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1、(10)授权公告号 CN 102876766 B (45)授权公告日 2014.10.15 CN 102876766 B (21)申请号 201210429362.3 (22)申请日 2012.10.31 C12P 35/06(2006.01) C12R 1/75(2006.01) (73)专利权人 国药集团威奇达药业有限公司 地址 037008 山西省大同市经济技术开发区 专利权人 华东理工大学 (72)发明人 黎亮 张俊波 储炬 李树友 庄英萍 苗瑞春 张嗣良 陆俊 (74)专利代理机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 代理人 陈静 CN 102408462 A,2012.04.。
2、11, 说明书第 28-29 段 . EP 0137365 A2,1985.04.17,第8页第3段. 孙建宏 . 头孢菌素 C 菌种改良和发酵工艺研 究 .中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科 技辑 .2006, 第 2006 年卷 ( 第 12 期 ),5.1.1 节， 5.1.9 节 . P. Hilgendorf et al.Constant dissolved oxygen concentrations in cephalosporin C fermentation: Applicability of different controllers and effect on ferme。
3、ntation parameters.Appl Microbiol Biotechnol .1987, 第 27 卷全文 . 桑美纳 . 不同补料控制方式下发酵生产头孢 菌素 C 的性能比较研究 .中国优秀硕士学位论 文全文数据库工程科技辑 .2012, 第 2012 年卷 ( 第 7 期 ),2.3 节， 3.1 节 . (54) 发明名称 一种头孢菌素 C 的发酵方法 (57) 摘要 本发明涉及一种头孢菌素 C 的发酵方法。通 过在头孢菌素 C 发酵后期通过补加消沫剂替代豆 油进行消沫， 在不影响效价增长和滤速的情况下， 原材料成本可以降低 15%。 (51)Int.Cl. (56)对比文。
4、件 审查员 刘春杰 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102876766 B CN 102876766 B 1/1 页 2 1. 一种头孢菌素 C 的发酵方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： 在头孢菌素 C 发酵过程 中， 发酵起始第 40-60 小时起， 以 20-40g/hr 的速度补加豆油， 至发酵起始第 90-110 小时停 止补加豆油 ； 在发酵起始 90-110 小时后以聚醚类消沫剂聚氧乙烯氧丙烯甘油或高碳醇类 消沫剂聚乙二醇进行消沫处理， 添加。
5、量为 0.02-0.08g/L 泡沫发酵液总量 ； 采用的发酵培养基为 ： 花生粉 ： 25g/L、 玉米粉 ： 17.5g/L、 谷朊粉 ： 30g/L、 金枪鱼膏 ： 20mL/L、 玉米浆 ： 40mL/L、 葡萄糖 ： 5g/L、 蔗糖 ： 10g/L、 蛋氨酸 ： 9g/L、 硫酸铵 ： 10g/L、 硫酸钙 ： 12g/L、 碳酸钙 ： 5g/L、 豆油 ： 70mL/L、 消沫剂 ： 1mL/L ； 发酵培养基中各成分的含量为 10。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 在发酵起始 100 小时后， 进行消沫处理。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 。
