从菌丝体中分步萃取阿维菌素Bsub1a/sub和Bsub2a/sub的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103483405 A (43)申请公布日 2014.01.01 CN 103483405 A (21)申请号 201210192489.8 (22)申请日 2012.06.13 C07H 17/08(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 王玉万 地址 100083 北京市海淀区清华东路 17 号 院 41-5-102 申请人 潘贞德 祖韬玉 (72)发明人 王玉万 潘贞德 戴晓羲 (54) 发明名称 从菌丝体中分步萃取阿维菌素 B1a和 B2a的方 法 (57) 摘要 本发明是一种从阿弗曼链霉菌菌丝体中选择 性萃取阿维菌素 B1a和。

2、 B2a的方法， 该方法的突出 特征在于从菌丝体中萃取阿维菌素 B1a和 B2a是分 两步完成的， 先用水/甲醇或水/乙醇共溶剂从菌 丝体中选择性萃取出 B2a， 然后在用甲醇或乙醇等 有机溶剂萃取菌体中的 B1a。采用本方法可将 B1a 和B2a有效的拆分开， 便于后续分离纯化B1a和B2a， 可提高 B1a和 B2a的结晶收率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103483405 A CN 103483405 A 1/1 页 2 1. 一种阿维菌素 。

3、B1a和 B2a的选择性萃取方法， 特征在于从菌丝体中萃取阿维菌素 B1a 和 B2a是分两步进行 ： 先用甲醇 / 水或乙醇 / 水共溶剂从菌体中萃取出 B2a， 然后在用有机溶 剂从提取过 B2a的菌体中萃取出 B1a； 2. 按权利要求 1 所述的萃取方法， 特征在于用甲醇 / 水或乙醇 / 水从菌体中萃取 B2a 时， 萃取液中水含量是水加甲醇或乙醇总量的 20 60， 体积比 ； 在萃取液中甲醇或乙醇 含量是水加甲醇或乙醇总量的 40 80， 体积比 ； 3. 按权利要求 2 所述的萃取方法， 特征在于用甲醇 / 水或乙醇 / 水从菌体中萃取 B2a 时， 萃取液中水含量是水加甲醇或。

4、乙醇总量的 40 55， 体积比 ； 在萃取液中甲醇或乙醇 含量是水加甲醇或乙醇总量的 45 60， 体积比 ； 4.按权利要求1所述的萃取方法， 特征在于从提取过B2a的菌体中进一步用有机溶剂萃 取 B1a， 所用的有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 甲苯、 甲基叔丁基醚 ； 5. 按权利要求 1 或 4 任意一项所述的萃取方法， 特征在于从提取过 B2a的菌体中进一 步用有机溶剂萃取 B1a， 所用的有机溶剂包括甲醇或乙醇 ； 6.按权利要求15项中任意一项所述的萃取方法， 特征在于从菌体中分步萃取B1a和 B2a， 萃取方法和操作过程如下 ： a. 发酵产生。

5、的菌丝体滤饼干燥或不干燥， 加入甲醇和水， 含菌丝体、 甲醇和水的混合液 称之为萃取液， 在萃取液中甲醇与水的体积比为 50 55 45 50， 甲醇 / 水与菌体的比 例为 5 1 10 1， 体积 / 重量比 ； b. 搅拌萃取 2 10 小时 ； c. 压滤， 得第一遍萃取滤液和菌渣 A ； d. 用体积比为 50 55 45 50 的甲醇 / 水对菌渣 A 进行第二遍萃取， 压滤， 得第二 遍萃取滤液和菌渣 B ； 检测菌渣 B 中 B2a和 B1a含量， 待 B2a含量为 B1a含量的 1/30 以下时， 即 完成 B2a的萃取过程 ； e. 合并含 B2a的萃取滤液， 经蒸馏浓缩、。

