具有镇痛作用的多肽及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710191004.6 (22)申请日 2017.03.28 (71)申请人 上海新生源医药集团有限公司 地址 201203 上海市浦东新区自由贸易试 验区蔡伦路780号208室 (72)发明人 游磊祁园鑫唐泽紫袁胜峰 曲站红吴海玲 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 戴广志 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01) A61K 38/08(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (54)发明名称 具。

2、有镇痛作用的多肽及其应用 (57)摘要 本发明公开一种具有镇痛作用的多肽， 其氨 基酸序列为Phe-Cys-Ser-Trp-Lys-Cys-Thr， 且2 个Cys之间由二硫键连接。 本发明的多肽可以用 于制备预防和/或治疗疼痛的产品。 本发明的多 肽具有强效的镇痛作用； 能够抑制神经性炎症及 阻断神经痛； 具有很高的安全性， 具有广阔的发 展前景。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 108659100 A 2018.10.16 CN 108659100 A 1.一种具有镇痛作用的多肽， 其特征在于， 所述多肽的氨基酸序列为Phe-Cys-Ser- Trp-Lys-Cys-Thr， 。

3、且2个Cys之间由二硫键连接。 2.权利要求1所述的多肽在制备预防和/或治疗疼痛的产品中的应用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述应用包括用于预防和/或治疗烧烫伤、 外 力损伤、 冻伤、 炎症性疼痛、 神经病理性损伤所导致的疼痛。 4.一种预防和/或治疗疼痛的产品， 其活性成分包括权利要求1所述的多肽。 5.如权利要求4所述的产品， 其特征在于， 所述产品为含有所述多肽的药物。 6.如权利要求4所述的产品， 其特征在于， 所述药物中还可以加入一种或多种药学上可 接受的辅料， 所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、 稳定剂、 填充剂、 赋形剂、 粘合剂、 湿润 剂、 吸收促进剂、 表。

4、面活性剂和润滑剂。 7.如权利要求4所述的产品， 其特征在于， 所述药物制备成药学上可接受的剂型， 所述 剂型包括注射剂、 冻干制剂、 埋植剂、 片剂或粒剂。 8.如权利要求7所述的产品， 其特征在于， 所述注射剂是使用注射用水、 生理盐水、 枸椽 酸溶液、 醋酸溶液或磷酸盐缓冲液溶解所述多肽得到的多肽溶液。 9.如权利要求7所述的产品， 其特征在于， 所述冻干制剂是将所述多肽用溶剂溶解并加 入稳定剂后冻干所得到的冻干粉针剂。 10.如权利要求9所述的产品， 其特征在于， 所述稳定剂选用EDTA、 蔗糖和甘露醇中的至 少一种。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108659100 A 2 具有。

5、镇痛作用的多肽及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种多肽， 具体涉及一种具有镇痛作用的多肽及其应用。 背景技术 0002 疼痛是一种由组织损伤或疾病引起的不愉快的感觉及情感体验。 据统计， 大约 30的成年人患有疼痛， 每3个门诊病人中就有2个是伴有各种疼痛病症或症状的病人， 我 国至少有1亿以上疼痛患者。 疼痛不仅给患者带来痛苦， 还给其带来严重的心理及生理损 伤， 增加并发症的发生率， 延长恢复时间， 增加医疗费用。 基于不同的发病机理， 疼痛在各种 疾病中有迥异的表现， 给临床的疼痛治疗带来一定难度。 0003 镇痛药主要是作用于中枢或外周神经系统， 选择性抑制和缓解各种疼痛， 减。

6、轻疼 痛而致恐惧紧张和不安情绪疼痛的药物， 包括以吗啡、 哌替啶等为代表的麻醉性镇痛药和 以阿司匹林、 双氯芬酸钠等为代表的解热镇痛抗炎药。 麻醉性镇痛药作用部位在丘脑和大 脑皮层， 可以缓解锐痛、 钝痛和内脏绞痛， 但对神经性疼痛无疗效， 且反复使用时易产生成 瘾性， 戒断针状严重， 病人必须不断增加剂量才能位置镇痛效果； 而且麻醉性镇痛药均被列 入管制药物， 在药政管理上列为 “麻醉药品” ， 国家颁布 麻醉药品管理条例 ， 对生产供应和 使用都严格加以管理和限制。 解热镇痛药是一类具有解热、 镇痛作用的药物， 通过抑制内环 氧化酶， 使前列腺素生成减少， 减少神经末梢对致痛物质的敏感性，。

