本上缺乏vWF的受试者可以比使用具有与FVIII随机聚合物附接或在N端处附接的现有技术偶联物有利。定点附接容许设计避免生物学活性所需要的区域，由此维持本质性FVIII活性的修饰。它还容许设计为附接聚合物以阻断牵涉FVIII清除的位点处的结合。定点附接还容许一致的产物，而不是本领域中通过随机聚合物偶联生成的异质偶联物。通过避免在轻链的N端胺处的附接，本发明的偶联物避免来自在FVIII多肽的活性位点处附接配体的可能的活性损失。
定义
生物相容性聚合物。生物相容性聚合物包括聚环氧烷烃诸如但不限于聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷(dextrans)、多聚乙酰神经氨酸或其它基于碳水化合物的聚合物(colominic acids or other carbohydrate based polymers)、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸盐(polycarboxylates)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-马来酸酐(polyethylene-co-maleic acid anhydride)、聚苯乙烯-共-苹果酸酐(polystyrene-co-malic acid anhydride)、聚唑啉(polyoxazoline)、聚丙烯酰吗啉(polyacryloylmorpholine)、肝素、清蛋白、纤维素、壳聚糖的水解产物、淀粉诸如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶(guar gum)、普鲁分支葡聚糖(pullulan)、菊粉(inulin)、黄胞胶(xanthan gum)、角叉藻聚糖(carrageenan)、果胶、褐藻酸水解产物、其它生物聚合物及其任何等同物。聚合物的例子是聚乙二醇诸如甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚亚烷基二醇化合物是聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(PEG-oxycarbonylimidazole)(CDI-PEG)、分支的聚乙二醇、线性聚乙二醇、叉状的聚乙二醇和多臂的或“超分支的”聚乙二醇(星型-PEG)。聚乙二醇(PEG)。如本文中所使用的，“PEG”和“聚乙二醇”可互换，包括任何水溶性聚(环氧乙烷)。通常，依照本发明使用的PEG包含以下结构“--(OCH2CH2)n--”，其中(n)是2至4000。如本文中所使用的，PEG还包括“--CH2CH2--O(CH2CH2O)n--CH2CH2--”和“-(OCH2CH2)nO--”，这取决于末端氧是否已经置换。遍及整个说明书和权利要求书，应当记住，术语“PEG”包括具有各种末端或“末端加帽”基团，诸如但不限于羟基或C1-20烷氧基基团的结构。术语“PEG”还指含有大多数(即大于50％)--OCH 2CH2--重复亚基的聚合物。关于具体的形式，PEG可以采用任何数目的多种分子量，以及结构或几何学诸如分支的、线性的、叉状的、和多功能性的。
PEG化。PEG化是一种由此将聚乙二醇(PEG)共价附接于分子诸如蛋白质的方法。
激活的或活性的功能团。在将功能团诸如生物相容性聚合物描述为激活的时，该功能团容易与另一分子上的亲电体或亲核体起反应。
B域缺失型FVIII(BDD)。如本文中所使用的，BDD的特征在于具有含有FVIII B域的几乎14个氨基酸的缺失的氨基酸序列。B域的前4个氨基酸(SFSQ，SEQ ID NO：2)与B域的后10个残基(NPPVLKRHQR，SEQ ID NO：3)连接(Lind等，Eur.J.Biochem.232：19-27，1995)。本文中所使用的BDD具有氨基酸序列SEQ ID NO：4。BDD多肽的例子记载于WO 2006/053299，通过提及而将其收入本文。
FVIII。血液凝固因子VIII(FVIII)是一种由肝合成并释放入血流中的糖蛋白。在循环的血液中，它结合von Willebrand因子(vWF，又称为FVIII相关抗原)以形成稳定的复合物。由凝血酶激活后，它与复合物解离以与凝固级联中的其它凝固因子相互作用，这最后导致形成血栓。人全长FVIII具有氨基酸序列SEQ ID NO：1，虽然等位变体是有可能的。
