《利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生UPR的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生UPR的方法.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410756685.2 (22)申请日 2014.12.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104450706 A (43)申请公布日 2015.03.25 (73)专利权人 中山大学 地址 510275 广东省广州市新港西路135号 (72)发明人 陈义烘张泽芝翁少萍何建国 (74)专利代理机构 广州新诺专利商标事务所有 限公司 44100 代理人 刘婉 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/89(2006.0。
2、1) 审查员 徐浩 (54)发明名称 利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细 胞发生UPR的方法 (57)摘要 本发明提供了一种利用RNA干扰技术诱导凡 纳滨对虾血淋巴细胞产生UPR的方法， 其包括如 下步骤： (1)根据凡纳滨对虾Bip基因的cDNA序 列 ， 合成序列特异性的dsLvBip ； ( 2 )稀释 dsLvBip， 控制注射体积为50 L， 按1 g/g对虾的 剂量向凡纳滨对虾注射dsLvBip。 本发明的方法 能够简便、 快捷、 高效、 特异性地诱发凡纳滨对虾 血淋巴细胞发生非折叠蛋白反应。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 104450706 B 2017.04。
3、.05 CN 104450706 B 1.一种利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞产生UPR的方法， 其包括如下步 骤： （1） 根据凡纳滨对虾Bip基因的cDNA序列， 合成序列特异性的dsLvBip； （2） 稀释dsLvBip， 控制注射体积为50L， 按1g/g对虾的剂量向凡纳滨对虾注射 dsLvBip； 所述步骤 （1） 包括： 设计合成针对dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA模板的引物； 通过PCR反应合成dsLvBip的正向ssRNA的模板和反向ssRNA的模板， 然后经变性、 退火形成 dsLvBip； 所述步骤 （1） 中， 设计合成ssRNA和反向ssRNA。
4、的模板的两对引物为： DsRNA-LvBip-482-T7-F1： GATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA DsRNA-LvBip-482-R1： CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG DsRNA-LvBip-482-F2： TGTCGGTGGTTCCACTCGTA DsRNA-LvBip-482-T7-R2： GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中， PCR反应体系加样参数为： 正反引物各1 L ， 浓度为10pM， 。
5、10Mm dNTP 1 L， 10PCR 缓冲液 5 L， LA Taq酶1 L， 凡纳滨 对虾cDNA模板100 ng， 以超纯水补足至50 L。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中， PCR的运行程序参数为： 94 预变性3分钟； 然后94变性30秒， 58退火30秒， 72延伸30秒； 重复循环35次。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中， 正向ssRNA和反向ssRNA T7 RiboMAX Express RNAi System 合成反应体系20 L为： Express T7 2 buffer 10 L， Express。
6、 T7 Enzyme Mix 2 L， DNA模板1 g， RNase free 水补足总体积至20 L， 37 反应4小时。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中， 将正向ssRNA和反向ssRNA 混合， 70水浴10分钟， 退火形成dsLvBip； 将dsLvBip产物用RNAase A solution及RNase free DNase 37水浴30分钟， 除去反应后多余的DNA和ssRNA； 将上述dsRNA产物纯化， 即加 入4.4 L pH 为5.2浓度为3 M的醋酸钠、 110 L无水乙醇， 冰上静置5分钟后， 16000 g室温 离心10分钟， 。
