技术领域
本发明涉及一种降低海藻糖浊度的方法，属于分离提取技术领域。
背景技术
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1,1键结合而成的非还原性双糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、低等植物及昆虫中。经研究发现，该糖具有独特的生物学功能，有保护生物大分子，保护细胞膜，保护蛋白质免受冷冻、干燥及渗透压变化等造成的破坏的作用，在食品、医药、化妆品、农业等领域均具有广泛应用。
目前，国内外市场对海藻糖的需求不断扩增，其生产技术也在不断追求进步。早期，海藻糖产品主要通过从酵母细胞中提取，产率低，成本高，工艺复杂，限制海藻糖的应用；近年来，在许多微生物中发现能够一步转化麦芽糖生成海藻糖的海藻糖合酶，该途径不消耗高能物质，不依赖磷酸，且底物麦芽糖价格低，便于获得，与海藻糖相比有较大的价格空间。因此，该途径极有工业化前景。
如中国专利文献CN101831474A(申请号201010137964.2)公开了一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法，包括恶臭假单胞菌培养步骤、β-巯基乙醇处理步骤和发酵步骤。该发明以麦芽糖为底物，通过制备恶臭假单胞菌的透性细胞，利用其细胞内海藻糖合酶将麦芽糖一步转化为海藻糖。经测定，用β-巯基乙醇处理的恶臭假单胞菌透性细胞溶液中约有3％～5％的海藻糖生成。
目前，酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液中除了海藻糖外，还含有麦芽糖、葡萄糖等糖类，此外还有蛋白、色素和金属离子等杂质。因此需要经过系列纯化过程才能得到纯度较高的海藻糖。
但由于酶转化法中的反应液中糖的成分复杂，因此，现有技术中的分离手段并不适用于酶转化法中的反应液。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种降低海藻糖浊度的方法。此方法通过将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液依次经糖化酶酶解、第一次活性炭过滤、弱碱性阴离子树脂过滤、弱酸性阳离子树脂过滤、第二次活性炭过滤、醇滤等步骤处理，成功将海藻糖成品的纯度从78.1％提升至99.8％，浊度从0.06降低至0.001。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种降低海藻糖浊度的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至80～100℃，保温10～30分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为12～24U/ml，调pH 4.0～7.0，控制糖化温度为60～65℃，酶解时间8～12h，然后升温至80～100℃，保温10～30分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质量0.5％～3％的活性炭，脱色20～60分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.5～0.8％的柠檬酸、0.1～0.5％的NaCl以及6～8％的ZnCl2后依次经过弱碱性阴离子树脂和弱酸性阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量0.5％～3％的活性炭进行脱色后过滤，脱色20～60分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.3～0.8％的Na2CO3、8～12％的乙醇后静置0.5～1.5小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入质量占四次滤液总质量5～10％的无水乙醇、0.1～3％的晶种并进行浓缩起晶后降温至20～30℃进行自然结晶，离心后得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶进行干燥，得到海藻糖成品。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.6％的柠檬酸、0.3％的NaCl以及6.5％的ZnCl2后依次经过弱碱性阴离子树脂和弱酸性阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量1％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.6％的Na2CO3、10％的乙醇后静置1小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入质量占四次滤液总质量8％的无水乙醇、2％的晶种并进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，离心后得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶进行干燥，得到海藻糖成品。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，一次滤液依次流经弱碱性阴离子树脂和弱酸性阳离子树脂的速度为15～20mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，一次滤液依次流经弱碱性阴离子树脂和弱酸性阳离子树脂的速度为15mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中乙醇的浓度为70％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，浓缩的温度为45～55℃。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，浓缩的温度为50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，结晶的时间为60～70h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，结晶时间为60h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，离心的时间为10～20min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，离心的时间为16min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，离心的转速2500～3500r/min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，离心的转速2800r/min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(7)中的干燥为将湿结晶于75～85℃的烘箱中干燥6～10h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(7)中的干燥为将湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h。
本发明提供了上述一种降低海藻糖浊度的方法在制备海藻糖方面的应用。
有益效果：
本发明的方法通过将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液依次经糖化酶酶解、第一次活性炭过滤、弱碱性阴离子树脂过滤、弱酸性阳离子树脂过滤、第二次活性炭过滤、醇滤等步骤处理，成功将海藻糖成品的纯度从78.1％提升至99.8％，浊度从0.06降低至0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的海藻糖酶反应液是记载于公开号为CN107227304A、申请号为201710585267.5的专利文献中的利用含有海藻糖合成酶突变体M106K的大肠杆菌重组菌经发酵后得到的(具体可参见此专利文献的实施例1)。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
海藻糖纯度检测方法：高效液相色谱法。
海藻糖浊度检测方法：参照GB/T 23529-2009海藻糖。
实施例1
