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1、(10)授权公告号 CN 101580515 B (45)授权公告日 2011.06.08 CN 101580515 B *CN101580515B* (21)申请号 200810037512.X (22)申请日 2008.05.16 C07D 498/22(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 上海医药工业研究院 地址 200040 上海市北京西路 1320 号 (72)发明人 胡海峰 张海红 张琴 (74)专利代理机构 上海智信专利代理有限公司 31002 代理人 薛琦 朱水平 US 4107297 ,1978.0。
2、8.15,说明书第8栏第1 至 35 行 . CN 1328462 A,2001.12.26, 权利要求 1 至 20. Hajimu Morioka et al.Staurosporine-induced differentiation in a human neuroblastoma cell line,NB-1. Agric. BioL Chem. .1985, 第 49 卷 ( 第 7 期 ),1959-1963. (54) 发明名称 一种星形孢菌素提取纯化的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种星形孢菌素提取纯化的方 法， 包含以下步骤 ： 1) 将星形孢菌素产生菌菌体 的亲水性有机。
3、溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提 取液除去有机溶剂后加入酸溶液至酸性， 然后离 心、 取上清 ； 2) 上清在碱性条件下用亲脂性有机 溶剂萃取 ； 3)萃取液浓缩后， 进行硅胶柱层析。 本 发明星形孢菌素提取纯化的方法成本低， 周期短， 方法简单， 易于掌握， 不但产品纯度高， 而且产品 收率也高。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李强 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 101580515 B1/1 页 2 1. 一种星形孢菌素提取纯化的方法， 其特征在于， 包含以下步骤 ： 1) 将星形孢菌素产生菌菌体的亲水性有。
4、机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取液除 去有机溶剂后加入酸溶液至酸性， 然后离心、 取上清 ； 2) 上清在碱性条件下用亲脂性有机溶剂萃取 ； 3) 萃取液浓缩后， 进行硅胶柱层析。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1) 所述的提取液为星形孢菌素产生 菌菌体在碱性条件下用亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取所得。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述的星形孢菌素产生菌菌体由星形孢 菌素产生菌的发酵液离心所得。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 提取时采用的亲水性有机溶剂或亲水性 有机溶剂的水溶液的用量为星形孢菌素产生菌的发酵。
5、液体积的 0.5 倍以上。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 所述的亲水性有机溶剂选自醇、 酮和 四氢呋喃 ； 所述的醇选自甲醇和乙醇， 所述的酮为丙酮。 6. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1) 所述的亲水性有机溶剂的水 溶液为 85以上小于 100甲醇水溶液、 85以上小于 100乙醇水溶液或 85以上小于 100丙酮水溶液， 上述百分比为重量百分比。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述的亲水性有机溶剂的水溶液为 90 的甲醇水溶液、 90的乙醇水溶液或 95的丙酮水溶液， 上述百分比为重量百分比。 8. 根据权。