6、 结晶等过程， 即可获得含 B2a的结晶物 ； f. 以上萃取过 B2a后剩下的菌渣 B 用 20 倍量的甲醇分 2 3 次萃取 B1a， 经过滤得含 B1a的萃取滤液和菌渣， 萃取滤液经活性碳脱色或不脱色， 然后去除部分甲醇， 在525条 件下使 B1a结晶析出， 得 B1a粗结晶品， 菌渣废弃， 去环保处理。 权 利 要 求 书 CN 103483405 A 2 1/4 页 3 从菌丝体中分步萃取阿维菌素 B1a和 B2a的方法 技术领域 0001 本发明涉及阿维菌素 B1a和 B2a的提取方法， 具体涉及从菌丝体中分步萃取 B1a和 B2a组份， 采用本萃取方法， 可使 B1a与 B2a。

7、有效分离。 背景技术 0002 阿维菌素是由阿弗曼链霉菌发酵产生的农用抗生素。 它是一组十六元大环内酯类 化合物， 包括阿维菌素 A1a/A1b(A1)、 A2a/A2b(A2)、 B1a/B1b(B1)、 B2a/B2b(B2)， 其中阿维菌素 B1已商 品化， 用于动物寄生虫病防治和农作物害虫防治， 其它组份尚未开发应用。我国于 1993 年 商业化开发成功阿维菌素 B1， 当时的生产菌种发酵过程同时产生 A 组份 (A1和 A2) 和 B 组份 (B1和B2)， 自2009年国内生产厂家开始应用仅产生B组份的突变种株， 来生产阿维菌素B1， 即发酵产物中仅含有 B1(B1a/B1b) 和。

8、 B2(B2a和 B2b)， A1和 A2的含量极少， 仅占总量的 1 3。 0003 本发明涉及的阿维菌素B1a和B2a的选择性提取是指从仅含B组份的菌丝体中提取 B1a和 B2a。已公开的专利 (CN19280758) 中描述了有关 B1a和 B2a的提取方法， 公开的方法概 括为 ： 将菌丝体用有机溶剂萃取， 萃取液中同时含有B1a和B2a， 然后向萃取液中加入盐水， 使 大部分 B1a结晶析出。现阶段工厂使用的方法是 ： 菌丝体烘干后用甲醇萃取， 萃取液经过滤 得萃取滤液， 经蒸馏除去甲醇， 得含 B1a和 B2a的油膏， 油膏用甲苯溶解， 在经水洗涤后， 将甲 苯溶液蒸馏浓缩， 除去。

9、甲苯得油状液， 向油状液中加入适量的甲醇或乙醇， 从而使 B1a大部 分以结晶状态析出， B1a的收率在 75 80左右。上述工艺存在的共同问题是都不能将 B1a 和 B2a完全拆分开， 在母液中除含有 B2a， 尚含有 15左右的 B1a无法与 B2a拆分开。因此用 已有的方法提取 B1a， 其收率在 75左右。 0004 本发明是采用分步萃取的方法， 将B1a和B2a从菌丝体中分别萃取出来， 方法的原理 是基于 B1a和 B2a在甲醇 / 水或乙醇 / 水中溶解度的显著差异， 从而选择水 / 甲醇或水 / 乙 醇共溶剂， 先将菌丝体中的 B2a萃取出来， 然后用甲醇或其它溶剂去萃取 B1a。

10、。本方法过程概 括为 ： 第一步用甲醇/水共溶剂或乙醇/水共溶剂浸泡菌丝体， 经过滤或离心得菌丝体滤渣 和水 / 甲醇或乙醇浸提滤液， B1a留在菌丝体中 ； 水 / 甲醇或乙醇浸提滤液中含 B2a， B1a的含 量极少， 仅是 B2a的 1/20 左右 ； 然后用甲醇或乙醇或其它有机溶剂浸泡已萃取过 B2a的菌丝 体滤渣， 将 B1a从菌体中萃取出来。本发明采用不同的溶剂通过萃取的方法将 B1a和 B2a拆 分开， 进一步采用不同的方法将萃取滤液中的 B1a或 B2a结晶出来， 该方法的优点是 B1a和 B2a 可有效的拆分开， 并且 B1a、 B2a各自的收率都可达到 90或更高。拆分出的。

