技术领域
本发明涉及一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法。
背景技术
表皮生长因子(EGF)是一类重要的生长因子，是类EGF大家族的一个成员。它是由50-60个氨基酸分子组成的肽链，链中含有6个半胱氨酸分子，半胱氨分子间形成稳定的双硫键。使整条肽链成为三个环联部分的活性物质。它是一种广泛存在于人或其它动物体内的小分子多肽，极微量即能强烈刺激细胞生长、抑制衰老基因的出现，延缓表皮细胞衰老。他通过与其受体相结合发挥作用。
表皮生长因子通过与细胞表面的受体表皮生长因子受体(EGFR)结合而起作用。与表皮生长因子受体的高亲和力结合，激发受体内在的酪氨酸激酶的活性，从而启动了信号传导级联而导致多种生物化学变化，细胞内钙水平上升，增加糖酵解与蛋白质合成,增加某些基因(包括表皮生长因子受体)的表达，最终导致DNA合成和细胞增殖。
猪EGF蛋白含53个氨基酸残基，相对分子质量6.2KD，主要由唾液腺、乳汁、Paneth细胞、十二指肠的Brunners腺和胰腺等分泌至胃肠道，在消化道中发挥作用，EGF对酸和热非常稳定，对抵抗多种消化酶的消化作用，因此这对其维持结构的稳定和发挥生物学作用具有重要的意义。
乳酸乳球菌是人体和畜禽体内的益生菌，能够定殖于肠道，可以很好的维持微生态平衡，分泌多种促生长酶类，促进消化，能够分泌维生素及抗菌肽，对肠道健康与有害微生物的抑制具有重要作用。同时乳酸乳酸菌已在各个领域广泛应用，已证实其为安全级微生物，无致病性。
发明内容
本发明其目的就在于提供一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法，对表达的重组猪表皮生长因子进行了纯化，并对重组蛋白进行了Tricine-SDS-PAGE鉴定。
为实现上述目的而采取的技术方案是，
一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌，所述的重组乳酸乳球菌为pEGF-pNZ8148-NZ9000。
一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）用限制性内切酶分别对pNZ8148质粒和pEGF基因进行双酶切；
（2）使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对酶切产物进行回收，再经T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接反应后转化至大肠杆菌MC1061感受态细胞中，使用氯霉素抗性进行筛选后，经酶切鉴定、PCR鉴定得出正确的重组质粒；
（3）提取重组质粒并电转至乳酸乳球菌NZ9000中，再经PCR鉴定正确，得到重组乳酸乳酸球菌株pEGF-pNZ8148-NZ9000。
有益效果
与现有技术相比本发明具有以下优点。
本发明对表达的重组猪表皮生长因子进行了纯化，并对重组蛋白进行了Tricine-SDS-PAGE鉴定。
附图说明
以下结合附图对本发明作进一步详述。
图1为筛选猪表皮生长因子基因与pNZ8148质粒连接的阳性克隆子电泳图（引物pEGF-F和pEGF-R，产物约189bp）；
图2为乳酸乳球菌NZ9000表达pEGF蛋白的Tricine-SDS-PAGE图（蛋白大小在6.2KD左右）；
图3为pNZ8148质粒图谱。
具体实施方式
一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌，所述的重组乳酸乳球菌为pEGF-pNZ8148-NZ9000。
一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌的构建方法，如图1-3所示，包括以下步骤：
（1）用限制性内切酶分别对pNZ8148质粒和pEGF基因进行双酶切；
（2）使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对酶切产物进行回收，再经T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接反应后转化至大肠杆菌MC1061感受态细胞中，使用氯霉素抗性进行筛选后，经酶切鉴定、PCR鉴定得出正确的重组质粒；