6、聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂的添加量 为 0.03-0.06g/L 泡沫发酵液总量。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 发酵培养基中， 所述成分在培养基中的含量 为 5。 5.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 发酵前期， 当铵离子浓度降低到1.5g/L以下 时开始补加硫酸铵溶液， 控制发酵液中的铵离子浓度在 1.2-1.5g/L ； 所述的发酵前期是发 酵的前 50 小时。 6. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 发酵起始第 35-45 小时之前， 培养温度控制 为 281， 之后控制为 251。 权 利 要 求 书 CN 102876766 B 2 1/6 页。
7、 3 一种头孢菌素 C 的发酵方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程和微生物学领域 ； 更具体地， 本发明涉及一种头孢菌素 C 的 发酵方法。 背景技术 0002 头孢菌素 C 由顶头孢霉 (Cephalosporium acremonuim) 产生， 是顶头孢霉菌的初 级代谢在特定条件下的继续与发展的产物， 是继青霉素之后又一重要的 - 内酰胺类抗生 素。 0003 目前在头孢菌素 C 工业发酵过程中使用豆油作为主要碳源， 同时也起到消沫的作 用。到发酵后期， 液面容易产生泡沫， 由于豆油消沫效果较差， 需要补加较多的豆油才能有 效的控制液面， 同时由于菌体开始衰老自溶， 对豆油的利用。
8、能力下降， 残留在发酵液中过多 的豆油会对头孢菌素 C 的提取造成影响。 0004 因此， 本领域需要研究改进的头孢菌素 C 发酵方法， 来克服上述技术问题。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种头孢菌素 C 的发酵方法。 0006 在本发明的第一方面， 提供一种头孢菌素 C 的发酵方法， 所述方法包括 ： 在头孢菌 素C发酵过程中， 在需要去除泡沫时(较佳地， 在产生使液面增高的泡沫时)， 以聚醚类消沫 剂或高碳醇类消沫剂进行消沫处理。 0007 在一个优选例中， 所述的聚醚类消沫剂是 ： 聚氧乙烯氧丙烯甘油。 0008 在另一优选例中， 所述的聚氧乙烯氧丙烯甘油H2C-O-(C3H。
9、6O)m-(C2H4O)n-H ； 分子量 8000-10000。 0009 在另一优选例中， 所述的高碳醇类消沫剂是 ： 聚乙二醇。 0010 在另一优选例中， 所述的聚乙二醇是聚合度 1000-4000 的聚乙二醇 ； 更佳地， 所述 的聚乙二醇是 PEG2000。 0011 在另一优选例中， 在发酵起始 70-120 小时后， 进行消沫处理 ； 更佳地， 在发酵起始 90-110 小时后， 进行消沫处理。 0012 在另一优选例中， 聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂的添加量为 ： 0.01-0.1g/L 泡 沫发酵液总量 ； 较佳地为 0.02-0.08g/L 泡沫发酵液总量 ； 更佳地为 。
10、0.03-0.06g/L 泡沫发 酵液总量。 0013 在另一优选例中， 采用的发酵培养基为 ： 0014 花生粉 ： 25g/L、 玉米粉 ： 17.5g/L、 谷朊粉 ： 30g/L、 金枪鱼膏 ： 20mL/L、 玉米浆 ： 40mL/L、 葡萄糖 ： 5g/L、 蔗糖 ： 10g/L、 蛋氨酸 ： 9g/L、 硫酸铵 ： 10g/L、 硫酸钙 ： 12g/L、 碳酸钙 ： 5g/L、 豆油 ： 70mL/L、 消沫剂 ： 1mL/L ； 0015 上述成分在培养基中的含量可 10%( 较佳地， 5%)。 0016 在另一优选例中， 发酵前期 ( 较佳地前 50 小时 ) 补加铵离子， 。
