技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说涉及一种从中国总状蕨藻中分离得到的血红素酸酯化的链状二萜类新化合物。本发明还涉及该化合物的制备方法；本发明还涉及该化合物可用来制备PTP1B抑制剂，也可用于制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物。
背景技术
总状蕨藻 Caulerpa racemosa (Forsskål) J. Agardh系绿藻门 (Chlorophyta)绿藻纲 (Chlorophyceae) 管藻目(Siphonales) 蕨藻科 (Caulerpaceae) 蕨藻属（Caulerpa）海洋植物，主要分布于热带和亚热带海域，生长在潮间带以下的岩石、珊瑚礁上或者中、低潮带的沙地上。在我国海域也有广泛分布，主要集中于福建东山、台湾、海南、西沙、广东沿海。
糖尿病(diabetes mellitus) 是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。目前，一般将糖尿病分为两类，I-型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病，insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM) 与II-型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病，non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)。糖尿病中90％以上是II-型糖尿病。
II-型糖尿病的特点是胰岛素敏感组织如骨骼肌、肝、脂肪组织对胰岛素作用的抵抗。蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡细胞内胰岛素作用通路中相关蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越来越受到重视，成为治疗II-型糖尿病的新途径。PTPase包括一大族跨膜(受体型)和胞内(非受体型)酶，参与调控一系列重要生命过程。目前，对PTPase在胰岛素通路中受体或受体后环节影响正常胰岛素作用的研究，主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2、PTP1B。
PTP1B是第一个被鉴定的蛋白酪氨酸磷酸酯酶( protein tyrosinephosphatase), 通过PTP1B 剔除的老鼠实验表明,PTP1B通过对胰岛素受体的脱磷酰化，进而在调节胰岛素敏感性和脂肪代谢过程中起着非常重要的作用。因而，选择性的、高活性的PTP1B抑制剂在II-型糖尿病、肥胖症及其并发症的治疗中有重要的价值。
发明内容
本发明是从中国总状蕨藻（C. racemesa）中提取分离得到的血红素酸酯化的链状二萜类新化合物 I。经药理试验研究表明，该化合物对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B)具有显著抑制活性。
因此，本发明的一个目的是提供结构式为 I 的新化合物。
本发明的另一个目的是提供所述化合物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供所述化合物的用途。具体地说，所述化合物在制备蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B) 抑制剂的药物中的应用，进一步在制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物中的应用。
根据本发明的第一个目的，本发明首次从总状蕨藻中发现了一个血红素酸酯化的链状二萜类新化合物I，其化学结构如下所示：
根据本发明的第二个目的，本发明提供所述化合物的制备方法，它是从总状蕨藻中分离得到的，具体步骤如下：
1)制备提取物浸膏
将冷冻的总状蕨藻(C.racemosa)用乙醇按常规渗漉提取，得提取液，将提取液减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏；
2)分离纯化
(1)将上述提取物分散于水中成混悬液，将混悬液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，所得萃取液浓缩分别得到石油醚提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏和正丁醇提取浸膏；
(2)将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到5个组分(A-E)；其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇洗脱，得到一无色油状物，即本发明的式I化合物。
在上述制备方法中，在制备提取物浸膏步骤中，所述提取采用的乙醇为95%乙醇。
在上述制备方法中，在分离纯化步骤中，所述Sephadex LH-20凝胶柱层析中用的二氯甲烷/甲醇洗脱浓度为体积比1:1。
根据本发明的第三个目的，本发明提供了所述化合物在制备蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B (PTP1B) 抑制剂、糖尿病药物、肥胖症药物的用途。
本发明对所得结构式为 I的新化合物进行了体外PTP1B抑制试验，结果表明该化合物对PTP1B 有明显的抑制活性。因此，可用来制备PTP1B抑制剂，用于治疗糖尿病、肥胖症及其并发症。
