本案是以申请日为2014年11月26日，申请号为201410696241.4，名称为“一种万古霉素的补料培养基及生产万古霉素的方法”的发明专利为母案而进行的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗生素发酵领域，具体地说是一种万古霉素的补料培养基及生产万古霉素的方法。
背景技术
万古霉素是东方诺卡氏菌在控制发酵条件下产生的一种两性糖肽类抗生素，其化学式为C66H75Cl2N9O24，分子量为1486。现有技术中可通过微生物Amycolatopis orientalis发酵制备万古霉素。万古霉素是目前治疗盘尼西林耐药菌感染者和β-内酰胺类抗生素过敏症的首选药，被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。万古霉素作为一种疗效独特的抗生素在临床应用上具有日益重要的地位。
万古霉素是发酵产生的次生代谢产物，特点是一般不在细胞迅速生长期产生，而是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段，负责次级代谢产物合成的酶处于抑制状态，因而不产生万古霉素，一旦生长接近尾声，这些酶便开始被激活或被合成，开始合成万古霉素。影响次级代谢产物的因素非常复杂，例如葡萄糖效应和毒蛋白效应都会抑制万古霉素的产量，筛选更加合适的培养条件和培养基组分等，提高万古霉素的产量是企业不断追求的。在我国，万古霉素虽已实现国内的产业化生产，但发酵的产量仍有待提高。
补料发酵虽然在发酵行业广泛使用，但是由于产品的差异导致菌种不同，或者即使同菌株经过不同的公司筛选程序后选育出的菌株特性也会产生差异，菌种或菌株的差异导致发酵生产过程中，各生产条件如通气量、碳源、氮源、发酵时间等的差异，不同产品或者不同公司的补料发酵工艺在推广的过程中存在众多技术难题。基于这些原因，使得即使补料发酵在青霉素或者维生素发酵行业已经应用，在万古霉素发酵生产中并没有公开成功的案例。
对于万古霉素补料发酵，以下问题亟需得到解决：补料的时机(发酵物料发酵到什么程度补)、补料过程如何防染菌、补料的比例(所补营养成分占发酵液的百分之几)等。补料时机的选择尤为重要，需要能够降低葡萄糖效应的同时保证碳源的供应；另外还需确定添加的营养成分种类、各营养成分各自的补料时机、补料的比例等。众多技术问题给万古霉素补料发酵带来障碍。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种可提高万古霉素产量的万古霉素补料培养基及生产万古霉素的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种万古霉素的补料培养基，包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种，所述碳源包括甘油、淀粉、燕麦粉、葡萄糖、乳糖、淀粉中的一种或几种，所述氮源包括黄豆粉、棉籽精粉、玉米蛋白粉中的一种或几种，所述PH调节剂包括磷酸和氨水中的一种或两种。
本发明的另一技术方案为：一种生产万古霉素的方法，包括在发酵过程中向发酵培养基添加补料培养基，所述补料培养基包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种。
本发明的有益效果在于：发酵过程中用补料培养基向发酵培养基补料，降低抑制产生万古霉素次生代谢途径的因素，可提高万古霉素发酵的产量。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
本发明最关键的构思在于：在发酵过程中，通过向发酵培养基中添加补料培养基，降低抑制产生万古霉素次生代谢途径的因素，提高万古霉素发酵的产量，即采用补料发酵的途径，促进发酵过程中万古霉素的次生代谢途径，提高万古霉素发酵的产量。
本发明提供一种万古霉素的补料培养基，包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种，所述碳源包括甘油、淀粉、燕麦粉、葡萄糖、乳糖、淀粉中的一种或几种，所述氮源包括黄豆粉、棉籽精粉、玉米蛋白粉中的一种或几种，所述PH调节剂包括磷酸和氨水中的一种或两种。
进一步的，包括碳源、氮源和pH调节剂，所述碳源包括甘油和淀粉，所述碳源中甘油和淀粉的体积与质量之比v:w为0.5mL:1g-0.65mL:1g；所述氮源包括黄豆粉和玉米蛋白粉，所述氮源中黄豆粉和玉米蛋白粉的质量比w:w为1:0.8到1:1；所述pH调节剂包括磷酸和氨水中的一种或两种。
本发明还提供一种生产万古霉素的方法，包括在发酵过程中向发酵培养基添加补料培养基，所述补料培养基包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种。
进一步的，控制发酵培养基的pH值为6.6-7.4，向发酵培养基添加碳源以控制发酵培养基还原糖的质量百分比浓度为0.5％-1.5％，发酵110h后结束添加碳源，结束添加碳源后当还原糖的质量百分比浓度降至0.2％时结束发酵过程。
进一步的，控制发酵培养基的pH值为6.6-7.4，向发酵培养基添加氮源以控制发酵培养基的氨基氮的质量浓度为20-120g/L。
进一步的，控制发酵培养基的pH值为6.6-7.4，向发酵培养基添加碳源以控制发酵培养基还原糖的质量百分比浓度为0.5％-1.5％，向发酵培养基添加氮源以控制发酵培养基的氨基氮的质量浓度为20-120g/L，发酵110h后结束添加碳源，结束添加碳源后当还原糖的质量百分比浓度降至0.2％时结束发酵过程。
以下为本发明实施例，其中v:w表示体积(单位为mL):质量(单位为g)，w:w表示质量:质量；v:v表示体积:体积。
实施例1(包括实施方案1、2、3、4和5)
实施方案1
(1)种子培养：将东方拟无枝酸菌接种到种子培养基中，在30L试验罐进行培养，培养周期为50±16h；
培养条件：温度30℃，通气量v:v 1:1，罐压0.04Mpa，转速300rpm，初始pH值6.8；
种子培养基配方(质量比％)：淀粉4.0，黄豆粉2.0，葡萄糖1.5，酵母粉1.0，氯化钠0.6，磷酸二氢钾0.02。
(2)发酵培养：将培养好的种子液按接种量10％接种到发酵培养基中，在50L试验罐进行培养，培养周期为120±60h；
发酵培养基配方(质量比％)：淀粉6.0，黄豆粉2.0，丝素粉0.5，硫酸铵0.2，磷酸二氢钾0.005，氯化镁0.02，氯化钙0.3。
培养条件：温度33.5℃，通气量v:v 1:1-1:1.5，罐压0.03-0.04Mpa，转速300-500rpm，初始pH值6.8。
实施方案2：补加碳源，调控pH