功能性FVIII多肽。如本文中所使用的，功能性FVIII多肽表示能够在体内或在体外改正例如以血友病A表征的人FVIII缺陷的功能性多肽或多肽组合。FVIII在自然状态中具有多种降解或加工形式。这些是以蛋白水解方式自前体，即单链蛋白质衍生的，如本文中所表明的。功能性FVIII多肽包括此类单链蛋白质，而且还提供了这些各种降解产物，它们具有改正人FVIII缺陷的生物学活性。可能存在等位变异。功能性FVIII多肽包括产生FVIII衍生物的所有此类等位变异、糖基化型式、修饰和片段，只要它们含有人FVIII的功能区段，而且本质的、特征性的人FVIII功能活性在种类上保持不受影响。可以容易地通过本文中所描述的直接体外测试来鉴定那些拥有必要功能活性的FVIII衍生物。此外，功能性FVIII多肽能够在存在FIXa、钙、和磷脂的情况中催化因子X(FX)转化为FXa，以及改正自血友病A受累个体衍生的血浆中的凝固缺陷。从人FVIII氨基酸序列的序列和本文中功能区的公开内容看，可以经由对DNA的限制酶切割或对人FVIII蛋白的蛋白水解或其它降解衍生的片段对于本领域技术人员会是显而易见的。功能性FVIII多肽的例子记载于WO 2006/053299，通过提及而将其收入本文。
FIX。如本文中所使用的，FIX指凝固因子IX，其又称为人凝固因子IX，或血浆促凝血酶原激酶成分。
FX。如本文中所使用的，FX指凝固因子X，其又以名称人凝固因子X及以名祖斯图亚特因子(Stuart-Prower factor)知名。
药动学。“药动学”(“PK”)是一项用于描述药物在身体中的吸收、分布、代谢、和消除的特性的术语。对药物药动学的改良指那些使药物在体内作为治疗剂更有效的特征，尤其在身体中的其有用的持续时间的改善。
突变蛋白质。突变蛋白质是一种由于对蛋白质或多肽的实验室诱导的突变生成的经遗传工程化改造的蛋白质。
蛋白质。如本文中所使用的，蛋白质和多肽是同义词。
FVIII清除受体。如本文中所使用的，FVIII清除受体指功能性FVIII多肽上结合或联合一种或多种其它分子以导致FVIII自循环清除的受体区。FVIII清除受体包括但不限于FVIII分子中结合LRP、LDL受体和/或HSPG的区域。
预想可以在预定的位点处突变任何功能性FVIII多肽，然后在所述位点处共价附接于依照本发明方法的生物相容性聚合物。有用的多肽包括但不限于具有如SEQ ID NO：1中所显示的氨基酸序列的全长FVIII和具有如SEQ IDNO：4中所显示的氨基酸序列的BDD FVIII。
本发明偶联物中所使用的生物相容性聚合物可以是上文所讨论的任何聚合物。生物相容性聚合物选择为提供想要的药动学改善。例如，选择聚合物的身份、大小和结构以改善具有FVIII活性的多肽的循环半衰期或降低多肽的抗原性而没有不可接受的活性降低。聚合物可以包含PEG，而且作为一个例子，可以具有作为PEG的至少50％的其分子量。在一个实施方案中，聚合物是用末端加帽模块诸如羟基、烷氧基、取代烷氧基、烯氧基、取代烯氧基、炔氧基(alkynoxy)、取代炔氧基、芳氧基和取代芳氧基末端加帽的聚乙二醇。在另一个实施方案中，聚合物可以包含甲氧基聚乙二醇。在别的实施方案中，聚合物可以包含具有大小范围为3kD至100kD、或5kD至64kD、或5kD至43kD的甲氧基聚乙二醇。
聚合物可以具有反应性模块。例如，在一个实施方案中，聚合物具有能与功能性FVIII多肽上的游离半胱氨酸起反应以形成共价连接的巯基反应性模块。此类巯基反应性模块包括硫醇、三氟甲烷磺酸基(triflate)、三氟乙基磺酸基(tresylate)、氮丙啶(aziridine)、环氧乙烷、S-吡啶基、或马来酰亚胺模块。在一个实施方案中，聚合物是线性的，而且具有在一端的不对巯基强反应性的“帽”(诸如甲氧基)和在另一端的巯基反应性模块。在一个实施方案中，偶联物包含PEG-马来酰亚胺，而且具有5kD至64kD的大小范围。
随后的例子中提供了关于选择有用的生物相容性聚合物的进一步指导。
可以通过本领域中已知的任何方法来发生编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列的定点突变。方法包括诱变以在选择用于共价附接聚合物的位点处引入半胱氨酸密码子。这可以使用商品化定点诱变试剂盒诸如StratagenecQuickChangeTM II定点诱变试剂盒、Clontech Transformer定点诱变试剂盒号K1600-1、Invitrogen GenTaylor定点诱变系统号12397014、Promega AlteredSites II体外诱变系统试剂盒号Q6210、或Takara Mirus Bio LA PCR诱变试剂盒号TAK RR016来实现。