6、利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1) 所述的酸性为 pH1 5。 9. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1) 所述的酸溶液选自盐酸和草酸。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所述的亲脂性有机溶剂选自乙酸 乙酯、 乙酸丁酯、 氯仿、 二氯甲烷、 乙酸丙酯、 丙酸乙酯和丙酸甲酯。 11. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 所述的碱性条件为 pH 8.0 14.0。 12. 根据权利要求 11 所述的方法， 其特征在于， 所述的碱性条件为 pH10.0 13.0。 13. 根据权利要求 12 所述的方法， 其特征在于， 所述。
7、的碱性条件为 pH12.0。 14. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 3) 所述的硅胶柱层析包括步骤 ： 用 体积比为 100 1 50 1 的氯仿 - 甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗脱， 分步收集洗脱梯 度为 60 1 的目标物。 15. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 还包括将硅胶柱层析得到的目标物进行 浓缩或重结晶。 权 利 要 求 书 CN 101580515 B1/5 页 3 一种星形孢菌素提取纯化的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种星形孢菌素提取纯化的方法。 背景技术 0002 星形孢菌素 (staurosporine， 以下简称 STS) 一。
8、种广谱非特异性蛋白激酶 C 抑制 剂， 可强有力地抑制蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)。 可用于抵抗酵 母和真菌引起的许多感染性疾病， 抑制细胞增殖， 诱导细胞程序性死亡， 废除细胞周期检查 点， 抑制血管增生等。还具有极强的抗肿瘤活性， 在临床上对 12 种人肿瘤细胞平均 IC50为 0.016g/ml(U.S.Patent 4735039)。另外， STS 的衍生物 UCN-01 等作为抗肿瘤药物已经 进入临床二期 (EP 0 238 011 B1， EP 0 575 955 A1)。 0003 U.S.Pat.No.4,107,297 描述了从放线菌 AM-2282 发酵。
9、液中提取 STS 的工艺。方 法为 ： 发酵液用氨水调节发酵液 pH10.0， 再用乙酸丁酯萃取， 乙酸丁酯相转移到 0.1N 盐 酸中， 萃取后， 用氨水调节水相 pH 为 10.0， 然后用乙酸乙酯萃取两次， 合并萃取相加入无 水硫酸钠干燥， 然后真空浓缩， 硅胶柱 (Merk， Kieselgel G) 层析分离， 洗脱剂为氯仿甲 醇 (60 1， v/v)， 生物碱跟碘化铋钾发生颜色反应， 利用薄层层析检测 ( 氯仿甲醇 101)。 收集生物碱部分， 并真空浓缩干燥得到淡黄色粉末。 粉末利用氯仿甲醇(501， v/v) 重结晶得到淡黄色针状晶体。该工艺操作复杂， 收率很低， 最终获得的。
10、产品很少。 0004 Morioka 等 描 述 了 从 发 酵 液 中 提 取 STS 的 工 艺 ( 参 考 文 献 ： Morioka， H.， Ishihara， M.， Shibai， H.& Suzuki， T.Staurosporine-induced differentiation in ahuman neuroblastoma cell line， NB-1.Agric.Biol.Chem.1985， 49， 1959-1963)。 0005 发酵液离心， 滤饼用甲醇萃取， 萃取液真空浓缩， 浓缩物用乙酸乙酯萃取， 然后上 两次硅胶柱层析纯化， 两次重结晶， 得到STS。 此。
11、方法操作容量有限， 耗时多， 收率低， 也不适 应于生产。 发明内容 0006 因此， 本发明要解决的技术问题就是针对现有的星形孢菌素提取纯化的方法存在 的高纯度和高收率不能兼得的不足， 提供一种不但产品纯度高， 而且收率也较高的星形孢 菌素提取纯化的方法。 0007 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是， 一种星形孢菌素提取纯化的方 法， 可包含以下步骤 ： 0008 1) 将星形孢菌素产生菌菌体的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取 液除去有机溶剂后加入酸溶液至酸性， 然后离心、 取上清 ； 0009 2) 上清在碱性条件下用亲脂性有机溶剂萃取 ； 0010 3) 萃取液浓缩后，。