7、所得沉淀即为dsLvBip。 6.根据权利要求1至5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中， 测量凡纳滨对 虾的平均体重， 稀释合成的dsLvBip， 控制注射体积为50L， 最终以1 g/g对虾的剂量于凡 纳滨对虾第二腹节处刺入向血窦方向注射。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104450706 B 2 利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生UPR的方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学RNA干扰技术与运用领域， 具体涉及利用RNA干扰技术对凡 纳滨对虾Bip基因敲降诱发血淋巴细胞发生UPR的方法。 背景技术 0002 海洋无脊椎动物对虾属中的对虾(Lito。
8、penaeus vannamei)是我国水产养殖的重 要种类。 2013年， 全球养殖对虾产量达330万吨， 其中， 我国养殖对虾产量为130万吨， 为世界 对虾养殖第一大国。 我国主要养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、 斑节对虾 (Penaeus monodon)、 中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊对虾 (Marsupenaeus japonicus)4种对虾， 其中凡纳滨对虾是主要养殖种类， 在全国沿海11个省 市均有养殖， 约占养殖对虾总产量90。 0003 随着养殖规模的不断扩大及养殖环境的恶化， 对虾病害严重， 给对虾养。
9、殖业造成 严重损失。 其中以对虾白斑综合症(white spot syndrome ,WSS)和肝胰腺坏死病 (hepatopancreatic necrosis syndrome,HPNS)等所引起的损失尤为严重。 如19931995 年间， 我国90对虾养殖池塘发生了WSS， 导致我国养殖对虾由1992年的22万吨下降到1994 年的5.3万吨， 年直接经济损失超过30亿元。 。 肝胰腺坏死病则是最近几年来新出现的危害 全球对虾养殖业的病害， 2013年这两种虾病的暴发使整个东南亚的养殖对虾产量下降40 左右。 0004 凡纳滨对虾病害发生的直接原因为病原体感染， 如WSSV或副溶血弧菌的。
10、感染， 然 而种种迹象表明环境胁迫在这些疾病的暴发过程中扮演重要的角色。 WSS在春夏、 夏秋之交 这些气候环境变化较大的时期容易暴发。 天气闷热、 寒潮、 连续阴天、 暴雨、 池中浮游藻类死 亡和水质变化等均可诱发WSS的暴发。 天气剧烈变化、 水质富营养化情况下对虾免疫力下降 和虾塘水体中条件性致病细菌的迅速增殖则被认为是导致对虾偷死病暴发的原因之一。 0005 水体各种理化因子(包括病原生物的种类和数量)的急剧变化对对虾而言是种胁 迫， 称为环境胁迫。 环境胁迫影响到对虾的免疫系统功能， 而其分子机制仍不得而知。 已知 环境胁迫会干扰真核生物细胞内的蛋白质折叠过程， 造成未折叠的蛋白或错。
11、误折叠的蛋白 大量滞留于内质网腔内， 形成内质网应激(endoplasmic reticulum stress ,ER)- stress， 影响真核细胞的正常的生理过程。 为缓解ER-stress， 真核细胞会活化UPR、 内质网 介导的蛋白质降解(ER-associated degradation,ERAD)通路和钙离子通路。 UPR在这一系 列反应中处于核心地位。 UPR包含IRE1-XBP1通路、 PERK-eIF2 通路及ATF6通路这3条支路。 目前对虾中UPR三条支路的多个关键基因与环境胁迫间的关系已得到研究， 结果表明UPR在 对虾环境胁迫响应方面有重要功能， 故其应当在凡纳滨对。
12、虾中环境胁迫响应调控免疫系统 功能方面扮演重要角色。 进行凡纳滨对虾UPR与免疫系统关系、 UPR与病毒感染的关系、 UPR 与细胞周期调控的关系及UPR与物质代谢的关系等方面的研究需要有效、 快捷的凡纳滨对 虾细胞UPR诱导方法， 然而， 至今仍未发现能在凡纳滨对虾中特异性激活UPR的方法。 说明书 1/5 页 3 CN 104450706 B 3 发明内容 0006 本发明的目的提供一种利用RNA干扰技术， 高效、 特异性地诱发凡纳滨对虾血淋巴 细胞发生UPR(非折叠蛋白反应)的方法。 0007 为实现以上目的， 本发明提供了如下技术方案： 0008 一种利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血。
13、淋巴细胞发生UPR(非折叠蛋白反应)的 方法， 其包括如下步骤： 0009 (1)根据凡纳滨对虾Bip基因的cDNA序列， 合成序列特异性的dsLvBip； 0010 (2)稀释dsLvBip， 控制注射体积为50 L， 按1 g/g对虾的剂量向凡纳滨对虾注射 dsLvBip。 0011 注射入凡纳滨对虾体内的dsLvBip诱发RNAi效应， 从而特异性地降低凡纳滨对虾 Bip的表达量， 解除UPR的抑制状态， 而诱发血淋巴细胞产生UPR， 即XBP1前体mRNA发生切割， eIF2 磷酸化程度增强。 0012 优选地， 所述步骤(1)包括： 设计合成针对dsLvBip的正向ssRNA和反向s。