11、控制发酵液中的铵 说 明 书 CN 102876766 B 3 2/6 页 4 离子浓度在 1.2-1.5g/L。 0017 在另一优选例中， 发酵起始第 40-60 小时起， 以 20-40g/hr 的速度补加豆油， 至发 酵起始第 90-110 小时停止补加豆油。 0018 在另一优选例中， 发酵起始第 35-45 小时之前， 培养温度控制为 281， 发酵起 始第 35-45 小时后控制为 251。 0019 在本发明的另一方面， 提供聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂的用途， 用于发酵生 产头孢菌素 C。 0020 本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。。
12、 附图说明 0021 图 1、 不同种类消沫剂对头孢菌素 C 发酵的影响。 0022 图 2、 补加消沫剂对头孢菌素 C 生物合成的影响。 0023 图 3、 补加消沫剂对头孢菌素 C 发酵液滤速的影响。 具体实施方式 0024 为了解决现有技术的缺陷， 本发明人经过大量研究实验， 发现在头孢菌素 C 发酵 的后期， 用消沫剂替代一部分豆油， 将能够有效的控制液面的泡沫， 且对头孢菌素 C 的生物 合成和滤速没有影响。补加消沫剂后原材料成本比单单补加豆油降低约 15%。 0025 消沫剂通常也称为消泡剂， 现有技术中存在的消沫剂有较多的种类， 常用的消沫 剂有天然油脂 ( 如植物油脂、 动物油。
13、脂 ) 和一些化学合成的高分子化合物等。化学消沫剂 种类挺多， 主要为 ： 聚醚类消泡剂 ( 含 GP 型消泡剂、 GPE 型消泡剂、 GPES 型消泡剂等 )， 高 碳醇类消泡剂 ( 含磷酸三丁酯， C12 C22 的高碳醇等 )， 硅类消泡剂 ( 含聚二甲基硅氧烷 等 )， 聚醚改性硅， 自乳化消泡剂， 聚硅氧烷消泡剂等。 0026 目前工业发酵中常用的消沫手段包括机械消沫和化学消沫。 尽管目前工业发酵中 也会采用一些消沫剂来消除发酵过程中产生的泡沫， 但是应用何种消沫剂， 需要视生产的 菌种生理特性、 地域情况、 反应条件等因素而定。 0027 本发明涉及头孢菌素 C 的发酵， 在以往的。
14、发酵方法中， 通常以同时作为主要碳源 的豆油来兼作消沫剂， 因此一般不再添加化学添加剂。然而， 本发明人经过深入研究后发 现， 以聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂进行消沫处理。 其能够更好地控制发酵液面， 且能够 大大降低发酵成本。 0028 因此， 本发明提供了一种头孢菌素 C 的发酵方法， 所述方法包括 ： 在头孢菌素 C 发 酵过程中， 在需要去除泡沫时， 特别是在产生使液面增高的泡沫时， 以聚醚类消沫剂或高碳 醇类消沫剂进行消沫处理。 0029 作为本发明特别优选的方式， 所用的消沫剂是聚氧乙烯氧丙烯甘油或聚乙二醇。 作为本发明特别优选的方式， 所用的消沫剂是聚氧乙烯氧丙烯甘油， 该消沫剂。
15、对头孢菌素 C 发酵的影响较小， 甚至有增效作用。 0030 本发明人还优化了发酵过程， 包括消沫剂的添加时机。 较佳地， 在发酵起始70-120 小时后， 进行消沫处理 ； 更佳地， 在发酵起始 90-110 小时后， 进行消沫处理。消沫剂的添加 说 明 书 CN 102876766 B 4 3/6 页 5 量为 ： 0.01-0.1g/L 泡沫发酵液总量 ； 较佳地为 0.02-0.08g/L 泡沫发酵液总量 ； 更佳地为 0.03-0.06g/L 泡沫发酵液总量。在这一时机停止豆油的添加而改以消沫剂处理， 有利于有 效降低泡沫产生量， 以及有利于下游的头孢菌素 C 的分离提纯。 0031。
16、 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 J. 萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 科学出版社中所述的条件， 或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 0032 I. 材料与方法 0033 1、 菌种 0034 顶头孢霉 (Cephalosporium acremonium)CA01 由山西威奇达药业有限公司提供。 0035 2、 培养基 0036 斜面培养基 ( 重量体积比 ) ： 0037 麦芽汁 1.2， 蛋白胨 1.2， 。