12、 进行硅胶柱层析。 0011 根据本发明， 步骤 1) 将星形孢菌素产生菌菌体的亲水性有机溶剂或亲水性有机 溶剂的水溶液提取液除去有机溶剂后加入酸溶液至酸性， 然后离心、 取上清。 所述的提取液 说 明 书 CN 101580515 B2/5 页 4 较佳的为星形孢菌素产生菌菌体在碱性条件下用亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水 溶液提取所得， 此步骤可采用现有技术， 如上述 Morioka 的工艺。其中， 所述的碱性条件为 pH 8.0 14.0， 较佳的为 pH 10.0 13.0， 更佳的为 pH 12.0， 可以加入氨水或氢氧化钠 达到上述碱性条件。 星形孢菌素产生菌菌体较佳的可由星形孢。
13、菌素产生菌的发酵液离心而 得， 通常选用湿菌体即可。提取时采用的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液的用 量较佳的为星形孢菌素产生菌的发酵液体积的 0.5 倍以上， 或者其用量可以使星形孢菌素 产生菌菌体在其中的浓度不超过 1g/ml。所述的亲水性有机溶剂较佳的可选自醇、 酮和四 氢呋喃。所述的醇较佳的为 C1-3的低级脂肪醇， 更优选自甲醇和乙醇。所述的酮较佳的为 丙酮。所述的亲水性有机溶剂的水溶液较佳的可为 85 100甲醇水溶液、 85 100乙 醇水溶液或 85 100丙酮水溶液， 更佳的可为 90的甲醇水溶液、 90的乙醇水溶液或 95的丙酮水溶液， 上述百分比为重量百分比。所述提。
14、取液更佳的可以是星形孢菌素产生 菌菌体在碱性条件下用亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取两次或多次所得。 该提取液在除去其中的亲水性有机溶剂后加入酸溶液至酸性， 所述酸溶液较佳的可选自盐 酸和草酸， 优选 0.1N 盐酸。所述酸性较佳的为 pH 1 5， 优选 pH2 3。 0012 根据本发明， 步骤 2) 将得到的上清在碱性条件下用亲脂性有机溶剂萃取。较佳 的所述的亲脂性有机溶剂可选自乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 氯仿、 二氯甲烷、 乙酸丙酯、 丙酸乙酯 和丙酸甲酯。所述的碱性条件为 pH 8.0 14.0， 较佳的为 pH 10.0 13.0， 更佳的为 pH 12.0。可以加入氨水或氢。
15、氧化钠到上述碱性条件。 0013 根据本发明， 步骤 3) 将所得的萃取液浓缩后， 进行硅胶柱层析。较佳的所述的萃 取液加入无水硫酸钠除去水分， 蒸馏除去有机溶剂后进行硅胶柱层析。所述的硅胶柱层析 较佳的包括步骤 ： 用体积比为 100 1 50 1 的氯仿 - 甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗 脱， 分步收集洗脱梯度为 60 1 的目标物。较佳的用薄层层析 - 碘化铋钾跟踪检测。 0014 本发明的星形孢菌素提取纯化的方法较佳的还可以包括将硅胶柱层析得到的目 标物进行浓缩或重结晶的步骤。 0015 本发明上述步骤 2) 的亲脂性有机溶剂萃取、 步骤 3) 硅胶柱层析及浓缩或重结晶 等的方法均可采。
16、用现有技术， 如背景技术中提及的两份文献中公开的星形孢菌素分离纯化 过程中的相应技术。 0016 本发明的上述各个步骤， 如步骤 2) 的亲脂性有机溶剂萃取， 步骤 3) 的硅胶柱层 析， 以及其后的浓缩或重结晶步骤等都可以重复两次或多次， 以得到更好的结果。 0017 本发明所述的各原料或试剂均市售可得。 0018 相比于现有技术， 本发明的优点是 ： 本发明星形孢菌素提取纯化的方法成本低， 周 期短， 方法简单， 易于掌握， 不但产品纯度高， 而且产品收率也高。 具体实施方式 0019 下面用实施例来进一步说明本发明， 但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法， 通常按。
17、照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 下述的内容中 除特别说明之外， 所用的百分比都是重量百分比。 0020 实施例 1 0021 将 Saccharothrix aerocolonigenes subsp.staurosporea CGMCC 4.1708( 购于 说 明 书 CN 101580515 B3/5 页 5 中国普通微生物菌种保藏中心 ) 种子取出活化后接种斜面培养基 (ISP4培养基 ： 可溶性淀 粉 1.0、 K2HPO4 0.1、 MgSO47H2O 0.1、 NaCl 0.1、 (NH4)2SO4 0.2、 CaCO3 0.4， 余量为水， pH7.2， 121灭菌。