7、 达到抗炎镇痛， 但其作 用部位主要在外周， 主要用于接触炎症性疼痛或其他钝痛， 对治疗神经性炎症及神经痛是 无效的。 0004 因此， 研究一种能够克服上述缺陷的新的镇痛药物是本领域研究的热点和趋势。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于， 提供一种多肽， 其具有强效的镇痛作用， 能够抑 制神经性炎症及阻断神经痛， 且不具有麻醉性镇痛药的成瘾性。 0006 为解决上述技术问题， 本发明所提供的具有镇痛作用的多肽(简称TLN-7)， 其氨基 酸序列为Phe-Cys-Ser-Trp-Lys-Cys-Thr， 且2个Cys之间由二硫键连接。 0007 本发明开发的多肽TLN-7的2个C。

8、ys之间由二硫键连接呈环状， 它是生长抑制素的 类似物。 生长抑制素是一种影响细胞代谢的人体内源性激素， 它没有抑制胰岛素分泌(导致 糖尿病)等广泛的内分泌副作用。 本发明的多肽TLN-7是首个以SST4受体为靶点治疗疼痛的 药物。 0008 研究表明， 生长抑素在神经系统及外周组织均有着广泛的作用， 作为神经调质， 它 参与对于神经内分泌、 运动以及认知功能的调控。 通过细胞表面的G蛋白偶联受体直接发挥 其生理功能。 本发明的多肽TLN-7能够高亲和力地与SSTR-1和SSTR-4结合， 从而其介导抗炎 和镇痛效果。 在动物模型中， TLN-7能够抑制神经性炎症及阻断神经痛， 而传统解热镇痛。

9、药 如双氯芬酸或美洛昔康等对治疗神经性炎症及神经痛是无效的。 0009 经研究， 本发明的多肽TLN-7发挥镇痛效果的机制可能包括以下几个途径： 1.通过 说明书 1/6 页 3 CN 108659100 A 3 与G1或者G0偶联抑制AC或PLC活性， 抑制Ca2+通道和络氨酸磷酸酶等对神经元活动产生抑制 性影响； 2.通过抑制辣椒素敏感型神经末端释放诸如P物质、 降钙素相关基因肽等感觉神经 肽， 进而抑制前列腺素的释放； 3.通过激动5-HT下行抑制系统， 使释放到脊髓背侧角的5-HT 会与初级传入神经的终末及背角神经元的5-HT受体结合， 通过突触前或突触后抑制， 调节 疼痛信息的传递；。

10、 4.通过抑制谷氨酸水平， 减少对神经元的兴奋从而达到镇痛作用； 5.选择 性抑制脊髓I、 II、 V层中受痛觉刺激而兴奋的背角神经元放电， 阻断疼痛信号向高级中枢的 传递。 0010 本发明的多肽TLN-7用于作用于外周感觉神经元能发挥强烈的镇痛效果， 在动物 试验中， 低剂量的TLN-7表现出的镇痛效果要明显强于经典的解热镇痛药(如双氯芬酸钠)。 0011 本发明的多肽TLN-7在制备预防和/或治疗疼痛的产品中的应用。 所述应用包括预 防和/或治疗烧烫伤、 外力损伤、 冻伤、 炎症性疼痛、 神经病理性损伤以及其他原因导致的疼 痛。 0012 以本发明的多肽TLN-7为主要活性成分的预防和/。

