高效降解有机磷农药的多功能木霉菌及其菌剂.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610636077.7 (22)申请日 2016.08.05 (83)生物保藏信息 CGMCC N0.12630 2016.06.24 (71)申请人 山东省科学院生态研究所 地址 250014 山东省济南市历下区科院路 19号 (72)发明人 张广志张新建吴晓青周红姿 赵晓燕周方园 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 于晓晓 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) B09C 1/10(2006.01) A01N 6。

2、3/04(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (54)发明名称 高效降解有机磷农药的多功能木霉菌及其 菌剂 (57)摘要 本发明公开了一种高效降解有机磷农药的 多功能木霉菌及其菌剂， 该木霉菌为西蒙斯木霉 (Trichodermasimmonsii)T21-3， 于2016年6月 24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心， 保藏编号:CGMCCN0.12630。 该菌 剂既能高效降解有机磷农药残留， 又能防治多种 蔬菜土传病害。 权利要求书2页 说明书7页 CN 107338195 A 2017.11.10 CN 10。

3、7338195 A 1.一种高效降解有机磷农药的多功能木霉菌， 其特征在于， 该木霉菌为西蒙斯木霉 (Trichoderma simmonsii) T21-3， 于2016年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 保藏编号： CGMCC N0.12630。 2.如权利要求1所述的高效降解有机磷农药的多功能木霉菌在降解土壤中的有机磷农 药残留方面的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的有机磷农药为甲胺磷、 毒死蜱、 氧化 乐果、 对硫磷、 水胺硫磷、 辛硫磷中的任意一种。 4.如权利要求1所述的高效降解有机磷农药的多功能木霉菌在防治蔬菜土传病害方面 。

4、的应用。 5. 根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述的土传病害为以下菌中的至少一种 引起的： 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、 尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、 瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum)、 腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)及灰葡萄孢菌 （Botrytis cinerea） 。 6. 根据权利要求2和/或4所述的应用， 其特征在于， 将西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii) T21-3制备成木霉菌剂， 该木霉菌剂有效成分为活体木。

5、霉分生孢子3 108cfu/g。 7.如权利要求1所述的高效降解有机磷农药的多功能木霉菌制备的木霉菌剂， 其特征 在于， 所述木霉菌剂为可湿性粉剂， 由按重量比的以下成分组成： 西蒙斯木霉T21-3分生孢 子粉23%， 羧甲基纤维素钠12%， 黄原胶12%， 黄腐酸钠1-2%， 葡萄糖510%， 硅藻土75 85%， 含水量控制在5%以下。 8.根据权利要求7所述的木霉菌剂， 其特征在于， 该木霉菌剂的制备包括以下步骤： a.制备西蒙斯木霉T21-3种子液； b.制备固体发酵培养基； c.将所述步骤a所得种子液按1%比例与步骤b固体发酵培养基混合， 发酵， 得到固体 西蒙斯木霉T21-3发酵物。

6、； d.将所述步骤c所获西蒙斯木霉T21-3发酵物粉碎， 过60或80目筛； e.将硅藻土、 黄原胶、 羧甲基纤维素钠、 黄腐酸钠、 葡萄糖与步骤d所获原料混合， 搅 拌均匀充分混合后得到浅绿色粉状物， 即为木霉菌剂。 9.根据权利要求8所述的木霉菌剂， 其特征在于， 该木霉菌剂的制备包括以下步骤： a.将西蒙斯木霉T21-3菌种接入PDA培养基中活化后， 转接于PDA固体培养基或麦粒 培养基上， 置于28恒温培养箱中培养57d， 待其产生大量的分生孢子， 用无菌水洗脱， 即 得到西蒙斯木霉T21-3种子液， 所述PDA培养基是去皮马铃薯200克、 葡萄糖20克、 琼脂粉15 克， 加水至10。

7、00mL混合而成； 所述麦粒培养基是将小麦粒用水浸泡， 过夜， 121条件下湿热 灭菌； b.制备固体发酵培养基： 玉米秸秆40%、 麦麸5%， 余量为水的混合物在121下灭菌 60分钟， 得到固体发酵培养基； c.将所述步骤a所得种子液按1%比例与步骤b固体发酵培养基混合， 搅拌均匀后用 纱布或封口膜覆盖， 置于温度为25-28恒温静止培养7-10d,木霉分生孢子达到60100 108个/g， 发酵完毕后， 将其自然晾干或干燥， 得到固体西蒙斯木霉发酵物； 权利要求书 1/2 页 2 CN 107338195 A 2 d.将所述步骤c所获固体西蒙斯木霉发酵物粉碎， 过60或80目筛； e.将。