18、 20min)， 将接种菌种的斜面置于 28恒温培养箱中， 培养 10 天， 得到成熟的孢子， 然后成熟的孢子接种于装有 30ml 种子培养基 ( 葡萄糖 2.0， 蛋白胨 0.5， 牛肉膏 0.5， 酵母粉 0.3， CaCO3 0.4， 余量为水， pH7.0， 121灭菌 20min) 的 250ml 摇瓶中， 在 28、 220rpm 摇床上培养 3 天， 得到成熟的种子， 得到的种子以 5的接 种量接入装有 100ml 发酵培养基 ( 葡萄糖 3.0， 大豆饼粉 2， 碳酸钙 0.4， 余量为水， pH7.0) 的 750ml 摇瓶中， 置于 28、 220rpm 摇床继续培养 60。
19、 小时， 得到发酵液。 0022 1L 发酵液离心 ( 转速 4000rpm， 时间 10 分钟 ) 处理， 弃上清液。湿菌体 0.45kg 先 加入 1L 的甲醇， 用 0.1N 氢氧化钠调节 pH 值 12.0， 常温搅拌浸泡 2 小时后过滤， 菌体再用 0.5L的甲醇以同样方法再提取一次。 两次提取得到的滤液混合， 蒸馏除去滤液中的甲醇， 得 到浓缩液。在浓缩液中加入 200ml 0.1N HCl， 使溶液的 pH 值为 3， 搅拌， 离心， 取上清。然 后再加入 100ml 0.1N HCl， 使溶液的 pH 值为 3， 重复上述操作。合并所有上清液， 调节 pH 值至 12.0， 然。
20、后分别用 300ml 和 200ml 乙酸乙酯萃取两次， 合并所有的萃取液， 加入 10g 无 水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去乙酸乙酯至淡黄色油状物。油状物用乙酸乙酯充分溶解后 上硅胶柱层析， 用体积比为 100 1 100 20 的氯仿 - 甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗 脱， 流速为 0.3ml/min， 分步收集。用薄层层析 - 碘化铋钾跟踪检测， 当洗脱梯度为 60 1 时目标物流出。 收集含目标物的洗脱液， 真空浓缩得到淡黄色粉末， 室温下用氯仿热溶， 4 冷却过夜结晶， 得到纯度为 96.1的化合物 19.8mg。换算成收率为 61。 0023 实施例 2 0024 菌体先用 1.5L。
21、 90 (wt) 甲醇溶液提取， 再用 0.6L 90 (wt) 甲醇溶液溶液 提取， 萃取所用的亲脂性有机溶剂为氯仿， 其他同实施例 1， 最后得到 94.5纯度的产物 17.31mg。换算成收率为 52.4。 0025 实施例 3 0026 菌体先用 95 (wt) 乙醇溶液提取两次， 用量分别为 1.5L、 0.6L， 其他同实施例 1， 最后得到纯度 89.3的产物 19.93mg。换算成收率为 57.06。 0027 实施例 4 0028 菌体先后用 1.5L、 0.8L 95 (wt) 丙酮溶液提取两次， 其他同实施例 1， 最后得到 纯度 94.1的产物 13.17mg。换算成收。
22、率为 39.7。 0029 实施例 5 0030 菌体先用 85 (wt) 乙醇溶液提取两次， 用量分别为 1.0L、 0.5L， 其他同实施例 2， 最后得到纯度 91.3的产物 17.93mg。换算成收率为 52.5。 0031 实施例 6 0032 菌体先用四氢呋喃在 pH 8.0 条件下提取两次。提取得到的溶液混合， 蒸馏除去溶 液中的四氢呋喃后， 加入0.1N盐酸溶液至酸性为pH3.0， 搅拌， 离心， 取上清。 上清液调节至 pH 值 10.0， 用乙酸丁酯萃取。其他同实施例 1， 最后得到纯度 94.1的产物 9.34mg。换算 成收率为 29.8。 0033 实施例 7 003。
23、4 菌体先用 90 (wt) 的乙醇水溶液在 pH 14.0 条件下提取两次。提取得到的溶液 说 明 书 CN 101580515 B4/5 页 6 混合， 蒸馏除去溶液中的有机溶剂后， 加入 0.1N 盐酸溶液至酸性为 pH1.0， 搅拌， 离心， 取上 清。上清液调节 pH 值 14.0， 用氯仿萃取。其他同实施例 1， 最后得到纯度 92.24的产物 18.67mg。换算成收率为 55.21。 0035 实施例 8 0036 菌体先用乙醇在 pH 10.0 条件下提取两次。提取得到的溶液混合， 蒸馏除去溶 液中的有机溶剂后， 加入草酸溶液至酸性为 pH4.0， 搅拌， 离心， 取上清。上。
24、清液调节 pH 值 10.0， 用二氯甲烷萃取。其他同实施例 1， 最后得到纯度 93.5的产物 17.31mg。换算成收 率为 51.89。 0037 实施例 9 0038 菌体先用 85 (wt) 的甲醇水溶液在 pH13.0 条件下提取一次。提取得到的溶液 混合， 蒸馏除去溶液中的有机溶剂后， 加入 0.1N 盐酸溶液至酸性为 pH5.0， 搅拌， 离心， 取上 清。上清液调节 pH 值 13.0， 用乙酸丙酯萃取。其他同实施例 1， 最后得到纯度 92.91的产 物 15.24mg。换算成收率为 45.39。 0039 实施例 10 0040 菌体先用 85 (wt) 的丙酮水溶液在 。