（3）提取重组质粒并电转至乳酸乳球菌NZ9000中，再经PCR鉴定正确，得到重组乳酸乳酸球菌株pEGF-pNZ8148-NZ9000。
所述的对pNZ8148质粒和pEGF基因进行双酶切的两种限制性内切酶分别为NcoI、 XbaI。
所述氯霉素筛选所用的浓度分别为50ug/ml和25ug/ml。
实施例1
猪表皮生长因子基因合成
对猪表皮生长因子氨基酸序列（AF336151）进行分析，去掉上游信号肽序列，得到53氨基酸的成熟肽序列：
NSYSECPPSHDGYCLHGGVCMYIEAVDSYACNCVFGYVGERCQHRDLKWWELR
通过乳酸乳球菌的密码子偏好性对该序列进行密码子优化，在序列上游添加6个组氨酸的核苷酸，便于重组蛋白的验证及纯化，并在其上下游分别设计NcoI和XbaI两个限制性内切酶位点及保护性碱基，对优化好的序列进行人工合成：CATGCCATGGCATCATCATCATCATCATAATAGCTATAGCGAATGTCCACCATCTCATGATGGTTATTGTTTACATGGTGGAGTTTGTATGTATATTGAAGCAGTTGATTCATATGCTTGTAATTGTGTTTTTGGATATGTGGGAGAAAGATGTCAACATAGAGATTTAAAATGGTGGGAATTACGTTCTAGAGC
实施例2
构建重组质粒pEGF-pNZ8148
1、相关培养基的配制
LB固体培养基：0.5% 酵母提取物，1%蛋白胨，0.5% NaCl2,2%琼脂LB液体培养基：0.5% 酵母提取物，1%蛋白胨，0.5% NaCl2
2、 pEGF基因和pNZ8148质粒的双酶切反应
用NcoI和XbaI分别对pEGF基因和pNZ8148质粒双酶切，
双酶切反应体系如下：
体系 体积（ul）
NcoI 2
XbaI 2
pEGF基因/pNZ8148质粒 20
BSA 1
10×M buffer 5
ddH2O 20
总体积 50
于37℃温箱反应3h后，加入10ul的6×loading buffer，使用1.2 %琼脂糖凝胶电泳分别跑胶，使用凝胶回收试剂盒回收pEGF基因和pNZ8148质粒的双酶切片段。
3、 pEGF基因和pNZ8148质粒的连接反应
回收好的pEGF基因和pNZ8148质粒用T4 DNA连接酶连接。
T4 DNA连接酶连接体系：
体系 体积（ul）
pEGF基因 8
pNZ8148质粒 9
T4DNA连接酶 1
10×buffer 2
总体积 20
将反应体系放入4℃冰箱静置反应18h。
4、 MC1061大肠杆菌感受态细胞的制备
4.1 从LB培养基平板上挑取大肠杆菌MC1061单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
4.2 取1ml过夜培养物加至50 mL LB液体培养基中,振荡培养2-3h，至OD600≈0.4；
4.3 用预冷的50 mL离心管于4℃离心，2500rpm离心10min，弃上清；
4.4 用预冷的25 mL 0.1M CaCl2重悬菌体，冰上静置10min，于4℃离心，2500rpm离心10min，弃上清，回收菌体；
4.5用预冷的2.5 mL 0.1M CaCl2重悬菌体，分装每管100uL，于-80℃冻存备用。
5、连接产物转化MC1061大肠杆菌感受态细胞
5.1 取出-80℃冻存的大肠杆菌MC1061感受态细胞（100ul装），握于手心中20sec快速融化后置于冰上；
5.2 吸取15uL连接产物轻轻加至大肠杆菌MC1061感受态细胞底部，冰浴30min；
5.3 42℃水浴热击90sec，迅速放置冰上1min；
5.4 加入预冷的LB培养基900ul，置于37℃摇床培养120rpm缓慢复苏40min；
5.5 复苏的转化产物涂于含氯霉素50ug/mL的LB固体平板上，每个平板涂200uL,37℃倒置培养16-18h。
6、转化子菌落PCR扩增鉴定
pEGF-F：CCATGGCATCATCATCATCATCA
pEGF-R：TCTAGAACGTAATTCCCACCATTT
使用pEGF-F和pEGF-R引物对转化子进行菌落PCR扩增鉴定，PCR体系如下：
体系 体积（ul）
pEGF-F 1
pEGF-R 1
dNTP 1
10×buffer 2
transT-Taq酶 0.5.
