一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810650658.5 (22)申请日 2018.06.22 (71)申请人 安徽 地址 518033 广东省深圳市福田区金田路 3038号现代商务大厦23层2302X1 (72)发明人 安徽 (74)专利代理机构 深圳市神州联合知识产权代 理事务所(普通合伙) 44324 代理人 邓扬 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称 一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法 (57)摘要 本发明公开了一种脐带间充质干细胞的制 备和提取方法，。

2、 包括以下步骤， 清洗； 酶解， 取出 脐带粉碎处理， 使用浓度为0.1%的胶原酶处 理， 酶解时间为68小时； 过滤， 向脐带酶解液中 带入5倍体积的蒸馏水， 使用筛网进行初步过滤， 然后倒入差速分离机中进一步过滤； 原代培养； 传代培养； 活性检测； 冷冻保存， 将优选后的细胞 簇分组保存在保温罐中， 保温罐的温度应为4， 本发明涉及生物工程技术领域。 该脐带间充质干 细胞的制备和提取方法， 能够有效去除存在基因 缺陷的细胞， 降低对干细胞接受者的损害， 同时 使干细胞加热和冷藏过程中温度变化更加平和， 避免细胞提取过程中的温度改变容易使细胞失 活， 降低细胞的提取率的问题。 权利要求书2。

3、页 说明书4页 附图3页 CN 108865984 A 2018.11.23 CN 108865984 A 1.一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 包括以下步骤， （1） 清洗， 用蒸馏水将脐带冲洗干净， 然后用酒精棉将脐带表面擦拭干净； （2） 酶解， 取出脐带粉碎处理， 使用浓度为0.1%的胶原酶处理， 酶解时间为68小时； （3） 过滤， 向脐带酶解液中带入5倍体积的蒸馏水， 使用筛网进行初步过滤， 然后倒入差 速分离机中进一步过滤； （4） 原代培养， 将过滤后的脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行培养， 培养时间为 2天； （5） 传代培养， 更换无血清培养基， 并。

4、在无血清培养基中添加无血清营养添加物， 定期 更换培养基， 直至产生细胞簇； （6） 活性检测， 从不同位置细胞簇中分别取部分细胞并分组标号， 将不同组的细胞分别 进行诱导分化培养， 检测分化后的细胞活性， 剔除细胞活性较差的细胞簇； （7） 冷冻保存， 将优选后的细胞簇分组保存在保温罐中， 保温罐的温度应为4。 2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所述 酶解液在差速离心机中的离心时间应为10min， 离心力应为200g。 3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所述 脐带酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏， 冷藏持。

5、续时间为26个月。 4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所述 保温罐包括罐体 （1） ， 所述罐体 （1） 的内壁固定连接有保温层 （2） ， 所述保温层 （2） 的内壁两 侧均固定连接有电热片 （3） ， 所述电热片 （3） 的内侧固定连接有内罐 （4） ， 所述内罐 （4） 的内 部开设有水浴管道 （5） ， 所述水浴管道 （5） 的一端贯穿内罐 （4） 并且延伸至内罐 （4） 的顶部， 所述罐体 （1） 的顶部安装有保温盖 （6） ， 所述保温盖 （6） 的顶部一端开设有与水浴管道 （5） 相 适配的入水孔 （7） 。 5.根据权利要求4所述的一。

6、种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所述 罐体 （1） 的一侧开设有电控槽 （8） ， 所述电控槽 （8） 的内壁底部固定连接有电源箱 （9） ， 所述 电源箱 （9） 的顶部固定连接有控制器 （10） ， 所述电源箱 （9） 、 控制器 （10） 和电热片 （3） 之间通 过导线电性连接， 所述电控槽 （8） 的两侧之间固定连接有挡板 （11） ， 所述挡板 （11） 的一侧开 设有透气孔 （12） 。 6.根据权利要求5所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所述 罐体 （1） 的底部一端开设有出水口 （13） ， 所述出水口 （13） 贯穿罐体 （1）。