可以如下制备本发明的偶联物，即首先用半胱氨酸密码子替换功能性FVIII多肽表面上的一个或多个氨基酸的密码子，在重组表达系统中生成半胱氨酸突变蛋白质，将突变蛋白质与半胱氨酸特异性聚合物试剂起反应，并纯化突变蛋白质。
在此系统中，可以经由聚合物上的马来酰亚胺活性功能性来实现半胱氨酸位点处的聚合物添加。下文提供了此技术的例子。所使用的巯基反应性聚合物的量应当与要衍生化的半胱氨酸的摩尔量至少等摩尔，而且优选地过量存在。作为一个例子，使用至少5倍摩尔过量的巯基反应性聚合物，或者使用至少10倍过量的此类聚合物。可用于共价附接的其它条件在本领域技术人员的技术范围内。
在随后的例子中，以本领域中常规的方式命名突变蛋白质。用于命名突变蛋白质的约定基于如SEQ ID NO：1中所提供的成熟的、全长FVIII的氨基酸序列。作为分泌性蛋白质，FVIII含有在翻译过程期间以蛋白水解方式切割的信号序列。除去19个氨基酸的信号序列后，分泌性FVIII产物的第一个氨基酸是丙氨酸。
如作为常规的和本文中所使用的，在提及BDD FVIII中的突变氨基酸时，突变氨基酸以其在全长FVIII序列中的位置指明。例如，下文所讨论的PEG6突变蛋白称作K1808C，因为它将与全长序列中第1808位相似位置处的赖氨酸(K)改变为半胱氨酸(C)。
用于共价结合聚合物的预定位点最好选自多肽表面上暴露的不牵涉FVIII活性的位点。此类位点还最好选自那些已知牵涉FVIII失活或自循环清除的机制的位点。在下文更为详细地讨论了这些位点的选择。优选的位点包括(a)低密度脂蛋白受体相关蛋白、(b)硫酸肝素蛋白聚糖、(c)低密度脂蛋白受体、和/或(d)FVIII抑制性抗体的结合位点中或附近的氨基酸残基。“结合位点中或附近”指与结合位点足够接近以使生物相容性聚合物共价附接于该位点会导致结合位点的位阻的残基。例如，预期此类位点在结合位点的内。
在本发明的一个实施方案中，将生物相容性聚合物在下列结合位点中或附近的氨基酸残基处共价附接于功能性FVIII多肽：(a)能够降解FVIII的蛋白酶的结合位点和/或(b)FVIII抑制性抗体的结合位点。蛋白酶可以是活化的蛋白C(APC)。在另一个实施方案中，将所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的预定位点处共价附接，使得低密度脂蛋白受体相关蛋白对所述多肽的结合小于未将所述多肽偶联时对其的结合，例如，小2倍以上。在一个实施方案中，将所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的预定位点处共价附接，使得硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对所述多肽的结合小于未将所述多肽偶联时对其的结合，例如，小2倍以上。在一个别的实施方案中，将所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的预定位点处共价附接，使得FVIII抑制性抗体对所述多肽的结合小于未将所述多肽偶联时对其的结合，例如，比未将所述多肽偶联时对其的结合小2倍以上。在另一个实施方案中，将所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的预定位点处共价附接，使得低密度脂蛋白受体对所述多肽的结合小于未将所述多肽偶联时对其的结合，例如，小2倍以上。在另一个实施方案中，将所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的预定位点处共价附接，使得血浆蛋白酶比未将所述多肽偶联时更少地降解所述多肽。在一个别的实施方案中，所述血浆蛋白酶对所述多肽的降解比未将所述多肽偶联时对其的降解小2倍以上，如在相同时间期限里在相同条件下测量的。
可以使用表面等离振子共振技术(Biacore)来测定对FVIII的LRP、LDL受体、或HSPG结合亲和力。例如，可以将FVIII直接或经由FVIII抗体间接包被至BiacoreTM芯片，并可以让不同浓度的LRP在芯片上通过以测量相互作用的结合速率和解离速率两者(Bovenschen等，J.Biol.Chem.278：9370-9377，2003)。两种速率的比率给出亲和力的测量。PEG化后亲和力降低2倍、5倍、10倍、或30倍会是想要的。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测量蛋白酶APC对FVIII的降解。