14、sRNA模板 的引物； 通过PCR反应合成dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA， 然后经变性、 退火形成 dsLvBip。 0013 dsLvBip的合成过程如下： 设计两对分别在正向引物或反向引物中加入T7启动子 序列(5 GGATCCTAATACGACTCACTATAGG3 )的特异性引物， 以凡纳滨对虾cDNA为模板扩增两 份分别在5 端或是3 端带有T7启动子的的长度为507bp的DNA序列作为RNA合成模板。 将这 两个模板分别体外反转录成正向ssRNA和反向ssRNA(T7 RiboMAX Express RNAi System, Promega,USA； Cat.P17。
15、00)， 合成的ssRNA和反向ssRNA加入到同一管子中， 经高温变性、 退火 形成dsLvBip。 0014 其中， 所述步骤(1)中， 设计合成ssRNA和反向ssRNA的模板的两对引物为： 0015 DsRNA-LvBip-482-T7-F1： 0016 GATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA 0017 DsRNA-LvBip-482-R1： CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG 0018 DsRNA-LvBip-482-F2： TGTCGGTGGTTCCACTCGTA 0019 DsRNA-LvBip-482-T7-R2： 002。
16、0 GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG 0021 其中， 所述步骤(1)中， PCR反应体系加样参数为： 正反引物各1 L， 浓度为10pM， 10Mm dNTP1 L， 10PCR缓冲液5 L， LA Taq酶1 L， 凡纳滨对虾cDNA模板100ng， 以超纯水补 足至50 L。 0022 其中， 所述步骤(1)中， PCR的运行程序参数为： 94预变性3分钟； 然后94变性30 秒， 58退火30秒， 72延伸30秒； 重复循环35次。 由此， ssRNA(D sRNA-LvBip-482-T7-F1/ DsRNA-LvBip-48。
17、2-R1)和反向ssRNA(DsRNA-LvBip-482-F2/DsRNA-LvBip-482-T7-R2)的模 板分别合成。 0023 其中， 所述步骤(1)中， 正向ssRNA和反向ssRNA(T7 RiboMAX Express RNAi System)合成反应体系(20 L)为： Express T72buffer10 L， Express T7 Enzyme Mix2 L， DNA模板1 g， RNase free水补足总体积至20 L， 37反应4小时。 说明书 2/5 页 4 CN 104450706 B 4 0024 其中， 所述步骤(1)中， 将正向ssRNA和反向ssRN。
18、A混合， 70水浴10分钟， 退火形成 dsLvBip。 将dsLvBip产物用RNAase A solution及RNase free DNase37水浴30分钟， 除去 反应后多余的DNA和ssRNA。 将上述dsRNA产物纯化， 即加入4.4 L3M醋酸钠(pH5.2)， 110 L无 水乙醇， 冰上静置5分钟后， 16000g室温离心10分钟， 所得沉淀即为dsLvBip， 最终用100 L DEPC水溶解， 电泳检测并测OD值后， 放置-20保存。 0025 优选地， 所述步骤(2)中， 测量凡纳滨对虾的平均体重， 稀释合成的dsLvBip， 控制 注射体积为50 L， 最终以1 g。
19、/g对虾的剂量于凡纳滨对虾第二腹节处刺入向血窦方向注射。 0026 注射dsLvBip后对RNA干扰效果进行检测： 在dsRNA注射4872小时后， 分别提取注 射PBS、 dsGFP和dsLvBip的凡纳滨对虾的血淋巴细胞的总RNA， 逆转录为cDNA。 在模板量一致 的前提下， 通过RT-PCR的方法扩增LvBip， 并在1的琼脂糖凝胶上检测对比3组样品之间测 Bip条带的亮度， 进而确定注射dsLvBip对凡纳滨对虾血淋巴细胞中的Bip的RNAi效果。 0027 通过两种方法确定敲降Bip之后凡纳滨对虾UPR状态： (1)通过RT-PCR技术， 检测 XBP1前体mRNA的检测情况， 若。
20、XBP1前体mRNA发生剪切， 则说明样品发生UPR。 (2)通过 western-blot技术检测eIF2 的磷酸化状态， 如果其发生磷酸化修饰则说明样品发生UPR。 0028 经检测， 本发明的方法能够有效地诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生非折叠蛋白反 应。 0029 本发明具有以下优点： 0030 (1)本发明可简便、 快捷、 高效、 特异性地诱发凡纳滨对虾血淋巴细胞产生UPR， 所 获得的效果对后续的其他相关研究， 如凡纳滨对虾UPR对免疫系统的调控研究提供了基础。 0031 (2)本发明的核心是利用RNA干扰(RNAi)技术， 特异性地降低凡纳滨对虾Bip基因 的表达量， 继而解除其细胞。