7、 和内罐 （4） 并且与水 浴管道 （5） 连通， 所述出水口 （13） 的内部安装有电控阀 （14） ， 所述电控阀 （14） 通过导线与控 制器 （10） 电性连接。 7.根据权利要求4所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所述 入水孔 （7） 的一侧开设有密封槽 （15） ， 所述密封槽 （15） 的内壁远离入水孔 （7） 的一侧通过弹 簧 （16） 固定连接有倾斜块 （17） ， 所述倾斜块 （17） 与密封槽 （15） 的内壁滑动连接， 所述倾斜 块 （17） 的底部固定连接有密封块 （18） 。 8.根据权利要求4所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 。

8、其特征在于： 所述 保温盖 （6） 的顶部固定连接有提手 （19） 。 9.根据权利要求4所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所述 内罐 （4） 的内壁之间滑动连接有支架 （20） 。 权利要求书 1/2 页 2 CN 108865984 A 2 10.根据权利要求9所述的一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 其特征在于： 所 述支架 （20） 的顶部两端均固定连接有把手 （21） 。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108865984 A 3 一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术领域， 具体为一种脐带间充质干细胞的制备和。

9、提取方 法。 背景技术 0002 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞， 在一定条件下， 它可以分化成多 种功能细胞， 根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞， 根据干细胞的发 育潜能分为三类:全能干细胞、 多能干细胞和单能干细胞(专能干细胞)， 干细胞是一种未充 分分化， 尚不成熟的细胞， 具有再生各种组织器官和人体的潜在功能， 医学界称为 “万用细 胞” 。 但是现有的干细胞提取方法提取出的细胞可能存在基因缺陷， 容易影响接受者的健 康， 同时细胞提取过程中的温度改变容易使细胞失活， 降低细胞的提取率。 发明内容 0003 （一） 解决的技术问题 针对现有技术的不足， 本发。

10、明提供了一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 解决 了现有的干细胞提取方法提取出的细胞可能存在基因缺陷， 容易影响接受者的健康， 同时 细胞提取过程中的温度改变容易使细胞失活， 降低细胞的提取率的问题。 0004 （二） 技术方案 为实现以上目的， 本发明通过以下技术方案予以实现： 一种脐带间充质干细胞的制备 和提取方法， 包括以下步骤， （1） 清洗， 用蒸馏水将脐带冲洗干净， 然后用酒精棉将脐带表面擦拭干净； （2） 酶解， 取出脐带粉碎处理， 使用浓度为0.1%的胶原酶处理， 酶解时间为68小时； （3） 过滤， 向脐带酶解液中带入5倍体积的蒸馏水， 使用筛网进行初步过滤， 然后倒入差。

11、 速分离机中进一步过滤； （4） 原代培养， 将过滤后的脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行培养， 培养时间为 2天； （5） 传代培养， 更换无血清培养基， 并在无血清培养基中添加无血清营养添加物， 定期 更换培养基， 直至产生细胞簇； （6） 活性检测， 从不同位置细胞簇中分别取部分细胞并分组标号， 将不同组的细胞分别 进行诱导分化培养， 检测分化后的细胞活性， 剔除细胞活性较差的细胞簇； （7） 冷冻保存， 将优选后的细胞簇分组保存在保温罐中， 保温罐的温度应为4。 0005 优选的， 所述酶解液在差速离心机中的离心时间应为10min， 离心力应为200g。 0006 优选的， 所述脐带。

12、酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏， 冷藏持续时间为26个 月。 0007 优选的， 所述保温罐包括罐体， 所述罐体的内壁固定连接有保温层， 所述保温层的 内壁两侧均固定连接有电热片， 所述电热片的内侧固定连接有内罐， 所述内罐的内部开设 说明书 1/4 页 4 CN 108865984 A 4 有水浴管道， 所述水浴管道的一端贯穿内罐并且延伸至内罐的顶部， 所述罐体的顶部安装 有保温盖， 所述保温盖的顶部一端开设有与水浴管道相适配的入水孔。 0008 优选的， 所述罐体的一侧开设有电控槽， 所述电控槽的内壁底部固定连接有电源 箱， 所述电源箱的顶部固定连接有控制器， 所述电源箱、 控制器和电热。