8、硅藻土、 黄原胶、 羧甲基纤维素钠、 黄腐酸钠、 葡萄糖与步骤d所获原料混合， 搅 拌均匀充分混合后得到浅绿色粉状物， 即为木霉菌剂。 10.如权利要求7所述的木霉菌剂在降解土壤中的有机磷农药残留方面以及防治蔬菜 土传病害方面的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107338195 A 3 高效降解有机磷农药的多功能木霉菌及其菌剂 技术领域 0001 本发明涉及高效降解有机磷农药的多功能木霉菌及其菌剂， 属于生物技术领域， 是利用微生物的方法降解化学农药残留， 适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产 与加工。 背景技术 0002 农药污染已成为现在广泛关注的重大农业生态环境问题之一，。

9、 对现代农业和社会 经济的可持续发展、 农业生态环境安全和农产品质量安全构成了严重威胁。 有机磷农药作 为国内外农业中主要的杀虫剂， 杀虫迅速、 高效， 使用成本低， 在现代农业， 尤其设施蔬菜栽 培上大量使用， 为蔬菜农药残留超标的主体。 农药残留是一种面源污染， 浓度低、 范围广， 采 用传统的物理化学处理方法难度大、 成本高， 并且还有二次污染。 利用微生物治理农药残留 是消除和解毒高浓度的农药残留的最安全、 有效且廉价的方法。 0003 国内外专家学者致力于研究有机磷农药的生物降解技术。 降解菌主要从农药污染 土壤或农药厂污泥等受污染的介质中针对某一特定有机磷农药富集、 驯化、 筛选，。

10、 种类主要 集中在细菌， 包括假单胞菌、 芽孢杆菌、 黄杆菌、 节杆菌属、 不动杆菌属、 产碱杆菌、 苍白杆 菌、 布鲁氏菌、 肠杆菌、 红球菌等； 对有机磷农药的降解机理和降解酶基因方面的研究都有 系统的研究。 国内在这方面也做了大量的研究， 取得一系列研究成果， 芽孢杆菌、 恶臭假单 胞菌、 苍白杆菌、 鞘氨醇单胞菌等多个种类申请了国家发明专利。 例如南京农业大学针对部 分有机磷农药、 有机氮、 有机氯类杀虫剂、 杀菌剂和除草剂等， 分离筛选获得500多株高效降 解化学农药的微生物菌株 （主要是细菌） ， 建立了目前我国农药微生物降解最大的菌株种质 资源库， 62个降解菌株及其发酵工艺获得。

11、国家发明专利。 国内外分离筛选的这些降解细菌 对一种或几种有机磷农药表现较强的降解修复潜力， 但研究成果一般处于实验室阶段或小 区试验条件， 实际用于产品登记推广的较少， 加上功能单一， 不利推广和示范， 目前尚不能 满足土壤中实际污染控制的要求。 0004 木霉菌因其生防能力、 促进植物生长、 提高土壤肥力等方面的应用潜力， 在农业生 产领域具有特殊的地位， 是一类研究应用广泛的微生物种类， 国内外均有不少菌株获得微 生物产品 （农药、 肥料或腐熟菌剂） 登记及推广应用。 国内外近些年的研究表明， 木霉对杀虫 剂 （如敌敌畏、 毒死蜱、 DDT、 地特灵、 硫丹等） 、 多环芳香烃、 多氯芳。

12、烃、 氰化物、 重金属 （如镉、 镍、 铜、 铝等） 及塑料等污染物都有较强的降解或修复能力， 同样表现出优越的应用开发潜 力。 0005 设施蔬菜自上世纪80年代中期以来， 得到迅速发展。 由于常年种植或连作， 养分失 调， 病虫害发生严重， 化肥和农药频繁且超量使用， 土壤环境日益恶化 （如土壤次生盐渍化、 酸化、 养分失调） ， 多种农药长期残留， 微生物生态失衡。 发明内容 0006 本发明的目的就是针对国内设施农业土壤中存在的有机磷农药残留， 发病日益严 说明书 1/7 页 4 CN 107338195 A 4 重的土传植物病害等实际问题和需求而提供一种高效降解有机磷农药的多功能木霉。

13、菌及 其菌剂。 本发明的木霉菌株， 对设施农业土壤环境有更好的适应性， 同时对多种常见土传病 害有预防和控制效果， 研发的木霉降解菌剂产品更利于应用和推广。 0007 本发明的高效降解有机磷农药的多功能木霉菌及其菌剂技术方案为， 本发明采用 的降解多种有机磷农药的木霉菌株为西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii) T21-3， 是实 验室从设施番茄土壤中分离筛选出来的， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 100101， 保藏日 期为2016年6月24日， 保藏编号为： CGMCC N0.12。