11、或治疗疼痛的产品。 所述产品可 以是含有多肽TLN-7的药物， 或者是含有多肽TLN-7的具有预防和/或治疗疼痛功效的医疗 辅助产品。 0013 当产品为药物时， 在需要的时候， 上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接 受的辅料， 所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、 稳定剂、 填充剂、 赋形剂、 粘合剂、 湿润剂、 吸收促进剂、 表面活性剂和润滑剂等。 0014 本发明所述的药物， 可以制成注射剂、 冻干制剂、 埋植剂、 片剂或粒剂等多种形式。 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 0015 所述的注射剂可以是使用注射用水、 生理盐水、 枸椽酸溶液、 醋酸溶液或磷酸盐缓 冲液。

12、溶解本发明的多肽TLN-7或还加入稳定剂所得到的多肽溶液。 所述冻干制剂可以是将 本发明的多肽TLN-7经溶解后冻干或溶解并加入稳定剂后冻干所得到的冻干粉针剂。 所述 的稳定剂可以是本领域常用的稳定剂， 具体可以选用EDTA、 蔗糖和甘露醇中的至少一种。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果在于： 0017 1.本发明的多肽TLN-7具有强效的镇痛作用， 给药剂量仅为双氯芬酸钠给药剂量 的1时即可发挥出与双氯芬酸钠相当或更强的镇痛效果。 0018 2.本发明的多肽TLN-7能够抑制神经性炎症及阻断神经痛， 而传统的麻醉性镇痛 药和解热镇痛抗炎药对治疗神经性炎症及神经痛是无效的。 001。

13、9 3.本发明的多肽TLN-7在发挥镇痛作用时能够避免非甾体类抗炎镇痛药的的胃肠 道毒性、 特异性COX-2抑制剂的心血管毒性、 阿片类药物的成瘾性等。 0020 4.本发明的多肽TLN-7是生长抑制素的的类似物， 生长抑素及其类似物在临床使 用中尚未发现严重的副作用， 具有很高的安全性， 具有广阔的发展前景。 附图说明 0021 图1为实施例一制得多肽TLN-7的质谱图。 0022 图2为实施例一制得多肽TLN-7的氨基酸比值图谱。 具体实施方式 说明书 2/6 页 4 CN 108659100 A 4 0023 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、 完整的描述， 显然， 所描述的实施。

14、 例是本发明的一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技 术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范 围。 0024 实施例1 0025 通过化学固相合成的方法合成本发明的环状多肽TLN-7。 按以下步骤进行： 0026 1、 树脂溶胀： 将Rink Amide AM Resin树脂用二氯甲烷浸泡， 待树脂膨胀后抽去二 氯甲烷。 0027 2、 去除氨基保护： 加入六氢吡啶/DMF溶液， 使用氮气鼓动反应， 待反应结束后用 DMF洗涤树脂。 取少量树脂加入验色剂A、 B、 C各2-3滴(A： 茚三酮/无水乙醇溶液； B： 吡。

15、啶； C： 苯酚/无水乙醇溶液)， 然后在100下共热3分钟， 溶液及树脂颜色应为蓝色， 即可认定反应 完成。 0028 3、 缩合反应： 加入Fmoc-Thr(tBu)-OH和HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸 酯)， 用适量DMF溶解， 加入DIEA， 氮气鼓动， 反应结束后用DMF洗涤树脂。 取少量树脂加入验 色剂A、 B、 C各2-3滴(A： 茚三酮/无水乙醇溶液； B： 吡啶； C： 苯酚/无水乙醇溶液)， 在100下 共热3分钟， 溶液及树脂颜色应为无色， 即可认定反应完成。 0029 4、 重复步骤： 依次加入各氨基酸原料， 重复步骤2-3， 完成序列中的合成后， 将树脂。

16、 用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。 0030 5、 将多肽从树脂上分离： 加入TFA裂解液， 在恒温摇床中反应。 0031 6、 析出粗品： 滤去树脂， 向滤液中加入无水乙醚， 用离心机离心后获得固体， 加入 无水乙醚洗涤， 再离心， 重复数次后烘干即可获得线性粗品多肽。 0032 7、 形成二硫键： 将线性多肽粗品用纯水溶解， 用稀氨水调节PH值， 搅拌反应24小 时， 用MS和HPLC检测反应终点。 0033 8、 纯化冻干： 采用反相高效液相色谱法分离， 在纯化过程中需要用到的液相有： 水、 乙腈、 乙酸。 0034 质谱检测结果如图1所示， 其中， M+H+947.70， M+Na+947。

