一种双功能脂肪酶突变体及其在面制品加工中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201480000483.3 (22)申请日 2014.02.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105264070 A (43)申请公布日 2016.01.20 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.10.20 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/CN2014/072549 2014.02.26 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2015/127596 ZH 2015.09.03 (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市。

2、蠡湖大道1800 号 (72)发明人 徐岩喻晓蔚 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11419 代理人 何自刚 (51)Int.Cl. C12N 9/20(2006.01) C12N 1/00(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/19(2006.01) A21D 8/04(2006.01) (56)对比文件 CN 101974499 A,2011.02.16, JP 平3-160992 A,1991.07.10, Tigran V. Yuzbashev et al.Production of recombinant Rhiz。

3、opus oryzae lipase by the yeast Yarrowia lipolytica results in increased enzymatic thermostability. Protein Expression and Purification .2011,第82卷第83-89页. 王睿等.定向进化-易错 PCR 方法提高华根 霉 Rhizopus chinensis CCTCC M201021 脂肪 酶的活力. 生物工程学报 .2009,第25卷(第12 期),第1892-1899页. 审查员 苏存生 (54)发明名称 一种双功能脂肪酶突变体及其在面制品加 工中的应。

4、用 (57)摘要 本发明公开了一种双功能脂肪酶突变体及 其在面制品加工中的应用， 其氨基酸序列发生1) 或2)形式的突变， 1)P298T； P298T/H317P； P298T/ H317P/V326S； P298T/T218S/S234F； P298T/ H317P/P168L/A129S； P298T/S234F/K161R/ V326S； 2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基 的缺失、 取代、 插入或突变， 同源性达到80以上 的核苷酸序列； 该突变体在面制品加工中具有很 好的应用效果， 在馒头等面制品加工中起到显著 增白， 在面包烘焙加工中起到显著增大比容的效 果， 具有很好的应用。

5、前景。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 CN 105264070 B 2017.09.29 CN 105264070 B 1.一种双功能脂肪酶突变体， 其特征在于： 其氨基酸序列与SEQ NO.1所示亲代氨基酸序列相比， 氨基酸取代形式为： 突变体1： P298T； 突变体2： P298T/H317P； 突变体3： P298T/H317P/V326S； 突变体4： P298T/T218S/S234F； 突变体5： P298T/H317P/P168L/A129S； 突变体6： P298T/S234F/K161R/V326S。 2.权利要求1所述脂肪酶突变体， 优选突变体4： P298T/。

6、T218S/S234F。 3.权利要求1所述脂肪酶突变体， 优选突变体5： P298T/H317P/P168L/A129S。 4.含有编码权利要求1或2所述脂肪酶突变体的基因的基因工程菌。 5.含有编码权利要求1或2所述脂肪酶突变体的基因的表达载体或克隆载体。 6.根据权利要求4所述的基因工程菌， 其特征在于所述基因工程菌为重组毕赤酵母 GS115， KM71或SMD1168。 7.根据权利要求4所述的基因工程菌， 其特征在于所述基因工程菌为重组毕赤酵母 GS115。 8.权利要求7所述基因工程菌的构建方法， 其特征在于， 选取重组毕赤酵母表达载体 pPIC9， pPIC3K， pPIC9K，。

7、 pAO815或pPICZ ， 以毕赤酵母GS115为宿主进行表达。 9.权利要求1所述脂肪酶突变体在面制品加工中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于所述面制品为面包、 馒头或面条。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105264070 B 2 一种双功能脂肪酶突变体及其在面制品加工中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种双功能脂肪酶突变体及其在面制品加工中的应用， 具体地说涉及 利用分子生物学技术获得性质提高的脂肪酶突变体， 该突变体适用于面制品加工领域， 属 于酶的基因工程技术领域。 背景技术 0002 酶制剂作为一种蛋白质产品， 基于其独特的生物学特性， 使得其在烘。

8、焙和面粉品 质改良方面具有其他化学成分无法替代的作用。 目前， 在面制品加工中使用酶制剂已经成 为一种主流的趋势。 0003 在面包烘焙过程中使用的面粉含有甘油磷脂和甘油三脂， 若将甘油磷脂部分水解 生成溶血甘油磷脂， 甘油三脂部分水解为甘油单酯或者甘油二酯， 溶血甘油磷脂、 甘油单酯 和甘油二酯作为表面活性剂能够起到乳化作用， 对面团有强筋作用， 能够提高面包的入炉 急胀， 增大面包体积， 使其组织细腻均匀， 包心柔软， 口感更好。 因此在面包烘焙加工中在面 粉中加入具有卵磷脂和甘油三脂分解活性的酶就能够起到上述的作用。 另外在馒头等面制 品加工过程中， 由于面粉中含有叶黄素和叶红素等色素，。