转化子菌液 2
ddH2O 12.5
总体积 20
PCR扩增反应程序：
预变性 95℃ 5min
变性 95℃ 30sec
退火 55℃ 30sec
延伸 72℃ 1min
总延伸 72℃ 5min
变性，退火，延伸，30 cycle
扩增完成后加入10ul 6×loading buffer， 0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，疑似阳性转化子有159bp的目的条带；
将疑似阳性转化子的PCR原液送北京奥科生物工程有限公司测序，测序结果与目的基因进行序列对比，匹配度100%。
实施案例3
构建重组菌株EGF-pNZ8148-NZ9000
1、相关培养基及试剂的配制
M17肉汤，M17琼脂，购于青岛海博生物技术有限公司。
GM17：M17培养基加2%葡萄糖。
SGM17G：GM17培养基加17%蔗糖加1.8%甘氨酸。
复苏培养基：GM17培养基加17%蔗，20mM MgCl2及2mM CaCl2。
感受态洗涤液：17g蔗糖，10ml甘油，用 ddH2O定容至100mL。
2、乳酸乳球菌NZ9000感受态的制备
2.1 在M17琼脂平板上划线复苏乳酸乳球菌NZ9000，30℃倒置培养48；
2.2培养种子液：挑取乳酸乳球菌NZ9000单菌落接种于5ml GM17中，30℃静置培养过夜。
2.3 100ml SGM17G中加入2ml过夜培养好的种子液，30℃静置培养至OD600=0.4-0.5，4℃ 2500rpm离心10min，弃上清培养基。
2.4加入预冷感受态洗涤液25mL，缓慢重悬菌体，冰浴15min后，4℃ 2500rpm离心10min，弃上清培养基。
2.5加预冷感受态洗涤液1mL，缓慢重悬菌体，分装成90ul每管，立即电转使用或放于-80℃保存。
3、重组质粒EGF-pNZ8148电转乳酸乳球菌NZ9000
将质粒小量提取试剂盒提取的EGF-pNZ8148重组质粒电转化乳酸乳球菌NZ9000,电转化步骤如下：
3.1将90ul乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中加入10ul EGF-pNZ8148重组质粒，冰浴30min；
3.2将冰浴完成后的重组质粒和感受态混合物缓慢加入2mm电转杯底部，冰浴10min；
3.3设置参数电压2500V、电容50uF、电阻200Ω，电转完成后迅速加入900uL预冷的修复培养基，轻轻混匀后转移至1.5mlEP管中，30℃摇床80rpm缓慢复苏2h；
3.4复苏好的转化产物涂于含氯霉素25ug/mL的GM17培养基平板上，每个平板涂200uL,30℃倒置培养48-72h。
4、转化子PCR扩增鉴定
对电转化长出的单克隆进行扩大培养，生长良好的菌液离心收集菌体，加适量溶菌酶裂解细胞壁并提取质粒，以质粒为模板，进行PCR扩增鉴定，PCR体系和扩增条件与鉴定MC1061重组菌相同。
实施例4
重组乳酸乳酸球EGF-pNZ8148-NZ9000的表达
平板上挑取重组乳酸乳球菌EGF-pNZ8148-NZ9000单菌落接种于含氯霉素25ug/mL的5mL GM17液体培养基中，30℃静置培养过夜；将过夜培养物分别吸取2mL各加入含氯霉素25ug/mL的50mL GM17液体培养基中，30℃培养到OD600=0.4，向其中一瓶加5ul诱导剂nisin母液，继续静置诱导培养24h，常温 2500rpm离心10min，收集培养基80ul，加5×SDS-PAGE loading buffer 20ul，沸水浴15min。
实施例5
重组pEGF的纯化
1、饱和硫酸铵沉淀培养基上清中的pEGF