13、片之间通过导线电性 连接， 所述电控槽的两侧之间固定连接有挡板， 所述挡板的一侧开设有透气孔。 0009 优选的， 所述罐体的底部一端开设有出水口， 所述出水口贯穿罐体和内罐并且与 水浴管道连通， 所述出水口的内部安装有电控阀， 所述电控阀通过导线与控制器电性连接。 0010 优选的， 所述入水孔的一侧开设有密封槽， 所述密封槽的内壁远离入水孔的一侧 通过弹簧固定连接有倾斜块， 所述倾斜块与密封槽的内壁滑动连接， 所述倾斜块的底部固 定连接有密封块。 0011 优选的， 所述保温盖的顶部固定连接有提手。 0012 优选的， 所述内罐的内壁之间滑动连接有支架。 0013 优选的， 所述支架的顶部。

14、两端均固定连接有把手。 0014 （三） 有益效果 本发明提供了一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法。 具备以下有益效果： （1） 、 该脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 通过脐带酶解前应切成小块放入保温罐 中冷藏， 冷藏持续时间为26个月， 将过滤后的脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行 培养， 培养时间为2天， 更换无血清培养基， 并在无血清培养基中添加无血清营养添加物， 定 期更换培养基， 直至产生细胞簇， 从不同位置细胞簇中分别取部分细胞并分组标号， 将不同 组的细胞分别进行诱导分化培养， 检测分化后的细胞活性， 剔除细胞活性较差的细胞簇， 能 够有效去除存在基因缺陷的细胞， 降低对。

15、干细胞接受者的损害。 0015 （2） 、 该脐带间充质干细胞的制备和提取方法， 通过将优选后的细胞簇分组保存在 保温罐中， 脐带酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏， 所述保温罐包括罐体， 所述罐体的内 壁固定连接有保温层， 所述保温层的内壁两侧均固定连接有电热片， 所述电热片的内侧固 定连接有内罐， 所述内罐的内部开设有水浴管道， 所述水浴管道的一端贯穿内罐并且延伸 至内罐的顶部， 所述罐体的顶部安装有保温盖， 所述保温盖的顶部一端开设有与水浴管道 相适配的入水孔， 加热和冷藏时分别向水浴管道内通入热水和冰水， 电热片加热时温度传 递到内罐也经过水浴管道内水流的缓冲， 使干细胞加热和冷藏过程中。

16、温度变化更加平和， 避免细胞提取过程中的温度改变容易使细胞失活， 降低细胞的提取率的问题。 附图说明 0016 图1为本发明装置结构示意图； 图2为本发明密封槽结构示意图； 图3为本发明电控槽结构示意图； 图中： 1-罐体、 2-保温层、 3-电热片、 4-内罐、 5-水浴管道、 6-保温盖、 7-入水孔、 8-电控 槽、 9-电源箱、 10-控制器、 11-挡板、 12-透气孔、 13-出水口、 14-电控阀、 15-密封槽、 16-弹 簧、 17-倾斜块、 18-密封块、 19-提手、 20-支架、 21-把手。 具体实施方式 说明书 2/4 页 5 CN 108865984 A 5 00。

17、17 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0018 请参阅图1-3， 本发明提供一种技术方案： 一种脐带间充质干细胞的制备和提取方 法， 其特征在于： 包括以下步骤， （1） 清洗， 用蒸馏水将脐带冲洗干净， 然后用酒精棉将脐带表面擦拭干净； （2） 酶解， 取出脐带粉碎处理， 使用浓度为0.1%的胶原酶处理， 酶解时间为68小时； （3） 过滤， 。

18、向脐带酶解液中带入5倍体积的蒸馏水， 使用筛网进行初步过滤， 然后倒入差 速分离机中进一步过滤； （4） 原代培养， 将过滤后的脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行培养， 培养时间为 2天； （5） 传代培养， 更换无血清培养基， 并在无血清培养基中添加无血清营养添加物， 定期 更换培养基， 直至产生细胞簇； （6） 活性检测， 从不同位置细胞簇中分别取部分细胞并分组标号， 将不同组的细胞分别 进行诱导分化培养， 检测分化后的细胞活性， 剔除细胞活性较差的细胞簇， 能够有效去除存 在基因缺陷的细胞， 降低对干细胞接受者的损害； （7） 冷冻保存， 将优选后的细胞簇分组保存在保温罐中， 保温罐的。