21、中的UPR的抑制， 而使得UPR被激活。 可在注射dsLvBip后的48小 时至72小时的时间范围内， 于凡纳滨对虾血淋巴细胞中持续诱发UPR。 0032 (3)本发明的方法可有效应用于凡纳滨对虾的环境胁迫响应研究， 为其研究提供 合适的动物模型， 也用于辅助UPR与免疫系统关系、 UPR与病毒感染的关系、 UPR与细胞周期 调控的关系及UPR与物质代谢的关系等方面的研究。 附图说明 0033 图1： 注射LvBip48小时和72小时之后凡纳滨对虾血淋巴细胞中Bip基因的敲降效 果。 PBS组， dsGFP组为对照， 每个样品3个平行， EF1- 为内参。 0034 图2： 注射LvBip后凡。
22、纳滨对虾血淋巴细胞中XBP1基因前体mRNA的剪切效果。 dsGFP 组为对照， EF1 为内参； 以为注射dsLvBip的样品利用LvXBP1引物进行扩增， 出现两条条带 即说明凡纳滨对虾XBP1的前体mRNA发生了剪切。 从图中可以看到， 在注射dsLvBip后的24小 时XBP1的前体mRNA即开始发生剪切， 持续到注射后96小时， 说明此期间UPR被激活。 0035 图3： 注射LvBip后凡纳滨对虾血淋巴细胞中eIF2 的磷酸化水平变化。 从图中可以 看到注射dsLvBip后的48小时或72小时eIF2 的磷酸化水平增强， 说明UPR被激活。 具体实施方式 0036 以下结合附图和具。
23、体实施例， 对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详 述， 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 说明书 3/5 页 5 CN 104450706 B 5 0037 实施例 0038 首先设计合成针对dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA模板的引物， 通过PCR反应合 成dsLvBip的ssRNA和反向ssRNA， 然后经变性、 退火形成dsLvBip。 以1 g/g体重的剂量于凡 纳滨对虾第二腹节处注射dsLvBip。 注射后的4872小时取凡纳滨对虾血淋巴细胞样品提 取总RNA ,逆转录为cDNA， 再检测凡纳冰对虾血淋巴细胞总Bip基因(GenBan。
24、k under accession No.JQ265942)干扰效果和UPR激活效果。 0039 设计合成ssRNA和反向ssRNA的模板的两对引物： 0040 DsRNA-LvBip-482-T7-F1: 0041 GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA 0042 DsRNA-LvBip-482-R1:CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG 0043 DsRNA-LvBip-482-F2:TGTCGGTGGTTCCACTCGTA 0044 DsRNA-LvBip-482-T7-R2: 0045 GGATCCTAATACGACTCACTAT。
25、AGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG 0046 50 L PCR反应体系加样参数:正反引物各1 L(10pM)， 10Mm dNTP1 L， 10PCR buffer5 L， LA Taq酶1 L， 凡纳滨对虾cDNA模板100ng， 以超纯水补足至50 L。 PCR运行程序 参数： 94预变性3分钟； 然后94变性30秒， 58退火30秒， 72延伸30秒； 重复循环35次。 ssRNA(DsRNA-LvBip-482-T7-F1/DsRNA-LvBip-482-R1)和反向ssRNA(DsRNA-LvBip-482- F2/DsRNA-LvBip-482-T7-R2)的模板分别合。
26、成。 0047 SsRNA和反向ssRNA合成反应体系(20 L)为： Express T7 2buffer 10 L， Express T7Enzyme Mix2 L， DNA模板1 g， RNase free水补足总体积至20 L， 37反应4小 时。 0048 将正向ssRNA和反向ssRNA产物各20 L混合， 70水浴10分钟， 退火形成dsLvBip。 于dsLvBip产物加入1 L RNAase A solution(1:200稀释)及RNase free DNase37水浴30 分钟。 将上述dsRNA产物纯化， 即加入4.4 L3M醋酸钠(pH5.2)， 110 L无水乙醇，。
27、 冰上静置5分 钟后， 16000g室温离心10分钟， 所得沉淀即为dsLvBip， 最终用100 L DEPC水溶解， 电泳检测 并测OD值后， 放置-20保存。 0049 DsGFP以同样的方法合成， 模板为水母绿色荧光蛋白基因， 合成正向ssRNA和反向 ssRNA的模板的引物为： 0050 DsRNA-eGFP504-F： 0051 GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCGACGTAAACGGCCACAAGTT 0052 DsRNA-eGFP504-R1： ATGGGGGTGTTCTGCTGGTAG 0053 DsRNA-eGFP504-F2： CGACGTAAACGGC。