在一个实施方案中，方法包括施用在下组FVIII氨基酸位置之一处或多处共价附接于多肽的生物相容性聚合物：第81位、第129位、第377位、第378位、第468位、第487位、第491位、第504位、第556位、第570位、第711位、第1648位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804、第1808位、第1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091位、第2118位和第2284位。在另一个实施方案中，将生物相容性聚合物在下组FVIII氨基酸位置之一处或多处共价附接于多肽：第377位、第378位、第468位、第491位、第504位、第556位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804、第1808位、第1810位、第1864位、第1903、第1911位、和第2284位，而且(1)偶联物对低密度脂蛋白受体相关蛋白的结合小于未偶联多肽对所述低密度脂蛋白受体相关蛋白的结合；(2)所述偶联物对低密度脂蛋白受体的结合小于未偶联多肽对所述低密度脂蛋白受体的结合；或(3)所述偶联物对低密度脂蛋白受体相关蛋白和低密度脂蛋白受体两者的结合小于所述未偶联多肽对所述低密度脂蛋白受体相关蛋白和所述低密度脂蛋白受体的结合。
在一个别的实施方案中，方法包括施用在下组FVIII氨基酸位置之一处或多处共价附接于所述多肽的生物相容性聚合物：第377位、第378位、第468位、第491位、第504位、第556位和第711位，而且偶联物对硫酸肝素蛋白聚糖的结合小于未偶联多肽对硫酸肝素蛋白聚糖的结合。在一个别的实施方案中，将所述生物相容性聚合物在下组FVIII氨基酸位置之一处或多处共价附接于所述多肽：第81位、第129位、第377位、第378位、第468位、第487位、第491位、第504位、第556位、第570位、第711位、第1648位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804位、第1808位、第1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091位、第2118位和第2284位，而且偶联物具有比未偶联多肽小的对FVIII抑制性抗体的结合。在一个别的实施方案中，将所述生物相容性聚合物在下组FVIII氨基酸位置之一处或多处共价附接于所述多肽：第81位、第129位、第377位、第378位、第468位、第487位、第491位、第504位、第556位、第570位、第711位、第1648位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804位、第1808位、第1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091位、第2118位和第2284位，例如，在第377位、第378位、第468位、第491位、第504位、第556位、和第711位之一处或多处，而且偶联物具有比未偶联多肽少的来自能够FVIII降解的血浆蛋白酶的降解。血浆蛋白酶可以是活化的蛋白C。
在一个别的实施方案中，方法包括施用在下组氨基酸位置共价附接于B域缺失型FVIII的生物相容性聚合物：第129位、第491位、第1804位、和/或第1808位。在一个别的实施方案中，将所述生物相容性聚合物在FVIII氨基酸位置1804处附接于所述多肽，而且所述生物相容性聚合物包含聚乙二醇。一个或多个供生物相容性聚合物附接用的预定位点可以受位点特异性半胱氨酸突变控制。
功能性FVIII多肽上的一个或多个位点(例如1或2个)可以是供聚合物附接用的预定位点。在具体的实施方案中，多肽是单PEG化的或二PEG化的。
本发明还涉及一种用于制备偶联物的方法，包括突变编码功能性FVIII多肽的核苷酸序列以在预定位点处用半胱氨酸残基的编码序列取代；表达突变核苷酸序列以生成半胱氨酸升高的突变蛋白质；纯化突变蛋白质；使突变蛋白质与已经活化的生物相容性聚合物起反应以基本上仅在还原性半胱氨酸残基处与多肽起反应，从而形成偶联物；并纯化该偶联物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于FVIII突变蛋白的定点PEG化的方法，包括：(a)表达定点FVIII突变蛋白，其中所述突变蛋白具有FVIII突变蛋白的暴露表面上的氨基酸残基的半胱氨酸取代，而且所述半胱氨酸是加帽的；(b)在轻度还原半胱氨酸突变蛋白质并释放帽的条件下使半胱氨酸突变蛋白质与还原剂接触；(c)自半胱氨酸突变蛋白质除去帽和还原剂；并(d)在除去还原剂后至少约5分钟、至少15分钟、至少30分钟，在使得生成PEG化的FVIII突变蛋白的条件下用包含巯基偶联模块的PEG处理半胱氨酸突变蛋白质。PEG的巯基偶联模块选自下组：硫醇、三氟甲烷磺酸基、三氟乙基磺酸基、氮丙啶、环氧乙烷、S-吡啶基、或马来酰亚胺模块。