19、温度应为4。 0019 酶解液在差速离心机中的离心时间应为10min， 离心力应为200g。 0020 脐带酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏， 冷藏持续时间为26个月。 0021 保温罐包括罐体1， 罐体1的内壁固定连接有保温层2， 保温层2的内壁两侧均固定 连接有电热片3， 电热片3的内侧固定连接有内罐4， 内罐4的内部开设有水浴管道5， 水浴管 道5的一端贯穿内罐4并且延伸至内罐4的顶部， 罐体1的顶部安装有保温盖6， 保温盖6的顶 部一端开设有与水浴管道5相适配的入水孔7， 加热和冷藏时分别向水浴管道5内通入热水 和冰水， 电热片3加热时温度传递到内罐4也经过水浴管道5内水流的缓冲， 使。

20、干细胞加热和 冷藏过程中温度变化更加平和， 避免细胞提取过程中的温度改变容易使细胞失活， 降低细 胞的提取率的问题。 0022 罐体1的一侧开设有电控槽8， 电控槽8的内壁底部固定连接有电源箱9， 电源箱9的 顶部固定连接有控制器10， 电源箱9、 控制器10和电热片3之间通过导线电性连接， 电控槽8 的两侧之间固定连接有挡板11， 挡板11的一侧开设有透气孔12。 0023 罐体1的底部一端开设有出水口13， 出水口13贯穿罐体1和内罐4并且与水浴管道5 连通， 出水口13的内部安装有电控阀14， 电控阀14通过导线与控制器10电性连接。 0024 入水孔7的一侧开设有密封槽15， 密封槽1。

21、5的内壁远离入水孔7的一侧通过弹簧16 固定连接有倾斜块17， 倾斜块17与密封槽15的内壁滑动连接， 倾斜块17的底部固定连接有 密封块18。 0025 保温盖6的顶部固定连接有提手19。 0026 内罐4的内壁之间滑动连接有支架20。 0027 支架20的顶部两端均固定连接有把手21。 0028 工作时， 用蒸馏水将脐带冲洗干净， 然后用酒精棉将脐带表面擦拭干净， 取出脐带 说明书 3/4 页 6 CN 108865984 A 6 粉碎处理， 使用浓度为0.1%的胶原酶处理， 酶解时间为68小时， 向脐带酶解液中带入5 倍体积的蒸馏水， 使用筛网进行初步过滤， 然后倒入差速分离机中进一步过。

22、滤， 将过滤后的 脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行培养， 培养时间为2天， 更换无血清培养基， 并在 无血清培养基中添加无血清营养添加物， 定期更换培养基， 直至产生细胞簇， 从不同位置细 胞簇中分别取部分细胞并分组标号， 将不同组的细胞分别进行诱导分化培养， 检测分化后 的细胞活性， 剔除细胞活性较差的细胞簇， 将优选后的细胞簇分组保存在保温罐中， 保温罐 的温度应为4即可。 0029 需要说明的是， 在本文中， 诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实 体或者操作与另一个实体或操作区分开来， 而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存 在任何这种实际的关系或者顺序。 而且， 术语 。

23、“包括” 、“包含” 或者其任何其他变体意在涵盖 非排他性的包含， 从而使得包括一系列要素的过程、 方法、 物品或者设备不仅包括那些要 素， 而且还包括没有明确列出的其他要素， 或者是还包括为这种过程、 方法、 物品或者设备 所固有的要素。 在没有更多限制的情况下。 由语句 “包括一个.限定的要素， 并不排除 在包括所述要素的过程、 方法、 物品或者设备中还存在另外的相同要素” 。 0030 尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 对于本领域的普通技术人员而言， 可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换 和变型， 本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。 说明书 4/4 页 7 CN 108865984 A 7 图1 说明书附图 1/3 页 8 CN 108865984 A 8 图2 说明书附图 2/3 页 9 CN 108865984 A 9 图3 说明书附图 3/3 页 10 CN 108865984 A 10 。