28、CACAAGTT 0054 DsRNA-eGFP504-R： 0055 GGATCCTAATACGACTCACTATAGGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAG 0056 随机取15条凡纳滨对虾测量实验的凡纳滨对虾的平均体重； 然后以1 g/g对虾的 注射剂量为标准， 根据虾的体重适当的稀释合成的dsLvBip， 使注射体积为50 L。 于凡纳滨 对虾第二腹节处刺入向血窦方向注射。 0057 在dsRNA注射的不同时段分别提取注射PBS、 dsGFP和dsLvBip的凡纳滨对虾的血淋 巴细胞的总RNA， 以等量的总RNA逆转录为cDNA。 总RNA提取采用Rneasy Plus Mini 。
29、Kit 说明书 4/5 页 6 CN 104450706 B 6 (QIAGEN,Germany； Cat.No.74136)， RNA逆转录采用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(大连宝生物， Cat.No.D6210A),操作过程按照产品说明书进行。 0058 各取100ng的cDNA为模板， 通过RT-PCR的方法扩增LvBip,反应体系和PCR程序如 下： 50 L PCR反应体系加样参数:正反引物(SQ-LvBip-661-F:AGCCACCAGGTCAGGATTGA； SQ- LvBip-661-R： CCTTGTTTCCTGT。
30、GCCCTTG)各1 L(10pM)， 10Mm dNTP 1 L， 10PCR buffer5 L， LA Taq酶1 L， 凡纳滨对虾cDNA模板100ng， 以超纯水补足至50 L。 PCR运行程序参数： 94预 变性3分钟； 然后94变性30秒， 58退火30秒， 72延伸40秒； 重复循环32次。 PCR产物于 1的琼脂糖凝胶上电泳， 对比3组样品之间测Bip条带的亮度， 检测凡纳滨对虾血淋巴细胞 中的Bip的RNAi效果(如图1所示)。 0059 通过两种方法确定敲降Bip之后凡纳滨对虾UPR状态， 0060 (1)凡纳滨对虾XBP1前体mRNA剪切情况检测。 检测引物、 PCR参。
31、数及程序如下： 0061 检测引物： 0062 LvXBPu/s-F： GCCATGAATATCGGCTGTAAC 0063 LvXBPu/s-R： TGTTGAGAGAACCATGATCCG 0064 50 L PCR反应体系加样参数:正反引物各1 L(10pM)， 10Mm dNTP 1 L， 10PCR buffer5 L， LA Taq酶1 L， 凡纳滨对虾cDNA模板100ng， 以超纯水补足至50 L。 PCR运行程序 参数： 94预变性3分钟； 然后94变性30秒， 58退火30秒， 72延伸20秒； 重复循环36次。 PCR产物于5的琼脂糖凝胶上电泳， 可检测到凡纳滨对虾血淋巴。
32、细胞中的XBP1前体mRNA在 dsLvBip注射24小时后开始出现两条条带(如图2所示)。 0065 (2)通过western-blot技术利用eIF2 磷酸化抗体(Phospho-eIF2a Antibody， CST， 货号： 9821)检测eIF2 的磷酸化状态， 如果其磷酸化修饰增强则说明样品发生UPR。 0066 凡纳滨对虾eIF2 的磷酸化状态检测。 1mL的一次性注射器吸取300 L预冷的抗凝 剂(10mmol/LEDTA,450mmol/LNaCl,10mmol/LKCl,10mmol/LHEPES,pH7.3)， 然后插入对虾血 窦吸取血淋巴； 5条凡纳滨对虾的血淋巴集于1。
33、管中， 41000rpm离心5分钟收集血淋巴细 胞， 去除上清； 以预冷PBS重悬细胞， 再离心收集细胞， 重复3次。 之后加入200 L含磷酸酶抑 制剂的预冷NP-40裂解液冰上裂解细胞10分钟。 之后， 离心取上清， 加入50 L5的蛋白质电 泳上样缓冲液， 沸水浴5分钟， 然后-20保存备用。 对照样品同样处理。 0067 实验样品和对照样品各取20 L的样品进行SDS-PAGE电泳， 分离胶浓度12； 湿法 转膜(纤维素膜)条件为180mA， 3小时。 0068 将转好的纤维素膜置于含5脱脂奶粉的TBST缓冲液(每升TBST含Tris base 2.422g,Nacl8.775g， T。
34、ween200.5mL)封闭2小时； 然后加入以含0.1Tween2、 3BSA的TBST 以1:1000稀释的eIF2 磷酸化抗体， 于4轻柔摇动孵育过夜； 之后用TBST洗涤膜3次， 每次5 分钟； 加入含3BSA TBST的以1:10000稀释的HRP偶联二抗， 室温轻柔摇动孵育2小时； 之后 用TBST洗涤膜3次， 每次15分钟； 然后化学发光法显色观察结果(如图3所示)。 如图所示， 在 dsLvBip组中， 磷酸化修饰增强， 说明样品发生UPR。 说明书 5/5 页 7 CN 104450706 B 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 8 CN 104450706 B 8 。