14、630。 将该菌株TEF-1 序列提交NCBI BlAST 进行相似性比较， 鉴定该木霉为西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii)， TEF-1 基因序列 已经提交到了Genbank数据库， 登录号KX426072。 0008 所述的高效降解有机磷农药的多功能木霉菌在降解土壤中的有机磷农药残留方 面的应用。 0009 所述的有机磷农药为甲胺磷、 毒死蜱、 氧化乐果、 对硫磷、 水胺硫磷、 辛硫磷中的任 意一种。 0010 所述的高效降解有机磷农药的多功能木霉菌在防治蔬菜土传病害方面的应用。 0011 所述的土传病害为以下菌中的至少一种引起的： 立枯丝核菌(Rhizoctonia。

15、 solani)、 尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、 瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、 腐皮镰 孢菌(Fusarium solani)、 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)及灰葡萄孢菌 （Botrytis cinerea） 。 0012 将西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii) T21-3制备成木霉菌剂， 该木霉菌剂有 效成分为活体木霉分生孢子3108cfu/g。 0013 所述木霉菌剂为可湿性粉剂， 由按重量比的以下成分组成： 西蒙斯木霉T21-3分生 孢子粉23%， 羧甲基纤维素钠12%， 黄原胶12%， 黄。

16、腐酸钠1-2%， 葡萄糖510%， 硅藻土 7585%， 含水量控制在5%以下。 0014 该木霉菌剂的制备包括以下步骤： a.制备西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii) T21-3种子液； b.制备固体发酵培养基； c.将所述步骤a所得种子液按1%比例与步骤b固体发酵培养基混合， 发酵， 得到固体 西蒙斯木霉发酵物； d.将所述步骤c所获固体西蒙斯木霉菌发酵物粉碎， 过60或80目筛； e.将硅藻土、 黄原胶、 羧甲基纤维素钠、 黄腐酸钠、 葡萄糖与步骤d所获原料混合， 搅 拌均匀充分混合后得到浅绿色粉状物， 即为木霉菌剂。 0015 该木霉菌剂的制备具体包括以下步骤： a。

17、.将西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii) T21-3菌种接入PDA培养基中活化后， 转 接于PDA固体培养基或麦粒培养基上， 置于28恒温培养箱中培养57d， 待其产生大量的 分生孢子， 用无菌水洗脱， 即得到西蒙斯木霉种子液， 所述PDA培养基是去皮马铃薯200克、 葡萄糖20克、 琼脂粉15克， 加水至1000mL混合而成； 所述麦粒培养基是将小麦粒用水浸泡， 过夜， 121条件下湿热灭菌； b.制备固体发酵培养基： 玉米秸秆40%、 麦麸5%， 余量为水的混合物在121下灭菌 说明书 2/7 页 5 CN 107338195 A 5 60分钟， 得到固体发酵培养基； 。

18、c.将所述步骤a所得种子液按1%比例与步骤b固体发酵培养基混合， 搅拌均匀后用 纱布或封口膜覆盖， 置于温度为25-28恒温静止培养7-10d,木霉分生孢子达到60100 108个/g， 发酵完毕后， 将其自然晾干或干燥， 得到固体西蒙斯木霉发酵物； d.将所述步骤c所获固体西蒙斯木霉发酵物粉碎， 过60或80目筛； e.将硅藻土、 黄原胶、 羧甲基纤维素钠、 黄腐酸钠、 葡萄糖与步骤d所获原料混合， 搅 拌均匀充分混合后得到浅绿色粉状物， 即为木霉菌剂。 0016 所述的木霉菌剂在降解土壤中的有机磷农药残留方面以及防治蔬菜土传病害方 面的应用。 0017 本发明的有益效果为： 本发明从多年栽。

19、培施药的设施蔬菜菜地分离出一株高效降 解多种有机磷农药的木霉菌株西蒙斯木霉T21-3， 该木霉菌株发酵容易， 生产成本低， 对设 施农业土壤环境有较强的适应性， 对环境友好， 不仅能高效降解土壤中的甲胺磷、 毒死蜱、 氧化乐果、 对硫磷、 水胺硫磷、 辛硫磷等多种有机磷农药残留， 减少农药在土壤或蔬菜中的 残留危害； 同时对由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、 尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、 瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、 腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、 大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae)及。