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度和pH值，当还原糖的质量百分比浓度高于1.0％时，添加碳源，至还原糖的质量百分比浓度为0.2％范围内；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述碳源为甘油、淀粉的混合物，混合比例(v:w)为0.5:1。
实施方案3：补加氮源，调控pH
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的氨基氮的质量浓度和pH值，当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉、玉米蛋白粉的混合物，混合比例(w:w)为1:1。
实施方案4：补加碳源、氮源，调控pH
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为1.0％时，添加碳源，至120小时停止补料，至还原糖的质量百分比浓度低于0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述碳源为甘油、淀粉的混合物，混合比例(v:w)为0.5:1。
所述氮源为黄豆粉、玉米蛋白粉的混合物，混合比例(w:w)为1:1。
实施方案5：仅调控pH
重复进行实施例1中实施方案1，用磷酸或氨水调节发酵培养基的pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
表1为实施方案1-5的万古霉素发酵情况。
表1
实施方案 批次 单位u 体积L 产量g 实施方案1 4 5664 26 147.26 实施方案2 4 7636 27.5 209.99 实施方案3 4 6061 26.5 160.62 实施方案4 4 8491 28.0 237.75 实施方案5 4 5818 26.1 151.85
表1的实验结果表明：在发酵过程中添加碳源、氮源和/或调节pH值，可以显著提高万古霉素的发酵产量；在发酵过程中添加碳源、氮源和调节pH值比仅添加碳源和调节pH值、添加氮源和调节pH值更能显著提高万古霉素的发酵产量。实施方案4为补料发酵的最优选方案。
实施例2
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为0.5％时，添加碳源，125小时结束，至还原糖的质量百分比浓度低于0.2％结束培养；；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉、玉米蛋白粉的混合物，混合比例(w:w)为1:1。
所述碳源：
碳源1为甘油；
碳源2为葡萄糖；
碳源3为淀粉；
碳源4为燕麦粉；
碳源5为乳糖；
碳源6为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.25:1；
碳源7为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.5:1；
碳源8为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为1:1；
碳源9为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为1.5:1；
碳源10为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为2:1；
碳源11为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.6:1；
碳源12为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.65:1。
表2为实施例2的万古霉素发酵情况。
表2
试验项目 批次 单位u 体积L 产量g 备注 碳源1 4 8386 27 226.42 碳源2 4 8217 27 221.86 偏差大 碳源3 4 8246 28 230.89 碳源4 3 8223 27 222.02 碳源5 3 8350 27 225.45 碳源6 4 8464 28 228.53 碳源7 4 8491 28 237.75 碳源8 4 8438 27.5 233.28 碳源9 4 8430 27.5 231.83 碳源10 4 8412 27 227.12 碳源11 6 8562 28 239.74 碳源12 6 8493 28 237.80
表2的实验结果表明：补料碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.5:1-0.65:1时，万古霉素发酵产量显著提高。
实施例3
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的氨基氮和pH值，当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源：
氮源1为玉米蛋白粉；
氮源2为棉籽精粉；
氮源3为黄豆粉；
氮源4为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:1；
氮源5为黄豆粉和棉籽精粉混合物，混合比例(w:w)为1:1；
氮源6为玉米蛋白粉和棉籽精粉混合物，混合比例(w:w)为1:1；
氮源7为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:0.9；
氮源8为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:0.8。
表3为实施例3的万古霉素发酵情况。
表3
试验项目 批次 单位u 体积L 产量g 氮源1 4 5896 26.3 155.07 氮源2 4 5882 26.2 154.11 氮源3 4 5964 26.3 156.85 氮源4 4 6018 26.5 159.48 氮源5 4 5972 26.5 158.26 氮源6 4 5838 26.4 154.12 氮源7 4 6061 26.5 160.62 氮源8 4 6002 26.5 159.05
表3的实验结果表明：补料氮源为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:0.8到1:1时，万古霉素发酵产量和获得的万古霉素活性单位显著提高。
实施例4
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为X％时，添加碳源，至110小时左右结束补碳源，至还原糖的质量百分比浓度低于0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉、玉米蛋白粉的混合物，混合比例(w:w)为1:1。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.6:1。