本发明还关注用于胃肠外施用的药物组合物，其包含治疗有效量的本发明偶联物和药学可接受赋形剂。药学可接受赋形剂是可以添加到活性成分以帮助配制或稳定化制剂，而不对患者引起显著不利毒物学效果的物质。此类赋形剂的例子是本领域技术人员公知的，包括水、糖诸如麦芽糖或蔗糖、清蛋白、盐等。其它赋形剂由E.W.Martin记载于例如Remington’s PharmaceuticalSciences。此类组合物会含有有效量的其偶联物以及合适量的媒介物，以便制备适合于对宿主有效施用的药学可接受组合物。例如，可以以可随出血事件的严重性而变化的剂量对罹患血友病A的受试者胃肠外施用偶联物。对血友病A静脉内施用的平均剂量范围为对于手术前适应症为每千克40个单位、对于微小出血为每千克15至20个单位、和对于维持剂量为8小时期间里施用的每千克20至40个单位。对于治疗vWD，剂量可以是每千克25-400IU。其它对于vWD有用的剂量是25-50、25-100、50-75、50-100、100-200、150-200、200-300、250-300、300-350、300-400、25-250、100-400和200-400IU/kg。较低剂量可用于预防，而较高剂量可用于具有FVIII抑制剂的患者中的免疫耐受性诱导。
在一个实施方案中，发明的方法牵涉用半胱氨酸替换一个或多个表面BDD氨基酸，在哺乳动物表达系统中生成半胱氨酸突变蛋白质，还原已经在表达过程中由来自生长培养基的半胱氨酸加帽的半胱氨酸，除去还原剂以容许BDD二硫化物再形成，并与半胱氨酸特异性生物相容性聚合物试剂，诸如诸如PEG-马来酰亚胺起反应。此类试剂的例子是具有诸如5、22、或43kD的PEG大小分别以Nektar产品目录编号2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000Da、2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20kD、2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40kD可购自圣卡洛斯(San Carlos)，CA的Nektar Therapeutics或具有诸如12或33kD的PEG大小分别以NOF产品目录编号Sunbright ME-120MA和SunbrightME-300MA可购自NOF Corporation，东京，日本的PEG-马来酰亚胺。PEG化的产物使用离子交换层析来纯化以除去未反应的PEG，并使用大小排阻层析来除去未反应的BDD。可以使用此方法来鉴定并选择性防护与FVIII的任何不利相互作用，诸如受体介导的清除、抑制性抗体结合、和蛋白水解酶的降解。我们注意到，由Nektar或NOF作为5kD供应的PEG试剂在我们的实验室中测试为6kD，而且类似地，在我们的实验室中，作为线性20kD供应的PEG试剂测试为22kD，作为40kD供应的测试为43kD，而作为60kD供应的测试为64kD。为了避免混淆，我们在本文中的讨论中使用如我们实验室中所测试的分子量，除5kD PEG外，我们将其报告为5kD，如制造商将其鉴定的。
在BDD的第491位和第1808位半胱氨酸突变(上文所公开的)外，将第487位、第496位、第504位、第468位、第1810位、第1812位、第1813位、第1815位、第1795位、第1796位、第1803位、和第1804位突变为半胱氨酸以潜在地容许PEG化后阻断LRP结合。还有，将第377位、第378位、和第556位突变为半胱氨酸以容许PEG化后阻断LRP和HSPG结合两者。第81位、第129位、第422位、第523位、第570位、第1864位、第1911位、第2091位、和第2284位选择为在BDD上相等地间隔，从而这些位置处用大的PEG(大于40kD)的定点PEG化以及天然糖基化位点(41、239、和2118)和LRP结合位点处的PEG化应当完全覆盖BDD的表面，并鉴定关于BDD的新的清除机制。
在一个实施方案中，细胞培养基含有通过形成二硫键为突变蛋白质上的半胱氨酸残基“加帽”的半胱氨酸。在偶联物的制备中，用来自培养基的半胱氨酸为重组系统中生成的半胱氨酸突变蛋白质加帽，并通过释放帽的轻度还原来除去此帽，之后添加半胱氨酸特异性聚合物试剂。也可以使用本领域中已知用于FVIII的位点特异性突变的其它方法，其对于本领域技术人员会是显而易见的。