11、 B2a可开发成农 用杀虫药和动物用驱虫药， 具有可观的商业价值。 发明内容 0005 本发明是一种从菌丝体中萃取 B1a和 B2a的方法， 该方法的突出特征是先用水 / 甲 醇或水 / 乙醇共溶剂， 从菌丝体中选择性萃取出 B2a， 然后在用有机溶剂萃取残留在菌体中 的 B1a。本方法要点归纳如下 ： 0006 1、 发酵产生的菌丝体滤饼可干燥或不干燥， 用水 / 甲醇或水 / 乙醇萃取 B2a。实验 说 明 书 CN 103483405 A 3 2/4 页 4 表明， 发酵液经高压隔膜板框压滤， 压至菌丝体滤饼含水量在 40 55时， 在用水 / 甲醇 或水 / 乙醇共溶剂来萃取 B2a，。

12、 B2a的萃取率高， 甲醇或乙醇的用量少， 萃取滤液中杂质少， B2a 易结晶析出， 结晶收率高。 0007 2、 在萃取液中水与甲醇或乙醇的比例在 2 6 4 8， 就是说在萃取液中水的 含量是水加甲醇总量的 20 60范围， 甲醇或乙醇的含量是水加甲醇或乙醇总量的 40 80 ( 体积比 )， 实验表明， 水含量占水加甲醇或乙醇总量的 45 52时最适合， 水在此浓 度范围， 萃取滤液中 B2a浓度为 0.5左右， B1a的溶出率较低， 仅为 0.016左右。 0008 3、 在萃取液中水 / 甲醇或水 / 乙醇共溶剂与菌丝体 ( 折干计 ) 的适合比例为 5 30 1( 体积 / 重量比。

13、 )， 以 10 20 1 的比例较适宜， 在此比例范围， 经 2 次萃取即可将 菌丝体中 B2a萃取出 95以上。 0009 4、 用水 / 甲醇或水 / 乙醇共溶剂萃取过的菌渣， 用于进一步从中萃取 B1a， 萃取 B1a 所用的有机溶剂包括甲醇、 乙醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 MIBK、 甲苯、 甲基叔丁基醚等， 实验表明， 用甲醇/水共溶剂萃取B2a时， 则用甲醇进一步萃取B1a合适， 有成本最低， 便于溶 剂回收等优点 ； 如用乙醇 / 水共溶剂萃取 B2a时， 则用乙醇萃取 B1a合适。因此， 建议采用本 方法分步提取 B1a和 B2a时， 提取 B2a用甲醇或乙醇 / 。

14、水共溶剂， 提取 B1a时则用甲醇或乙醇。 具体实施方式 0010 实例 1、 不同含水量对 B1a和 B2a萃取率的影响 0011 实验用阿维菌素菌丝体粉由浙江升华拜克股份公司提供 ： 菌丝体中含水量为 13 16， B1a含量为 14， B2a含量为 12 ； 实验分 7 组， 分别编号为 NO.1 NO.7， 每组 一瓶， 分别准确称量 7 份菌丝体粉， 每份 10.0g， 于各组的 250ml 具塞三角瓶中， 然后向每个 瓶中分别加入 100ml 甲醇或水 / 甲醇共溶剂， 具体如下 ： 0012 NO.1 加入纯度为 99.5甲醇 100ml 0013 NO.2 加入 100ml 水。

15、 / 甲醇 (2 8， 体积比 ) 0014 NO.3 加入 100ml 水 / 甲醇 (3 7， 体积比 ) 0015 NO.4 加入 100ml 水 / 甲醇 (4 6， 体积比 ) 0016 NO.5 加入 100ml 水 / 甲醇 (4.5 5.5， 体积比 ) 0017 NO.6 加入 100ml 水 / 甲醇 (5 5， 体积比 ) 0018 NO.7 加入 100ml 水 / 甲醇 (6 4， 体积比 ) 0019 上述各组经磁力搅拌萃取3小时， 萃取温度为2627， 萃取液用0.2m膜过滤 得萃取滤液， 萃取滤液中 B1a和 B2a浓度分析采用 HPLC 测定， 采用 C18 。