表4为实施例4的万古霉素发酵情况(补加碳源时，还原糖的浓度对发酵的影响)。
表4
X 批次 单位u 体积L 产量g 0.5 4 8562 28 239.74 0.7 4 8653 28 242.28 1.0 4 8861 28.1 248.99 1.5 3 8121 28.2 229.01 2.0 3 7065 28 197.82
表4的实验结果表明：当还原糖的质量百分比浓度为0.5％-1.5％时，补加碳源，万古霉素发酵产量和获得的万古霉素活性单位显著提高。
实施例5
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为2.5％时，添加碳源，至90小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度低于0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为玉米蛋白粉。
所述碳源为甘油。
实施例6
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为2.0％时，添加碳源，至95小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为棉籽精粉。
所述碳源为葡萄糖。
实施例7
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为1.5％时，添加碳源，至110小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉。
所述碳源为淀粉。
实施例8
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为1.0％时，添加碳源，至120小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:1。
所述碳源为燕麦粉。
实施例9
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为0.8％时，添加碳源，至125小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉和棉籽精粉混合物，混合比例(w:w)为1:1。
所述碳源为乳糖。
实施例10
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为0.5％时，添加碳源，至130小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为玉米蛋白粉和棉籽精粉混合物，混合比例(w:w)为1:1。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.25:1。
实施例11
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为2.5％时，添加碳源，至90小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:0.9。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.5:1。
实施例12
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为1.0％时，添加碳源，至120小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:0.8。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为1:1。
实施例13
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度为0.2％时，添加碳源，；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为玉米蛋白粉。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为1.5:1。
实施例14
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度低于1.0％时，添加碳源，至120小时结束补加，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为棉籽精粉。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为2:1。
实施例15
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度低于2.0％时，添加碳源，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:1。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.6:1。
实施例16
重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨基氮和pH值，当还原糖的质量百分比浓度低于0.8％时，添加碳源，至还原糖的质量百分比浓度至0.2％；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6.6-7.4。
所述氮源为黄豆粉和棉籽精粉混合物，混合比例(w:w)为1:1。
所述碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.65:1。
综上所述，本发明提供的一种万古霉素的补料培养基可以显著提高万古霉素的发酵产量；在发酵过程中添加碳源、氮源和调节pH值比仅添加碳源和调节pH值或仅添加氮源和调节pH值更能显著提高万古霉素的发酵产量。特别的，补料培养基的碳源为甘油和淀粉混合物，混合比例(v:w)为0.5:1-0.65:1时时，万古霉素发酵产量显著提高；补料培养基的氮源为黄豆粉和玉米蛋白粉混合物，混合比例(w:w)为1:0.8到1:1时时，万古霉素发酵产量和获得的万古霉素活性单位显著提高；当发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度为0.5％-1.5％时，补加碳源并维持，万古霉素发酵产量和获得的万古霉素活性单位显著提高。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。