17、琼脂 2.2 ； 将以上成分溶解在去离子水中， 定容到 100 毫 升 ； 消前 ( 即消毒之前 )pH 为 7.0。 0038 种子培养基 ： 0039 豆饼粉 ： 30g/L、 金枪鱼膏 ： 20mL/L、 玉米浆 ： 15g/L、 蔗糖 ： 25g/L、 葡萄糖 ： 10g/L、 碳 酸钙 ： 5g/L、 豆油 ： 10mL/L ； 上述成分溶解在去离子水中。 0040 发酵培养基 ： 0041 花生粉 ： 25g/L、 玉米粉 ： 17.5g/L、 谷朊粉 ： 30g/L、 金枪鱼膏 ： 20mL/L、 玉米浆 ： 40mL/L、 葡萄糖 ： 5g/L、 蔗糖 ： 10g/L、 蛋氨酸。
18、 ： 9g/L、 硫酸铵 ： 10g/L、 硫酸钙 ： 12g/L、 碳酸钙 ： 5g/L、 豆油 ： 70mL/L、 消沫剂 ： 1mL/L。上述成分溶解在去离子水中。 0042 3、 消沫剂 0043 用于试验的消沫剂如表 1。 0044 表 1 0045 0046 说 明 书 CN 102876766 B 5 4/6 页 6 0047 4、 培养方法 0048 斜面培养 0049 将保存于冷冻甘油管中的孢子接到大试管斜面， 28， 相对湿度 40 65% 培养 12 天， 4冰箱保藏。 0050 摇瓶种子培养 0051 由冷冻管孢子接入装有 50mL 种子培养基的 500mL 三角瓶中，。
19、 28， 220r/min 回转 式摇床 ( 偏心距 5cm) 培养 72h。 0052 摇瓶发酵培养 0053 将种子液 8mL 接入装有 46mL 发酵培养基的 500mL 挡板三角瓶中， 25培养， 260r/ min 摇床 ( 偏心距 5cm) 培养 3 天， 发酵 72 小时每瓶补加 1mL 豆油， 培养 5-6 天放瓶。 0054 50L 发酵罐培养 0055 将 25L 发酵培养基加入到发酵罐 ( 针对加消沫剂组和未加消沫剂组， 初始发酵培 养基中豆油量相同 )， 从接种口在火焰保护下按 15%(v/v) 的接种量将种子液接入发酵罐 内， 培养 110-150hr 左右， 培养温。
20、度 40h 之前 28， 40h 后控制为 25。发酵过程根据需要 补加硫酸铵和豆油。 0056 硫酸铵 ： 发酵前期， 当铵离子浓度降低到 1.5g/L 以下时开始补加硫酸铵溶液 (20%W/V)， 控制发酵液中的铵离子浓度在 1.2-1.5g/L。硫酸铵 50 小时后停止补加。 0057 豆油 ： 50 小时开始以 30g/hr 的速度补加。添加消沫剂组和不加消沫剂组在发酵 100 小时前补加豆油都是相同的 ； 添加消沫剂组 100 小时停止补加豆油， 开始补加消沫剂 ； 而不加消沫剂组继续补加豆油直到放罐， 补加量 30g/hr。 0058 5、 实验设备 0059 FUS-50L(A)。
21、 自控发酵罐 ： 发酵系统除配备 pH、 溶氧 (DO)、 温度、 转速等常规的测量 控制系统外， 还配备有整体称重传感器和高精度补料 ( 基质、 酸碱、 消泡剂等 ) 的测量与控 制， 并与尾气分析仪连接， 整机具有 14 个在线参数检测或控制功能， 并具有能输入实验室 手工测定参数的计算机控制与数据处理软件包 BIOSTAR， 由此可进一步精确得到发酵过程 优化与放大所必需的包括各种代谢流特征或工程特征的间接参数， 如摄氧率 (OUR)、 二氧化 碳释放率 (CER)、 呼吸熵 (RQ)、 体积氧传递系数 (KLa) 等。 0060 6、 分析方法 说 明 书 CN 102876766 B。