16、柱 (250mm)， 流动相为 水 / 乙腈 7 93， 流速为 1ml/min， 检测波长为 245nm， 在此条件下 B1a出峰时间在 8.4 8.6min， B2a出峰时间在 6.2 6.4min。 0020 实验结果归纳如下 ： 0021 NO.1 萃取滤液中 B1a浓度为 1.19， B2a浓度为 1.032。 0022 NO.2 萃取滤液中 B1a浓度为 0.548， B2a浓度为 1.15。 0023 NO.3 萃取滤液中 B1a浓度为 0.21， B2a浓度为 1.022。 0024 NO.4 萃取滤液中 B1a浓度为 0.069， B2a浓度为 0.76。 0025 NO.5。

17、 萃取滤液中 B1a浓度为 0.036， B2a浓度为 0.58。 说 明 书 CN 103483405 A 4 3/4 页 5 0026 NO.6 萃取滤液中 B1a浓度为 0.0199， B2a浓度为 0.39 0.425。 0027 NO.7 萃取滤液中 B1a浓度为 0.0042， B2a浓度为 0.101。 0028 以上实验结果可见 ： 采用含水量 40 55的甲醇 / 水共溶剂从菌丝体中萃取 B2a 具有很好的选择性。 0029 实例 2、 菌丝体含水量对萃取效果的影响 0030 实验用 3 种含水量不同的菌丝体， 用甲醇 / 水共溶剂来萃取 B2a， 甲醇 / 水共溶剂 的用量。

18、是菌丝体量 ( 折干计 ) 的 10 倍， 浸提时间为 3 小时， 实验结果见下表。 0031 注 ： 萃取液是指由菌丝体、 水、 甲醇三者组成的混合体系。 0032 从以上实验结果可见， 用含水 50左右的菌丝体提取 B2a合适。 0033 实例 3、 从含水量 45 50的菌丝体滤饼中萃取 B1a和 B2a 0034 取 100g 含水量为 45 50、 含 B1a6.12、 B2a 4.9的菌丝体滤饼， 加入 1 升甲 醇 / 水 (52/48)， 搅拌萃取 2 小时， 之后抽滤， 得第一次萃取滤液和菌渣 A。 0035 HPLC 分析 ： 第一次萃取滤液中 B2a浓度为 0.51， 滤。

19、液中含 B2a总量为 3.92g， B1a 浓度为 0.016， 滤液中含 B1a总量为 0.126g。 0036 菌渣 A 用 10 倍体积的甲醇 / 水 (50/50) 进行二次萃取、 抽滤， 得第二次萃取滤液 和菌渣 B。 0037 HPLC 分析 ： 第二次萃取滤液中 B2a浓度为 0.12， 总量为 1.02g， B1a浓度为 0.0192， 总量为 0.1536g。 0038 从以上数据可见， B2a的萃取率约 100， B1a的萃取率为 4.7。 0039 菌渣 B 进一步用 10 倍量的甲醇萃取 B1a2 次， 采用 HPLC 分析萃取滤液中的 B1a含 量， B1a萃取率可达。

20、 98， 菌渣中残留约 60mg 的 B1a， 仅占 B1a总量的 1.22。 0040 实例 4、 工业化生产工艺过程 0041 (1) 发酵液压滤 ： 发酵结束， 发酵液经预处理后， 用高压板框压滤， 得滤液和菌丝 体滤饼， 滤液去废水池进行环保处理。工艺要点 ： 控制菌丝体滤饼含水量为 40 55。 0042 (2) 第一遍浸提 B2a： 将含水量为 40 55的菌丝体滤饼与 10 倍体积左右的甲醇 / 水 (52 48) 共溶剂混合， 常温搅拌浸提 2 3 小时， 得第一遍萃取液。 0043 (3) 萃取液压滤 ： 用高压隔膜板框压滤第一遍萃取液得第一遍萃取滤液和菌渣 A。 0044 。