17、.70， M+K+ 947.70。 氨基酸比值图谱如图2所示。 0035 实施例2热板法镇痛试验 0036 将小鼠置于550.5的热板上， 热刺激小鼠足部产生痛反应， 即舔足反应。 以小 鼠出现舔足的时间作用为痛反应指标， 判断药物是否具有镇痛作用。 0037 在热板法镇痛试验中， 雌性KM小鼠在给予TLN-7(给药剂量分别为0.04mg/kg、 0.08mg/kg、 0.16mg/kg)和双氯芬酸钠(给药剂量为15mg/kg)之后， 对比于尾静脉注射生理 盐水的雌性KM小鼠， 小鼠对受到热板热刺激导致疼痛感觉的潜伏期受到不同程度的影响。 全部雌性KM小鼠先各测正常痛阈值一次， 然后分别在注射。

18、给药后30min、 60min、 90min各测 痛阈值一次， 并记录痛阈值， 计算痛阈提高率。 试验结果如表1所示。 0038 表1 说明书 3/6 页 5 CN 108659100 A 5 0039 0040 表1中痛阈提高率以MeanSD格式记录。 统计学分析采用独立样本t检验对各给药 处理组与空白对照组进行比较， 显著水平 0.05， *p0.05。 0041 上述试验结果说明， 多肽TLN-7能显著提高热板测试中小鼠的热痛阈， 且呈剂量依 赖关系。 多肽TLN-7在0.04mg/kg、 0.08mg/kg及0.16mg/kg的剂量下， 均能显著提高KM小鼠的 热痛阈(p0.05)。 。

19、尤其是， TLN-7在0.16mg/kg的剂量下， 热痛阈提高率明显高于阳性对照药 双氯芬酸钠(15mg/kg)， 但TLN-7给药剂量仅为双氯芬酸钠给药剂量的1， 说明TLN-7的镇 痛作用更强。 0042 实施例3扭体试验 0043 应用化学刺激物注入小鼠腹腔内， 引起深部的大面积而较久的疼痛刺激， 致使小 鼠产生扭体反应(腹部内凹、 伸展后肢、 臀部抬高等)。 以小鼠出现扭体的次数为痛反应指 标， 判断药物是否具有镇痛作用。 0044 在扭体试验中， KM小鼠在给予TLN-7(给药剂量分别为0.04mg/kg、 0.08mg/kg、 0.16mg/kg)和双氯芬酸钠(给药剂量为15mg/。

20、kg)之后， 对比于尾静脉注射生理盐水的雌性 KM小鼠， 小鼠扭体次数受到不同程度的影响。 给药后30min， 全部小鼠分别腹腔注射1冰醋 酸0.3ml/只， 然后观察15min内小鼠出现的扭体反应并记录扭体次数， 并计算镇痛率。 试验 结果如表2所示。 0045 表2 0046 0047 表2中扭体次数以MeanSEM格式记录。 统计学分析采用独立样本t检验对各给药 处理组与生理盐水组进行比较， 显著水平 0.05， *表示p0.05。 0048 上述试验结果说明， 多肽TLN-7能显著抑制醋酸诱导的小鼠扭体次数， 呈剂量依赖 关系。 阳性对照药双氯芬酸钠在15mg/kg的剂量下， 显著地抑。

21、制了小鼠的扭体次数(p 0.05)， 镇痛率达49.40。 多肽TLN-7在0.16mg/kg及0.08mg/kg的剂量下， 小鼠的扭体次数 皆得到了显著性的抑制(p0.05)， 镇痛率分别为46.39及37.95。 多肽TLN-7在0.16mg/ kg剂量下的镇痛效果与阳性对照药双氯芬酸钠(15mg/kg)的镇痛效果相当。 0049 实施例4足跖切口疼痛模型试验 0050 在无菌环境下， 在3戊巴比妥钠麻醉下将大鼠左爪进行消毒后， 从足底近端 0.5cm处向趾部做一长约1cm的切口， 切开皮肤后， 用眼科镊挑起足部肌肉并纵向切割， 但保 存肌肉肌腱及附着完整。 按压止血后， 用细线缝合皮肤共。