20、灰葡萄孢菌 （Botrytis cinerea） 引起的多种常见土传病害有 预防和控制效果， 减少或替代杀菌剂使用， 有效调控土壤微生物区系。 同时本发明的木霉降 解菌剂产品更利于应用和推广， 在现代设施农业有机(绿色)蔬菜栽培过程中， 具有很高的 应用推广价值。 0018 具体实施方式： 为了更好地理解本发明， 下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案， 但是本发明 并不局限于此。 0019 实施例1 降解有机磷农药的木霉菌剂的制备 本发明采用的降解多种有机磷农药的木霉菌株为西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii) T21-3， 是实验室从设施番茄土壤中分离筛选出来的， 保藏。

21、于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生 物研究所， 100101， 保藏日期为2016年6月24日， 保藏编号为： CGMCC N0.12630。 将该菌株 TEF-1 序列提交NCBI BlAST进行相似性比较， 鉴定该木霉为西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii)， TEF-1 基因序列已经提交到了Genbank数据库， 登录号KX426072。 0020 该木霉菌剂的制备包括以下步骤： a.保存的西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii)T21-3菌种接入PDA平板培养基中活化 后， 转接于。

22、500mL三角瓶中的PDA固体培养基上， 置于28恒温培养箱中培养5d， 待其产生大 量的分生孢子， 用无菌水洗脱， 即得到西蒙斯木霉种子液， 所述PDA培养基是去皮马铃薯200 克、 葡萄糖20克、 琼脂粉15克， 加水至1000mL混合而成； b.制备固体发酵培养基： 玉米秸秆40%、 麦麸5%， 余量为水的混合物， 在121下灭菌60 分钟， 得到固体发酵培养基； c.将所述步骤a所得种子液按1%比例与步骤b固体发酵培养基混合， 搅拌均匀后用纱布 或封口膜覆盖， 置于温度为28的恒温培养箱箱内静止培养8d,木霉分生孢子达到90108 说明书 3/7 页 6 CN 107338195 A 。

23、6 个/g。 发酵完毕后， 将其自然晾干或干燥， 得到固体西蒙斯木霉发酵物， 木霉分生孢子达到 150108个/g； d.将所述步骤c所获固体西蒙斯木霉发酵物粉碎， 过60或80目筛； e.将硅藻土80%、 黄原胶2%、 羧甲基纤维素钠1%、 黄腐酸钠1%、 葡萄糖5%与步骤d所获原 料2%混合， 搅拌均匀充分混合后得到浅绿色粉状物， 含水量控制在5%以下,即为本发明的木 霉菌剂。 0021 实施例2 降解有机磷农药的木霉菌剂的制备 该菌剂的制备包括以下步骤： 本实施案例同实施案例1， 所不同之处在于： 步骤a中， 木霉菌株活化后转接至麦粒固体 培养基上， 置于室温条件下培养7d； 步骤c中，。

24、 接种后同样置于室温条件下(23-28)静止培 养10d,木霉分生孢子达到80108个/g； 步骤e中， 硅藻土75%， 葡萄糖8%， 与步骤d所获原料 3%混合。 0022 实施例3 本发明木霉菌在液体摇瓶条件对有机磷农药的降解试验 步骤一： 将保存的西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii)T21-3菌种接入PDA平板培养 基中活化后， 转接于500mL三角瓶中的PDA固体培养基上， 置于28恒温培养箱中培养5d， 待 其产生大量的分生孢子， 用无菌水洗脱， 稀释， 即得到西蒙斯木霉种子液 （1.0108 CFU/ mL） ； 步骤二： 按100mg/L的浓度含量分别将甲胺磷。

25、、 毒死蜱、 氧化乐果、 对硫磷、 水胺硫磷、 辛 硫磷六种农药原药加入到灭菌后的装有50mL无机盐液体培养基 （MSM） 的250 mL三角瓶中， 分别接种各菌株木霉孢子种子液 （1.0108 CFU/mL） 1 mL， 所述MSM无机盐液体培养基是 K2HPO4 1.50 g， KH2PO4 0.50 g， MgSO47H2O 0.50 g， (NH4)2SO4 0.50 g， FeSO47H2O 0.002 g， CaCl2 0.04 g， NaCl 0.5 g， H2O 1000 ml， pH7.0； 步骤三： 以不接木霉孢子悬液的处理为对照。 每处理重复3次， 置于30 140 rp。

26、m 培 养5 d， 取样， 并利用GC-ECD法检测有机磷农药残留量， 结果如表1所示。 0023 表1多功能木霉菌在液体摇瓶条件下对有机磷农药的降解作用 。 0024 实施例4 本发明木霉菌对几种常见蔬菜土传病原物的抑菌试验 说明书 4/7 页 7 CN 107338195 A 7 步骤一： 分别将保存的木霉T21-3和几种土传病原真菌， 如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、 尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、 瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、 腐皮镰 孢菌(Fusarium solani)、 大丽轮枝菌(Verticillium 。