FVIII的结构活性相互关系分析
FVIII和BDD FVIII是具有许多牵涉生物学反应的不同位点的非常大的复杂分子。先前尝试共价修饰它们以改善药动学特性，这具有混合的结果。令人惊讶的是，可以将分子特异性突变，然后以位点特异性方式添加聚合物。此外，鉴于引起非特异性添加和活性降低的关于过去聚合物偶联物的问题，改善的药动学特性和保留的活性结果也是令人惊讶的。
在一个实施方案中，本发明关注使用半胱氨酸特异性配体诸如PEG-马来酰亚胺进行的定点诱变。非突变BDD没有任何可用的半胱氨酸来与PEG-马来酰亚胺起反应，因此仅突变的半胱氨酸位置会是PEG化的位点。更具体地，BDD FVIII具有19个半胱氨酸，其中16个形成二硫化物，而其中另3个是游离的半胱氨酸(McMullen等，Protein Sci.4：740-746，1995)。BDD的结构模型提示了所有3个游离的半胱氨酸是掩埋的(Stoliova-McPhie等，Blood 99：1215-1223，2002)。因为氧化的半胱氨酸不能通过PEG-马来酰亚胺来PEG化，所以不能在不首先进行还原的情况中PEG化在BDD中形成二硫化物的16个半胱氨酸。基于BDD的结构模型，BDD中的3个游离半胱氨酸在不首先使蛋白质变性以将这些半胱氨酸暴露于PEG试剂的情况中不能被PEG化。如此，似乎不可行的是，在不显著改变BDD结构的情况中通过在天然半胱氨酸残基处进行PEG化来实现BDD的特异性PEG化，所述显著改变BDD结构最可能会破坏其功能。
全长FVIII B域中的4个半胱氨酸的氧化还原状态是未知的。B域中的4个半胱氨酸的PEG化可以是有可能的，若它们不形成二硫化物，而且是表面暴露的话。然而，因为全长FVIII和BDD具有相似的药动学(PK)谱(profile)和相似的体内半衰期(Gruppo等，Haemophilia 9：251-260，2003)，所以B域PEG化不可能导致改善的血浆半衰期，除非PEG恰好还保护非B域区。
为了在具有FVIII活性的多肽上确定预定的位点以进行会保留FVIII活性并改善药动学的聚合物附接，基于BDD FVIII来呈现以下准则。修饰应当靶向清除、失活、和免疫原性机制诸如LRP、HSPG、APC、和抑制性抗体结合位点。Stoilova-McPhie等，(Blood 99：1215-23，2002)显示了BDD的结构。例如，为了延长半衰期，可以在A2残基484-509和A3残基1811-1818中的LRP结合位点处或附近的特定位点处引入单个PEG。这些位点处庞大的PEG的引入应当破坏FVIII结合LRP的能力，而且降低FVIII自循环的清除。还认为为了延长半衰期而不显著影响活性，可以在残基1648处引入PEG，所述残基1648在全长分子中的B域与A3域的接合处和BDD的A2和A3域之间的14个氨基酸的接头I中。
可以使用重组DNA诱变技术来将单个半胱氨酸残基工程化改造入A2或A3域中，接着用半胱氨酸特异性PEG试剂诸如PEG-马来酰亚胺对引入的半胱氨酸进行位点特异性PEG化，从而实现PEG化的特异性。484-509和1811-1818处的PEG化的另一项优点是这两个表位代表患者中三类主要抑制性抗原性位点之两种。为了实现改善的循环半衰期和免疫原性响应降低的最大效果，可以将A2和A3LRP结合位点都进行PEG化以产生二PEG化的产物。应当注意到，1811-1818区内的PEG化可以导致显著的活性损失，因为此区域还牵涉FIX结合。558-565内的定点PEG化应当消除HSPG结合，但是也可以降低活性，因为此区域还结合FIX。
可以对别的表面位点进行PEG化以鉴定新的FVIII清除机制。A2域的PEG化可以提供别的优点，其在于A2域在激活后与FVIII解离，而且推测由于其大小更小而比FVIII分子的剩余部分更快地自循环除去。另一方面，PEG化的A2可以大得足以逃脱肾清除，而且具有与FVIII的剩余部分相当的血浆半衰期，并且如此可以在体内重建激活的FVIII。