9、 影响了面制品白度， 因此如果在在 面粉中加入能够分解甘油三脂的酶来分解面粉中的脂肪， 使得原本溶于脂肪中的色素被释 放出来， 更加易于被氧化褪色， 从而对面制品起到增白的作用。 0004 在前期研究中， 发明人成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶 的华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021菌株， 并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶 基因序列， 并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表达(Yu Xiao-Wei et al.J Mol Catal B:Enzym,2009,57:304-311)； 以华根霉脂肪。

10、酶基因为模板， 利用定向进化技术获得了一系列热稳定性提高的突变体(授权专利CN 101974499B； Yu Xiao-Wei et al.Microbial Cell Factories,2012,11:102-112)。 在此基础上， 本研究利 用分子生物学的手段对华根霉脂肪酶进行基因突变， 获得具有甘油三酯与卵磷脂水解活性 的耐热脂肪酶突变体， 该突变体在面制品加工中具有很好的应用效果， 在馒头等面制品加 工中起到显著增白、 在面包烘焙加工中起到显著增大比容的效果。 授权专利CN 102160562B 中已经公开利用本研究亲本脂肪酶作为面包添加剂提高面包的烘焙特性， 本项目提供了一 种性。

11、质更加优良的脂肪酶突变体， 用于面包、 馒头等面制品的加工工艺中。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种脂肪酶突变体， 其氨基酸序列如下： 0006 1)所具有的氨基酸序列与SEQ NO.1所示亲代氨基酸序列相比， 存在下列氨基酸取 代形式： 突变体1： P298T； 突变体2： P298T/H317P； 突变体3： P298T/H317P/V326S； 突变体4： P298T/T218S/S234F； 突变体5： P298T/H317P/P168L/A129S； 突变体6： P298T/S234F/K161R/ V326S； 0007 2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基。

12、的缺失、 取代、 插入或突变， 同源性达到 说明书 1/5 页 3 CN 105264070 B 3 80以上的核苷酸序列； 具有甘油三酯与卵磷脂水解活性， 且热稳定性好。 0008 所述突变体的热稳定性比亲代在40下半衰期比亲本脂肪酶高了1438倍。 0009 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种含有上述脂肪酶突变体的基因工程 菌及其构建方法。 含编码所述脂肪酶突变体的DNA序列、 及其基因工程菌或转基因细胞系亦 是本发明要求保护的范围。 0010 所述基因工程菌为重组毕赤酵母GS115， KM71或SMD1168， 其中优选GS115。 0011 本发明解决的另一个技术问题为提供一种构建。

13、上述基因工程菌的方法， 通过选取 重组毕赤酵母表达载体pPIC9， pPIC3K， pPIC9K， pAO815或pPICZ ， 更优选pPIC9构建重组表 达载体， 以毕赤酵母GS115为宿主进行表达。 0012 上述脂肪酶突变体在面制品加工中的应用也属于本发明要求保护的范围， 所述面 制品为面包、 馒头、 面条。 0013 脂肪酶突变体的标识 0014 采用 “原始氨基酸位置替换的氨基酸” 来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。 如 S234F， 表示位置234的氨基酸由亲本脂肪酶的Ser替换成Phe， 位置的编号对应于附件序列 表1中亲本华根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列编号。 0015 如L1。

14、80H/T128S， 表示位置180和位置218的氨基酸都发生了突变。 0016 本发明提供的脂肪酶突变体具有有甘油三酯与卵磷脂水解活性， 且耐热性强， 在 面制品加工中具有很好的应用效果， 在馒头等面制品加工中起到显著增白、 在面包烘焙加 工中起到显著增大比容的效果。 具体实施方式 0017 实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下： 0018 LB液体培养基： 蛋白胨1， 酵母提取物0.5， NaCl 1， pH7.0。 0019 MD(Minimal Dextrose Medium):YNB 1.34,Biotin 410-5,Dextrose 2, Agar 2。 0020 BMGY(Bu。

15、ffered Glycerol-complex Medium):Yeast Extract 1,Trypton 2, YNB 1.34,Biotin 410-5,Glycerol 1,磷酸钾溶液pH 6.0、 100mmol/L。 0021 BMMY(Buffered Methanol-complex Medium):Yeast Extract 1,Trypton 2, YNB1.34,Biotin 410-5,Methanol 0.5,磷酸钾溶液100mmol/L。 0022 培养基中的单位为(W/V)。 0023 实施例1.定点突变构建脂肪酶突变体表达质粒 0024 以前期构建质粒pPIC。