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.6％的柠檬酸、0.3％的NaCl以及6.5％的ZnCl2后以15mL/min的流速依次经过301阴离子树脂和116阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量1％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.6％的Na2CO3、10％的70％乙醇后静置1小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入8％的无水乙醇、2％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为99.8％，浊度为0.001。
实施例2
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质量0.5％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.5％的柠檬酸、0.1％的NaCl以及6％的ZnCl2后以15mL/min的流速依次经过301阴离子树脂和116阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量0.5％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.3％的Na2CO3、8％的乙醇后静置0.5小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入5％的无水乙醇、0.1％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为99.2％，浊度为0.003。
实施例3
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质3％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.8％的柠檬酸、0.5％的NaCl以及8％的ZnCl2后以15mL/min的流速依次经过301阴离子树脂和116阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量3％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.8％的Na2CO3、12％的70％乙醇后静置1小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入10％的无水乙醇、3％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为99.8％，浊度为0.001。
实施例4
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.6％的柠檬酸、0.3％的NaCl以及6.5％的ZnCl2后以20mL/min的流速依次经过301阴离子树脂和116阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量1％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.6％的Na2CO3、10％的70％乙醇后静置1小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入8％的无水乙醇、2％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为99.6％，浊度为0.002。
对比例1
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液加入2％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(4)将步骤(3)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为78.1％，浊度为0.2。
对比例2
具体步骤如下：
(2)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质量0.5％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.5％的柠檬酸、0.1％的NaCl以及6％的ZnCl2后依次经过弱碱性阴离子树脂和弱酸性阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量0.5％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.3％的Na2CO3、8％的乙醇后静置0.5小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入5％的无水乙醇、0.1％的晶种并进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，离心后得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶进行干燥，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为89.3％，浊度为0.09。
对比例3
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中加入质量占一次滤液总质量0.6％的Na2CO3、10％的70％乙醇后静置1小时，过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的四次滤液中加入8％的无水乙醇、2％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(5)将步骤(4)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为87.3％，浊度为0.1。
对比例4
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.6％的柠檬酸、0.3％的NaCl以及6.5％的ZnCl2后以15mL/min的流速依次经过301阴离子树脂和116阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量1％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入8％的无水乙醇、2％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(6)将步骤(5)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为88.1％，浊度为0.09。
对比例5
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.6％的柠檬酸、0.3％的NaCl后以15mL/min的流速依次经过301阴离子树脂和116阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量1％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量10％的70％乙醇后静置1小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入8％的无水乙醇、2％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度和浊度检测，纯度为89.2％，浊度为0.08。
对比例6
具体步骤如下：
(1)将利用海藻糖合酶转化法制得的海藻糖酶反应液加热至85℃，保温20分钟，降温，然后加入糖化酶，糖化酶加入量为20U/ml，调pH 6.0，控制糖化温度为65℃，酶解时间10h，然后升温至95℃，保温20分钟，过滤，制得海藻糖粗液；
(2)向步骤(1)制得的海藻糖粗液中添加质量占海藻糖粗液总质1％的活性炭，脱色45分钟，过滤，得到一次滤液；
(3)在步骤(2)制得的得到一次滤液中添加质量占一次滤液总质量0.3％的NaCl以及6.5％的ZnCl2后以15mL/min的流速依次经过301阴离子树脂和116阳离子树脂后进行过滤，得到二次滤液；
(4)在步骤(3)制得的二次滤液中加入质量占二次滤液总质量1％的活性炭进行脱色后过滤，脱色45分钟，过滤，得到三次滤液；
(5)在步骤(4)制得的三次滤液中加入质量占三次滤液总质量0.6％的Na2CO3后静置1小时，过滤，得到四次滤液；
(6)在步骤(5)制得的四次滤液中加入8％的无水乙醇、2％的晶种，于50℃进行浓缩起晶后降温至25℃进行自然结晶，结晶60h后，于转速2800r/min下离心16min得湿结晶；
(7)将步骤(6)得到的湿结晶于80℃的烘箱中干燥8h，得到海藻糖成品。
将得到的海藻糖成品进行纯度检测，纯度为89.5％，浊度为0.09。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。