培养完成的菌液最大转速离心30min，弃菌体沉淀，将等体积的饱和硫酸铵溶液（4.1mol/L，25℃）边搅拌边慢慢加入，加完放磁力搅拌器上4℃搅拌过夜，使蛋白充分沉淀。10000rpm 4℃离心30min，弃上清保留沉淀，将沉淀溶于少量（10-20mL）PBS-0.2g/L叠氮钠中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小时更换透析缓冲液，以彻底去除硫酸铵。
2、重组pEGF蛋白镍柱纯化
相关试剂如下：
母液1：29.22g氯化钠，2.42gTris-Base，ddH2O定溶至1L，调节pH=8.0。
母液2：6.06gTris-Base，ddH2O定溶至1L，调节pH=8.0。
Binding buffer：0.1702g咪唑，溶于500 mL母液1。
Elution buffer：17.02g咪唑，溶于500 mL母液1。
Washing buffer: 2.3828g咪唑，溶于500 mL母液2。
先用Binding buffer平衡镍离子亲和层析柱，然后将待纯化的样品上样于镍柱，结合30min左右，收集留出液Flow Through，用Washing buffer洗3个柱体积，收集Wash throngh，最后用Elution buffer洗脱蛋白，收集Eluent.将Binding buffer，Wash throngh，Eluent。
将镍柱收集的蛋白用Milipore压力超滤浓缩装置通过30kDa超滤膜截留浓缩至10mL左右，将样品通过Gel filtration buffer平衡过的Superdex200分子筛进行分离。
实施例6
重组pEGF的Tricine-SDS-PAGE
1、相关试剂的配制
1.1 AB-3浓缩胶：9.6g丙烯酰胺，0.3g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；AB-6分离胶：9.3g丙烯酰胺，0.6g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；凝胶缓冲液：2.422g Tris，0.02g SDS，溶于20ml水，pH=8.45
1.2 15%分离胶（Separating gel）
成分 体积（mL）
ddH2O 7.5
AB-6 5
凝胶缓冲液 1
甘油 1.5
10 %过硫酸铵 0.05
TEMED 0.005
总体积 15
1.3 10%浓缩胶（Spacer gel）
成分 体积（mL）
ddH2O 1.1
AB-3 0.6
凝胶缓冲液 1
甘油 0.3
10 %过硫酸铵 0.015
TEMED 0.0015
总体积 3
1.4 4%浓缩胶（Stacking gel）
成分 体积（mL）
ddH2O 4
AB-3 0.5
凝胶缓冲液 1.5
10 %过硫酸铵 0.045
TEMED 0.0045
总体积 6
1.5 考马斯亮蓝染色液：称取1.0g考马斯亮蓝R-250，加入50ml冰醋酸、25ml无水乙醇和425mlddH2O，搅拌溶解后过滤；
1.6考马斯亮蓝脱色液：50ml冰醋酸、25ml无水乙醇，用ddH2O定容至500ml；
2、纯化pEGF的Tricine-SDS-PAGE
将纯化的pEGF中添加SDS-PAGE loading buffer，沸水浴15min，以蛋白质标准分子量为参考，在Tricine-SDS-PAGE蛋白胶上电泳，由15% Separating gel，10% Spacer gel，4% Stacking gel灌制三层的Tricine-SDS-PAGE蛋白胶，插入1mm胶梳，室温下凝固。制备完成后拔下胶梳，立即将胶板固定于电泳装置上，电泳槽内加入电泳缓冲液，排尽凝胶底部玻璃板间的气泡，每孔加样20μL,接通电源，进入分离胶之前30V,之后100 V,在跑至分离胶底部之前调至200V，电泳完成后取下凝胶，考马斯亮蓝染色液中染色过夜，过夜染色完成后，使用考马斯亮蓝脱色液进行脱色，每30分钟换脱色液，直到看到清晰的条带为止，结果如图2所示。