A2和A3区中PEG化位点的鉴定。选择假定的A2LRP结合区处或附近的5个位置(与PEG1-5位置对应的Y487、L491、K496、L504和Q468)作为用于定点PEG化的例子，这基于高的表面暴露和其Cα至Cβ轨迹的向外方向进行。此外，这些残基在该分子的三维结构中彼此是大致等距离的，因此它们可以共同代表这整个区域。选择假定的A3LRP结合区处或附近的8个位置(与PEG6-14对应的1808、1810、1812、1813、1815、1795、1796、1803、1804)作为用于定点PEG化的例子。PEG6(K1808)与1811-1818和1810处的天然N连接的糖基化位点邻近。第1810位PEG化(PEG7)会用PEG替换糖。PEG8位置T1812处的突变也会消除糖基化位点。虽然预测PEG9位置(K1813)向内指向，但是在结构模型不正确的情况中选择它。PEG10(Y1815)是一种在LRP结合环内的庞大的疏水性氨基酸，而且可以是一种至关重要的相互作用残基，因为通常在蛋白质-蛋白质相互作用中央找到疏水性氨基酸。因为已经报告了1811-1818区牵涉LRP和FIX结合两者，可能认为此环内的PEG化导致活性降低。如此，PEG11-PEG14(1795、1796、1803、1804)设计为接近1811-1818环，但不在环内，因此可以用不同PEG大小来分离LRP和FIX结合。
为了同时封闭这两个LRP结合位点，可以产生在例如PEG2和PEG6位置处的双PEG化。
因为已经显示了558-565区结合HSPG和FIX两者，所以不在此区域内设计位点。取而代之，在A2LRP和HSPG结合区之间设计PEG15-PEG17(377、378、和556)，使得附接的PEG可以干扰这两种相互作用，而且破坏它们之间可能的相互作用。也可以在LRP和HPSG结合区内或附近选择别的表面暴露的且向外指向的位点。为了鉴定新的清除机制，可以系统地将FVIII进行PEG化。在PEG1-17外，可以使用与PEG18-20对应的三个其它天然糖基化位点，即N41、N239、和N2118作为PEG化的拴系点，因为它们应当是表面暴露的。在vWF、FIX、FX、磷脂、和凝血酶的功能性相互作用位点外，将距PEG2、PEG6、和4个糖基化位点的Cβ原子20埃半径内的表面积定位至BDD模型上。
然后选择与Y81、F129、K422、K523、K570、N1864、T1911、Q2091、和Q2284对应的PEG21-29，这基于其覆盖几乎整个剩余的距其每个Cβ原子具有20埃半径的BDD表面的能力进行。选择这些位置，还因为它们是完全暴露的、向外指向的、而且远离天然的半胱氨酸以使可能的不正确二硫化物形成最小化。选择20埃半径，因为预期大的PEG诸如64kD分支的PEG具有覆盖具有约20埃半径的球体的潜力。PEG21-29以及PEG2和PEG6和糖基化位点PEG18、19、和20的PEG化有可能保护几乎整个FVIII的非功能性表面。
可以组合导致增强的特性诸如改善的PK谱、较大的稳定性、或降低的免疫原性的PEG化位置以产生具有最大增强特征的多PEG化的产物。分别通过除去A2和A3域中暴露的二硫化物来设计PEG30和PEG31。PEG30或C630A应当释放其二硫化物配偶C711以进行PEG化。同样地，PEG31，即C1899A应当容许C1903进行PEG化。
实施例
为了本发明可以得到更好的理解，列出了以下实施例。这些实施例仅为了例示目的，而不要以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中所提及的所有出版物。
实施例1：诱变
可以通过在选择用于PEG化的位点处引入半胱氨酸密码子来生成用于FVIII的定点PEG化的底物。使用Stratagene cQuickChangeTM II定点诱变试剂盒来生成所有PEG突变蛋白(Stratagene Corporation，La Jolla，CA)。使用DNA聚合酶和温度循环仪来进行cQuikChangeTM定点诱变法。使用(其不会置换引物)来延伸含有期望突变的两种互补寡核苷酸引物。使用含有野生型FVIII基因的dsDNA作为模板。多轮延伸循环后，用DpnI内切核酸酶消化产物，所述DpnI内切核酸酶对甲基化的DNA是特异性的。新合成的DNA(含有突变)是未甲基化的，而亲本野生型DNA是甲基化的。然后使用经消化的DNA来转化XL-1Blue超级感受态细胞。
在pSK207+BDD C2.6或pSK207+BDD中进行诱变反应。FVIII的定点诱变、突变蛋白质的纯化、PEG化、和活性测量的描述可以参见WO2006/053299，通过提及而将其收入本文。表1中提供了突变蛋白质的汇总。
表1
突变 突变蛋白质ID Y487C PEG1 L491C PEG2 K496C PEG3 L504C PEG4 Q468C PEG5 K1808C PEG6 N1810C PEG7 T1812C PEG8 K1813C PEG9 Y1815C PEG10