22、两针即成切口疼痛模型。 通过观察 大鼠的行为进行疼痛行为学评分， 根据评分的变化判断药物是否具有镇痛作用。 说明书 4/6 页 6 CN 108659100 A 6 0051 造模后， SD大鼠分别给药TLN-7(给药剂量分别为0.04mg/kg、 0.08mg/kg、 0.16mg/ kg)、 双氯芬酸钠(给药剂量为15mg/kg)以及生理盐水， 在给药后60分钟内， 每隔5分钟进行 一次疼痛行为学评分， 后爪完全着地负重记0分， 后爪着地但部分负重记1分， 后爪不着地记 2分， 按15分钟为时间段依次累计评分。 试验结果如表3所示。 0052 表3 0053 0054 表3中疼痛行为学评分。

23、数据以MeanSEM格式记录。 统计学分析采用Mann-Whitney U检验对各给药处理组与生理盐水组进行比较， 显著水平 0.05， *表示p0.05。 0055 上述实验结果说明， 尾静脉注射生理盐水的大鼠的疼痛行为学评分在60分钟内从 5.00.21降至3.00.15； 给予阳性药双氯芬酸钠的大鼠在第30分钟的评分从5.30.15 降至2.80.25， 在后续的第45分钟和第60分钟， 评分分别降至0.70.21和0.30.15， 表 现出显著的镇痛作用(p0.05)。 多肽TLN-7在0.04mg/kg、 0.08mg/kg及0.16mg/kg的剂量下， 表现出显著的镇痛效果， 而在。

24、0.16mg/kg的剂量下， 表现出与双氯芬酸钠相当， 甚至更强的 镇痛效果。 0056 实施例5糖尿病诱导的神经病理性疼痛模型试验 0057 糖尿病性神经病变是糖尿病的常见并发症， 疼痛、 瘙痒、 感觉过敏是其常见的临床 表现。 本实施例通过链脲霉素诱导大鼠形成糖尿病， 并引发大鼠外周神经病变造成痛敏， 以 电子触觉测量仪测定的压力值为机械伤害性痛阈指标， 计算其变化率用来判断药物是否具 有镇痛作用。 0058 雄性Wistar大鼠单次静脉注射链脲霉素50mg/kg诱导成实验性糖尿病模型。 两周 后大鼠尾静脉取得血样， 测量大鼠血浆的葡萄糖水平及胰岛素的浓度， 以确定糖尿病的进 展。 大鼠血。

25、浆葡萄糖浓度超过15mmol/L被认为糖尿病模型造模成功。 0059 造模成功后大鼠给予TLN-7(给药剂量分别为0.04mg/kg、 0.08mg/kg、 0.16mg/kg) 和双氯芬酸钠(给药剂量为15mg/kg)以及生理盐水， 后足的机械伤害性痛阈使用电子触觉 测量仪测定， 痛阈值与初始测量的值对比， 其变化程度用百分比表示。 试验结果如表4所示。 0060 表4 0061 0062 表4中扭体次数以MeanSD格式记录。 统计学分析采用独立样本t检验对各给药处 理组与生理盐水组进行比较， 显著水平 0.01， *表示p0.01。 0063 上述实验结果说明， 造模成功3周后糖尿病诱导。

26、的痛阈下降了29.673.08。 注 射多肽TLN-7在0.16mg/kg及0.08mg/kg的剂量下， 痛阈下降明显减弱， 表现出显著的镇痛效 说明书 5/6 页 7 CN 108659100 A 7 果(p0.01)， 而双氯芬酸钠的镇痛效果不明显。 多肽TLN-7在糖尿病诱导的神经病理性疼痛 模型上， 较非甾体类镇痛药双氯芬酸钠， 表现出非常明显的优势。 0064 综上所述， 上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限定本 发明的保护范围， 凡在本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 皆应 包含在本发明的保护范围内。 说明书 6/6 页 8 CN 108659100 A 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 108659100 A 9 。