22、 6 5/6 页 7 0061 菌浓测定 ： 取 10mL 发酵液于离心管中， 4000r/min 离心 20min， 计算固形物体体积 占发酵液的比例。 0062 头孢菌素 C 效价测定 ： HPLC 法， 色谱柱 ： Thermo Hypersil ODS C184.6150mm， 5m ； 流动相 ： 0.8g 磷酸二氢钠于 1030mL 甲醇、 乙腈和水 (140 ： 40 ： 850) 的混合液中， 混合 溶解， 用四丁基氢氧化铵调pH至7.3用0.45m过滤器过滤， 流速 ： 1.0mL/min， 紫外检测波 长 ： 254nm， 室温， 进样量 20L。 0063 II. 结果与。
23、讨论 0064 实施例 1、 不同种类消沫剂对头孢菌素 C 发酵的影响 0065 在摇瓶培养水平上， 选择五种消沫剂 (A、 D 属于聚醚类消沫剂， B、 E 属于硅酮类消 沫剂， C 属于高碳醇类消沫剂 ) 按照 0.25%(v/v) 的比例添加到发酵培养基中 ( 初始添加豆 油， 添加量同对照组 )， 对照组不加消沫剂， 按照前述 “摇瓶发酵培养” 的方法培养 6 天， 考察 不同种类的消沫剂对头孢菌素 C 发酵的影响， 结果见图 1。 0066 五种消沫剂中， A、 C、 D 的效价 (u/mL) 高于对照， B、 E 的效价低于对照。其中 D 的 效价最高， E的效价最低。 可以看出聚。
24、氧乙烯氧丙烯甘油对头孢菌素C发酵的影响较小(甚 至有增效作用 )， 而硅酮类消沫剂对头孢菌素 C 发酵的影响较大。 0067 本实施例中， 消沫剂的添加比例较高 (0.25%(v/v)， 实验结果表明菌种对消沫剂 有一定的耐受性， 且取决于不同的消沫剂种类。聚醚类消沫剂、 高碳醇类消沫剂效果较好， 其中聚醚类消沫剂最佳。 0068 因此， 利用消沫剂替代豆油是一种可行的方法， 甚至可以高于以豆油作为主要碳 源的对照。 0069 实施例 2、 发酵过程中补加消沫剂对头孢菌素 C 发酵的影响 0070 在 50L 发酵罐中， 按照前述 “50L 发酵罐培养” 进行发酵。选择 D 消沫剂进行消沫 剂。
25、的补加实验， 100 小时开始通过蠕动泵间歇补加消沫剂， 当发酵液泡沫上升到泡沫与发酵 液总量在 35L 的位置 ( 通过发酵罐视镜观察 ) 开始补加消沫剂， 每次补加 1.5g 消沫剂 ( 即 0.043g/L 泡沫发酵液总量 )。硫酸铵到 50 小时后停止补加。豆油 50 小时开始以 30g/hr 的 速度补加， 100 小时停止补加豆油， 开始补加消沫剂。豆油补加量与对照组相比减少约 25%。 控制发酵液面在 35L 左右。 0071 同时设置对照组， 对照组中， 50 小时开始补加豆油一直到放罐， 豆油按照 30g/hr 的速度补加直到放罐， 硫酸铵 50 小时后停止补加。 0072 。
26、1、 补加 D 消沫剂后液面情况 0073 根据目测， 补加 D 消沫剂后， 液面基本上没有泡沫， 消沫效果明显优于豆油。 0074 2、 补加 D 消沫剂对头孢菌素 C 生物合成的影响 0075 补加 D 消沫剂后， 长势与补加豆油没有明显的差异， 见图 2。 0076 3、 补加 D 消沫剂对发酵液滤速的影响 0077 115 小时同时取实验罐 ( 补加 D 消沫剂 ) 和对照罐 ( 不补加 D 消沫剂 ) 的发酵液 测定滤速， 结果见图 3。 0078 从图 3 可以看出， 补加 D 消沫剂对发酵液滤速没有影响。 0079 结论 0080 在头孢菌素C发酵100小时左右开始补加消沫剂， 。
27、可以有效的控制液面的泡沫， 对 说 明 书 CN 102876766 B 7 6/6 页 8 的生物合成和滤速没有影响。通过成本测算， 补加消沫剂后原材料成本比单单补加豆油降 低约 15%。 0081 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 说 明 书 CN 102876766 B 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102876766 B 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 102876766 B 10 。