16、9K-proRCL王乐乐， 喻晓蔚， 徐岩， 华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达， 高技术通讯， (2009)， 19(10):105为模板， 该质粒含有亲本华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021 脂肪酶基因(proRCL)。 利用定点突变试剂盒(QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit,Agilent)以含有亲本脂肪酶基因的质粒为模板， 分别突变获得含有以下 突变氨基酸位点的5个突变质粒： 突变体1： P298T； 突变体2： P2。

17、98T/H317P； 突变体3： P298T/ H317P/V326S； 突变体4： P298T/T218S/S234F； 突变体5： P298T/H317P/P168L/A129S； 突变体 6： P298T/S234F/K161R/V326S。 说明书 2/5 页 4 CN 105264070 B 4 0025 实施例2.表达脂肪酶突变体基因的基因工程菌的构建 0026 将突变质粒热激法转化大肠感受态细胞， 氨苄抗性LB平板上挑选阳性菌株， 提取 质粒， 测序验证正确突变质粒。 0027 提取验证正确的突变质粒， 用限制性内切酶Sal 酶切， 回收后浓缩。 将线性化质粒 与80 L的毕赤酵。

18、母GS115感受态混匀， 转至0.2cm电击杯中； 电压1500V， 电容25 F， 电阻200 ， 进行电击； 电击完毕后， 立即加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液， 混匀； 30静置1h； 然后涂布于MD平板上筛选目标基因整合到受体菌染色体上的转化子。 提取酵母基因组， 以 5 AOX和3 AOX为引物进行PCR鉴定， 以空载体转化菌作对照， 进一步验证目的基因已经整合 进酵母基因组。 0028 实施例3.脂肪酶突变体的分泌表达与分离纯化 0029 脂肪酶发酵方法： 重组毕赤酵母在25-50mL BMGY培养基(250mL三角瓶)中培养至 OD为2.06.0， 离心收集菌体， 加入。

19、25-50mL BMMY培养基后于20-30， 100-250rpm/min条 件下继续培养， 每24h补加占培养液体积0.1-2.0的甲醇， 发酵72144h。 0030 脂肪酶分离纯化方法： 0031 (1)10KD超滤膜浓缩 0032 分别将100mL发酵液44000r/min离心20min后弃掉沉淀， 上清液用0.22 m微孔滤 膜过滤， 微滤后的溶液用10KD超滤膜浓缩至10mL左右。 浓缩酶液用0.02mol/L HAc-NaAc缓 冲液(pH 5.0)4透析过夜。 0033 (2)SP-Sepharose FF强阳离子交换柱层析 0034 将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡的SP。

20、-Sepharose FF强阳离子交换柱层析 (1.6cm20cm)， 用相同缓冲洗脱未吸附蛋白。 后用NaCl浓度梯度为00.5mol/L的 0.02mol/L pH5.0的HAc-NaAc缓冲液阶段洗脱吸附蛋白， 流速为1mL/min， 每管收集4mL， 分 步收集， 将脂肪酶活性组分集中， 用含1.6mol/L硫酸铵的0.05mol/L pH7.5的磷酸钾缓冲液 4透析备用。 0035 (3)Phenyl-Sepharose 6FF疏水色谱柱层析 0036 将透析后的酶液继续用Phenyl-Sepharose 6FF疏水柱层析(1.6cm20cm)， 平 衡缓冲液为含1.6mol/L硫酸。

21、铵的0.05mol/L pH7.5的磷酸钾缓冲， 用相同缓冲液洗脱除去 未吸附蛋白。 然后用硫酸铵浓度梯度差为0.4mol/L的0.05mol/L pH7.5的磷酸钾缓冲液阶 段洗脱吸附蛋白， 最后用H2O洗脱， 洗脱速率为0.8mL/min， 每管收集4mL， 分部收集， 集中脂 肪酶活性组分， 透析除盐， 冷冻干燥备用。 0037 实施例4.脂肪酶突变体的热稳定性、 甘油三脂与卵磷脂水解活性 0038 甘油三酯水解活力的测定方法： 将10ml水加到200mg橄榄油和100mg阿拉伯胶中， 用搅拌机以10000rpm的条件乳化5min， 将200 l乳化后的溶液、 100 l 200mM M。

22、OPS缓冲液 (pH6)和20 l 100mM氯化钙溶液的混合液在40保温5min， 然后向溶液中添加40 l酶液， 混 匀后40保温10min。 加入40 l 1N盐酸终止酶反应。 向该混合液中加入400 l 4Triton X-100， 释放游离脂肪酸。 游离脂肪酸的定量如下:取上述反应混合液30 l， 加入3ml游离脂 肪酸定量试剂NEFA(上海阳光试剂有限公司)， 混匀后40保温10min。 0039 卵磷脂水解活力测定方法： 以卵磷脂为底物。 将10ml水加到200mg卵磷脂和400 lTriton X-100中， 用搅拌机以10000rpm的条件乳化5min， 将500 l乳化后的。