D1795C PEG11 Q1796C PEG12 R1803C PEG13 K1804C PEG14 L491C/K1808C PEG2+6 L491C/K1804C PEG2+14 K377C PEG15 H378C PEG16 K556C PEG17 N41C PEG18 N239C PEG19 N2118C PEG20 Y81C PEG21 F129C PEG22 K422C PEG23 K523C PEG24 K570C PEG25 N1864C PEG26 T1911C PEG27 Q2091C PEG28 Q2284C PEG29 C630A PEG30 C1899A PEG31
实施例2：vWF结合ELISA。
容许FVIII结合溶液中的严重血友病血浆中的vWf。然后将FVIII-vWf复合物在已经用vWf特异性单克隆抗体包被的微量滴定板上捕获。用FVIII多克隆抗体和辣根过氧化物酶抗兔偶联物检测与vWf结合的FVIII。偶联有过氧化物酶的抗体复合物在添加底物后产生颜色反应。使用四参数拟合模型自标准曲线插入样品浓度。按μg/mL报告FVIII结合结果。PEG化后对任何活性没有显著影响，这会与B域处的PEG化一致。结果可以参见表2。
表2
实施例3：药动学活性
在FVIII敲除(KO)小鼠中测定PEG化的FVIII和B域缺失型FVIII(BDD-FVIII)的PK。小鼠接受200IU/kg BDD-FVIII、108IU/kg在氨基酸位置1804处引入的半胱氨酸突变处偶联有64kD PEG(64kD PEG14)的BDD-FVIII、或194IU/kg在第491位和第1804位的半胱氨酸突变之每处偶联有64kD PEG(64kD PEG2+14)的BDD-FVIII的静脉内(i.v)注射。在5分钟、4小时、8小时、16小时、24小时、32小时、和48小时时自经处理的小鼠(5只小鼠/处理/时间点)收集血液样本。通过Coatest测定法来测定血浆FVIII活性。通过WinNonLin中活性对时间曲线的非室建模来测定终末半衰期。鉴于BDD-FVIII在FVIII KO小鼠中的t1/2是6小时，偶联有64kD PEG(64kD PEG14)或128kD PEG(64kD PEG2+14)的FVIII的t1/2分别是12.43小时和12.75小时。因此，与FVIII KO小鼠中的BDD-FVIII相比，PEG化的FVIII的半衰期增加约2倍。
循环中vWF的缺乏消除对PEG化的FVIII的半衰期延长的限制，如vWFKO小鼠中所表明的。通过i.v施用200IU/kg BDD-FVIII、520IU/kg 64kDPEG14、或400IU/kg 64kD PEG2+14对小鼠给药。在5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、和8小时时自经BDD-FVIII处理的小鼠，和在5分钟、4小时、8小时、16小时、24小时、32小时、和48小时自经PEG化的FVIII处理的小鼠(5只小鼠/处理/时间点)收集血液样本。为了消除来自内源鼠FVIII的背景活性(其在vWF KO小鼠中为正常水平的约2％)，通过捕捉Coatest来测量输注的人FVIII的血浆活性。首先通过对人FVIII的A3域特异性的mAb R8B12(2ug/mL)来捕捉血浆中BDD-FVIII和PEG化的FVIII，然后通过Coatest来测量。与BDD-FVIII(其在不受保护免于vWF的情况中被快速清除，导致短至18分钟的t1/2)形成对比，64kD PEG14和64kD PEG2+14的t1/2分别是5.7小时和8.2小时(图1)。如此，与在FVIII KO小鼠中在存在vWF的情况中观察到的与BDD-FVIII相比PEG-FVIII的t1/2升高有限的2倍形成对比，在vWFKO小鼠中在没有vWF的情况中64kD PEG14和64kD PEG2+14的t1/2延长19至27倍。此外，PEG-FVIII的t1/2升高与PEG的大小成比例。
通过提及而将上述说明书中所提及的所有出版物和专利收入本文。本发明所描述的方法的各种修饰和变型在不偏离本发明范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。
虽然已经结合具体的实施方案描述了本发明，应当理解的是，如要求保护的发明不应过度限于此类具体的实施方案。实际上，意图对于生物化学领域或相关领域中的技术人员显而易见的用于实施本发明的上述模式的各种修饰在所附权利要求书的范围内。本领域技术人员会认可或者仅仅使用常规实验便能够确定本文中所描述发明的具体实施方案的许多等同方案。意图此类等同方案被所附权利要求书所涵盖。