25、pH 12.0 条件下提取两次。提取得到的溶液 混合， 蒸馏除去溶液中的有机溶剂后， 加入 0.1N 盐酸溶液至酸性为 pH2.0， 搅拌， 离心， 取上 清。上清液调节 pH 值 12.0， 用丙酸乙酯萃取。其他同实施例 1。最后得到纯度 89.37的 产物 14.26mg。换算成收率为 40.86。 0041 实施例 11 0042 菌体先用乙醇在 pH 12.0 条件下提取两次。提取得到的溶液混合， 蒸馏除去溶液 中的有机溶剂后， 加入 0.1N 盐酸溶液至酸性为 pH3.0， 搅拌， 离心， 取上清。上清液调节 pH 值 12.0， 用丙酸甲酯萃取。其他同实施例 1。最后得到纯度 89。
26、.24的产物 14.91mg。换算 成收率为 42.66。 0043 实施例 12 0044 4L 同实施例 1 的发酵液分成 4 份， 取其中一份进行如下操作。 0045 发酵液离心 ( 转速 4000rpm， 时间 10 分钟 )， 弃掉上清， 收集菌体。加入 500ml 甲 醇， 用氨水调节 pH12.0， 室温搅拌 1h， 过滤， 用 100ml 甲醇重新洗涤滤饼并过滤， 合并滤液， 真空浓缩除去甲醇， 得到 100ml 左右浓缩液。在浓缩液中加入 1/2 体积 0.1N HCl， 搅拌， 离 心， 取上清。调节上清液 pH 为 12.0， 加入乙酸乙酯萃取， 合并乙酸乙酯萃取相， 加。
27、入无水硫 酸钠除水。然后蒸馏除去乙酸乙酯， 得到淡黄色油状物。油状物中 STS 含量为 84 (wt) 左 右。油状物用乙酸乙酯充分溶解后上硅胶柱层析， 用不同比例的氯仿 - 甲醇混合液为洗脱 剂进行梯度洗脱， 流速为 0.3ml/min， 分步收集。用薄层层析 - 碘化铋钾跟踪检测， 当洗脱 梯度为 60 1 时目标物流出。将收集的洗脱液真空浓缩得到淡黄色粉末， 室温下用氯仿热 溶， 4冷却并静置过夜， 得到淡黄色针状晶体。纯度为 96.5， 收率为 64.9。 0046 实施例 13 0047 取实施例 12 中 4 份发酵液中的另一份进行如下操作。 0048 菌体先后用 500ml 和 。
28、100ml 丙酮提取， 其他步骤同实施例 1。即实施例 1 中， 除菌 体先后用 500ml 和 100ml 甲醇提取的步骤中所用的甲醇被丙酮代替外， 其他步骤都与实施 例 2 相同。 说 明 书 CN 101580515 B5/5 页 7 0049 对比例 1U.S.Pat.No.4,107,297 描述的酸碱提取法。 0050 取实施例 12 中 4 份发酵液中的第三份进行如下操作。 0051 发酵液用氨水调节 pH 值 10.0， 加入 500ml 乙酸乙酯萃取， 静置分液， 离心， 分出有 机相 ； 在有机相中加入 250mL 0.1N HCl， 萃取水相。再用稀氨水调水相 pH 值为。
29、 10.0， 并用 100mL 的乙酸乙酯抽提两次， 分液漏斗除去水相， 加无水硫酸钠脱水后， 减压蒸馏浓缩有机 相至浆状粗提物， 粗提物中STS含量为75(wt)左右。 粗提物用乙酸乙酯充分溶解后上硅 胶柱层析， 用不同比例的氯仿 - 甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗脱， 收集含目标化合物的 洗脱液， 浓缩， 结晶， 得到化合物。纯度为 94.5， 收率为 35.2。 0052 对比例 2Morioka 描述的甲醇提取法 0053 取实施例 12 中 4 份发酵液中的最后一份进行如下操作。 0054 发酵液离心， 菌体先后用 500ml 和 300ml 甲醇提取， 然后将所有甲醇溶液合并， 减 。
30、压浓缩除去甲醇后， 得到 100ml 左右浓缩液， 浓缩液用乙酸乙酯萃取， 在乙酸乙酯萃取液中 加入无水硫酸钠脱水， 减压浓缩至浆状物。 浆状物中STS含量为55(wt)左右， 杂质很多。 浆状物用乙酸乙酯溶解后上硅胶柱层析一次， 但仍有较多杂质不能分离， 因此纯度较低。 0055 实施例 12 是本发明的甲醇 - 酸碱处理提取。实施例 13 本发明的丙酮 - 酸碱处理 提取。对比例 1 是 U.S.Pat.No.4,107,297 描述的酸碱提取法。对比例 2 是 Morioka 描述 的甲醇提取法。 这四种提取方法的结果见表1， 有表可知本发明的两种方法的提取效果明显 的要好于两种现有的提取方法。 0056 表 1 四种提取方法的比较 0057 说 明 书 。