21、(4) 第二遍萃取 B2a： 将菌渣 A 返回到萃取罐， 加 10 倍体积左右的甲醇 / 水 (52 48) 共溶剂， 搅拌浸提 1 2 小时， 得第二遍萃取液。 0045 (5) 萃取液压滤 ： 将上述第二遍萃取液通过高压板框压滤， 得第二遍萃取滤液和 说 明 书 CN 103483405 A 5 4/4 页 6 菌渣 B。 0046 (6) 合并第一遍和第二遍含 B2a的萃取滤液， 进一步经蒸馏浓缩、 结晶等过程可获 得纯度大于 88的 B2a结晶。 0047 (7)从菌渣B中萃取B1a： 将菌渣B返回到萃取罐中， 加10倍体积左右的甲醇， 搅拌 浸提 2 小时， 然后压滤， 得含 B1a。

22、的第一遍萃取滤液和菌渣 C。菌渣 C 进一步用 10 倍体积的 甲醇进行二次萃取， 过滤， 得含 B1a的第二遍萃取滤液和菌渣 D。 0048 将含 B1a的第一遍萃取滤液， 进一步经蒸馏浓缩、 结晶等过程可获得纯度大于 90 的 B1a结晶。 0049 含 B1a的第二遍萃取滤液套用下批次的 B1a萃取。提取 B1a后的菌渣去环保处理。 0050 实例 5、 不同含水量对 B1a和 B2a萃取率的影响 0051 实验用阿维菌素菌丝体粉由浙江升华拜克股份公司提供 ： 菌丝体中含水量为 13 16， B1a含量为 14， B2a含量为 12 ； 实验分 7 组， 分别编号为 NO.1 NO.7，。

23、 每组 一瓶， 分别准确称量 7 份菌丝体粉， 每份 10.0g， 于各组的 250ml 具塞三角瓶中， 然后向每个 瓶中分别加入 100ml 乙醇或水 / 乙醇共溶剂， 具体如下 ： 0052 NO.1 加入纯度为 99.5乙醇 100ml 0053 NO.2 加入 100ml 水 / 乙醇 (2 8， 体积比 ) 0054 NO.3 加入 100ml 水 / 乙醇 (3 7， 体积比 ) 0055 NO.4 加入 100ml 水 / 乙醇 (4 6， 体积比 ) 0056 NO.5 加入 100ml 水 / 乙醇 (4.5 5.5， 体积比 ) 0057 NO.6 加入 100ml 水 /。

24、 乙醇 (5 5， 体积比 ) 0058 NO.7 加入 100ml 水 / 乙醇 (6 4， 体积比 ) 0059 上述各组经磁力搅拌萃取3小时， 萃取温度为2627， 萃取液用0.2m膜过滤 得萃取滤液， 萃取滤液中 B1a和 B2a浓度分析采用 HPLC 测定， 采用 C18 柱 (250mm)， 流动相为 水 / 乙腈 7 93， 流速为 1ml/min， 检测波长为 245nm， 在此条件下 B1a出峰时间在 8.4 8.6min， B2a出峰时间在 6.2 6.4min。 0060 实验结果归纳如下 ： 0061 NO.1 萃取滤液中 B1a浓度为 1.22， B2a浓度为 1.0。

25、65。 0062 NO.2 萃取滤液中 B1a浓度为 0.496， B2a浓度为 1.18。 0063 NO.3 萃取滤液中 B1a浓度为 0.167， B2a浓度为 1.014。 0064 NO.4 萃取滤液中 B1a浓度为 0.053， B2a浓度为 0.69。 0065 NO.5 萃取滤液中 B1a浓度为 0.034， B2a浓度为 0.51。 0066 NO.6 萃取滤液中 B1a浓度为 0.0182， B2a浓度为 0.414。 0067 NO.7 萃取滤液中 B1a浓度为 0.0038， B2a浓度为 0.122。 0068 以上实验结果可见 ： 采用含水量 40 55的乙醇 / 水共溶剂从菌丝体中萃取 B2a 具有很好的选择性。 说 明 书 CN 103483405 A 6 。