27、dahliae)及灰葡萄孢菌 （Botrytis cinerea） ， 接种在PDA培养基上活化2d； 步骤二： 用灭菌的直径5mm的打孔器在木霉和各病原真菌菌落边缘打取菌苔， 分别移置 于直径9cm的PDA平板上 （间距6cm） ,25 条件下对峙培养， 没处理重复3次， 以只接病原菌 的为对照； 步骤三： 待对照病原菌菌落快长到木霉接菌点或木霉菌落快长到病原菌接菌点时， 测 量各自菌落的半径， 并计算抑制率。 结果如表2所示。 0025 表2多功能木霉菌对几种土传植物病原真菌的对峙试验 。 0026 实施例5 本发明木霉菌剂对土壤中有机磷农药的降解试验 步骤一： 土壤 （来自寿光设施番茄菜。

28、地） 过20目筛， 处理设两组， A组121湿热灭菌120 分钟， B组不灭菌； 按100mg/Kg的量分别添加甲胺磷、 毒死蜱、 氧化乐果、 对硫磷、 水胺硫磷、 辛硫磷等有机磷农药， 混拌均匀并吸附24h； 步骤二： 将用农药处理过的土壤， 装18 cm15 cm15 cm塑料试验盆， 每盆装土壤 1kg； 步骤三： 将步骤二中的处理， 按5%的接种量加入实施例1中制得的木霉菌剂， 以不加木 霉菌的处理作为对照； 每处理设3盆重复； 步骤四： 将处理组和对照组随机摆放至恒温气候室 （温度282） 内， 按常规盆栽条件 管理， 连续培养2周， 采用GC-ECD的方法， 取土样测定有机磷农药的。

29、残留量。 结果如表3所示。 0027 表3多功能木霉菌对土壤中有机磷农药的降解作用 说明书 5/7 页 8 CN 107338195 A 8 。 0028 实施例6 本发明木霉菌剂对番茄常见土传病害的防治试验 步骤一： 土壤处理。 设施菜地 （寿光市纪台镇吴西刘村） ， 按常规操作施有机肥， 深翻， 起 垅 （采取大小行小高垅方式， 即大行70-80公分， 小行40公分， 垅高10-15公分） 。 自西向东均 分成8等区间， 将2、 4、 6区间作为处理， 3、 5、 7作为对照； 处理区间用实施例1中制得的的本发 明木霉菌剂 （5Kg/亩） 加25Kg湿润细土或有机肥拌匀,并均匀撒施， 耙匀。

30、； 对照区间不施本发 明木霉菌剂。 0029 步骤二： 移栽。 每垅定植两行， 移栽入番茄幼苗， 同时处理垅以5Kg/亩用量灌根。 0030 步骤三： 病害调查及数据分析。 棚内各区间5点取样， 每点调查10株， 统计番茄常见 土传病害发病率， 计算防效； 计算数据用SPSS软件进行统计分析， 检验各处理平均值之间的 差异显著性； 结果如表4所示。 0031 表4本发明木霉菌剂对番茄常见土传病害的防治作用 。 0032 实施例7 本发明木霉菌剂对黄瓜常见土传病害的防治试验 说明书 6/7 页 9 CN 107338195 A 9 步骤一： 土壤处理。 设施菜地 （寿光市纪台镇任家洼村） ， 按。

31、常规操作施有机肥， 深翻， 起 垅 （采取大小行方式， 即大行80厘米， 小行40厘米） 。 自西向东均分成8等区间， 将2、 4、 6区间 作为处理， 3、 5、 7作为对照； 处理区间用实施例1中制得的的本发明木霉菌剂 （5Kg/亩） 加 25Kg湿润细土或有机肥拌匀,并均匀撒施， 耙匀； 对照区间不施本发明木霉菌剂。 0033 步骤二： 移栽。 每垅定植两行 （株距25-30厘米） ， 移栽入黄瓜幼苗， 同时处理垅以 5Kg/亩用量灌根。 0034 步骤三： 病害调查及数据分析。 棚内各区间5点取样， 每点调查10株， 统计黄瓜常见 土传病害发病率， 计算防效； 计算数据用SPSS软件进行统计分析， 检验各处理平均值之间的 差异显著性； 结果如表5所示。 0035 表5本发明木霉菌剂对黄瓜常见土传病害的防治作用 。 说明书 7/7 页 10 CN 107338195 A 10 。