23、溶液、 250 l 说明书 3/5 页 5 CN 105264070 B 5 200mM MOPS缓冲液(pH6)和20 l 100mM氯化钙溶液的混合液在40保温5min， 然后向溶液 中添加40 l酶液， 混匀后40保温10min。 加入100 l 1N盐酸终止酶反应。 向该混合液中加 入400 l 4Triton X-100， 释放游离脂肪酸。 游离脂肪酸的定量如下:取上述反应混合液 30 l， 加入3ml游离脂肪酸定量试剂NEFA(上海阳光试剂有限公司)， 混匀后40保温10min。 0040 酶活的定义为pH6.0， 40下反应每分钟产生1 mol脂肪酸的酶量为一个脂肪酶酶 活单位。。

24、 0041 酶在40下半衰期的测定方法： 在40下处理酶液， 在不同处理时间取样， 测定脂 肪酶残余的甘油三酯水解活力百分比()。 以残余酶活百分比的log值对时间T(min)作图， 直线的斜率为失活常数kinact。 由t50ln2/kinact得到脂肪酶在该温度下的t50。 0042 研究结果如表1所示， 纯化的脂肪酶突变体的甘油三酯水解活力与卵磷脂水解活 力比例由初始的4.9降低到1.5至3.2之间， 表明脂肪酶突变体的卵磷脂水解活力相对脂肪 酶活力有所提高。 酶的热稳定性测定结果表明脂肪酶突变体在40下半衰期比亲本脂肪酶 高了1438倍。 0043 表1 脂肪酶的酶学特性 0044 0。

25、045 实施例5.脂肪酶突变体在面包烘焙中的应用 0046 在面包烘焙实验中主要考察脂肪酶制剂对面包比容的影响， 并对亲本脂肪酶与突 变酶的应用效果进行比较。 0047 面包制备方法： 参照AACC法10-10B， 并做了一定修改。 面粉100， 食盐1， 白砂糖 4， 黄油4， 酵母1.5， 水62.5(以小麦粉质量计)， 脂肪酶的添加量为500U/kg， 空白对 照中不添加脂肪酶。 将上述原料于搅拌机中搅拌10min后， 静置10min， 分割成100g/个， 搓 圆， 静置10min， 成型装盘， 于38、 相对湿度85的条件下醒发90min， 烘焙25min(上火170 、 下火210。

26、)， 冷却后备用。 0048 面包比容测定： 采用菜籽排除法测定。 面包在室温冷却1h后， 分别测量面包的体积 和质量。 0049 比容(mL/g)体积(mL)/质量(g)。 0050 比容增加值()(样品比容-空白对照比容)/空白对照比容*100 0051 研究结果表明(表2)， 添加了突变脂肪酶的比容最大增加了28， 而亲本脂肪酶比 容增加值为21。 显然本发明所述的脂肪酶突变体能够显著增加面包的比容， 在面包烘焙 说明书 4/5 页 6 CN 105264070 B 6 中具有很好的应用价值。 0052 表2 脂肪酶在面制品中的应用效果 0053 0054 实施例6.脂肪酶突变体在馒头等。

27、面制品加工中的应用 0055 在馒头等面制品加工中的应用实验中主要考察脂肪酶制剂对面制品白度的影响， 并对亲本脂肪酶与突变酶的应用效果进行比较。 0056 馒头制备方法： 配方为未添加任何改良剂的馒头原粉， 0.8酵母(安琪酵母股份 有限公司)， 脂肪酶的添加量为500U/kg， 空白对照中不添加脂肪酶， 加水40充分混合。 将 上述原料经过压面(面片折叠， 压制6次)、 手工成型、 醒发(将成型的面团放入醒发箱， 醒发 35min、 37.5、 湿度80)工序后， 蒸制20min， 冷却放置待测。 0057 白度测定方法： 用色差仪在馒头上任意的取8个待测定进行测定， 取平均值。 0058 。

28、研究结果表明(表2)， 以空白对照白度提升单位记为0， 添加了突变脂肪酶的白度 单位最大增加了2.3， 而亲本脂肪酶白度单位增加了1.3。 显然本发明所述的脂肪酶突变体 能够显著增加馒头面制品的白度， 在馒头等面制品加工中具有很好的应用价值。 0059 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 5/5 页 7 CN 105264070 B 7 0001 序列表 1/3 页 8 CN 105264070 B 8 0002 序列表 2/3 页 9 CN 105264070 B 9 0003 序列表 3/3 页 10 CN 105264070 B 10 。