本发明的血红素酸酯化的链状二萜类新化合物 I可通过海藻中分离纯化得到；也可以经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。
附图说明
图1：PTP1B抑制活性测试原理。
图2：结构式 I 化合物的氢谱（氘代试剂：CDCl3）。
图3：结构式 I 化合物的氢谱（氘代试剂：pyridine-d5）。
图4：结构式 I 化合物的碳谱（氘代试剂：CDCl3）。
图5：结构式 I 化合物的碳谱（氘代试剂：pyridine-d5）。
图6：结构式 I 化合物的COSY谱（氘代试剂：CDCl3）。
图7：结构式 I 化合物的HSQC谱（氘代试剂：CDCl3）。
图8：结构式 I 化合物的HMBC谱（氘代试剂：CDCl3）。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物I的化学结构式(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)：
实施例1
结构式I化合物的制备
1.制备总状蕨藻提取物浸膏
(1)制备提取液
将冷冻的中国总状蕨藻(C.racemosa)(采自广东湛江沿海)5kg(干重)分别用30L95％乙醇渗漉提取三次，每次渗漉1天，合并提取液；
(2)制备提取物浸膏
将上述提取液在温度≤45℃减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏350g；
2.分离纯化
1)将上述提取物浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用石油醚(1.5L)、乙酸乙酯(1.5L)和正丁醇(1L)分别萃取三次，所得萃取液减压浓缩分别得到石油醚提取浸膏(38g)、乙酸乙酯提取浸膏(160g)和正丁醇提取浸膏(120g)；
2)将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱；梯度洗脱的浓度以此为体积比100:0、95:5、85:15、80:20、70:30和50:50，根据TLC显色合并相似流份得到5个组分(A-E)；3)组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱，得到一无色油状物，即本发明的式I化合物，经鉴定为新化合物。
3. 结构鉴定
图2：结构式 I 化合物的氢谱（氘代试剂：CDCl3）；
图3：结构式 I 化合物的氢谱（氘代试剂：pyridine-d5）；
图4：结构式 I 化合物的碳谱（氘代试剂：CDCl3）；
图5：结构式 I 化合物的碳谱（氘代试剂：pyridine-d5）；
图6：结构式 I 化合物的COSY谱（氘代试剂：CDCl3）；
图7：结构式 I 化合物的HSQC谱（氘代试剂：CDCl3）；
图8：结构式 I 化合物的HMBC谱（氘代试剂：CDCl3）。
按常规经NMR、HRESIMS、UV、IR及旋光等多种现代光谱技术，确定了化合物I的化学结构，其理化性质如下：
白色粉末, 分子式为C28H47NO4；
比旋光度[α20D –22.0 (c 0.23, CHCl3)；
紫外光谱UV (MeOH) λmax (logε) 221 (4.28), 238 (3.80) nm；
红外光谱IR (KBr) νmax: 3258, 2854, 1739, 1723, 1715, 1421, 1292, 1221,1026, 903, 829 cm–1；
高分辨质谱HRESIMS m/z 484.3425 (calcd for C28H47NO4Na, 484.3403)；
核磁共振氢谱1H NMR (400 MHz) 及核磁共振碳谱 13C NMR (100 MHz) 数据见表一
表一 所述化合物 I 的1H和13C NMR
实施例2
PTP1B抑制活性的测试：
测试原理：见图1。利用分子生物学手段 在大肠杆菌系统表达人源蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（hPTP1B)催化结构域，经纯化后的hPTP1B重组蛋白能水解底物对硝基苯磷酸 (p-Nitrophenyl phosphate，pNPP)的磷脂键，得到黄色可溶产物对硝基苯酚(p-Nitrophenol)，该产物在410nm处有很强的光吸收，因此可以直接检测410nm处光吸收的变化及观察酶的活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况。
标准的测活体系：10mM Tris.Cl三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)，pH 7.6，10mMpNPP，2％DMSO，100nM hPTP1B。
观察指标：动态测定波长为410 nm处的光吸收，时间为3分钟，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。
试验方法：用于筛选的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B 是从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白。采用紫外适用底物对硝基苯磷酸（pNPP），观察不同浓度对重组酶的活性的抑制作用，以初步评价化合物的药用效果。临用前将样品溶于DMSO 配成适当浓度， 3 倍稀释，7 个稀释度，设置三复孔，取2μL 样品溶液加入96 孔板，然后加入88μL assay mix(assay buffer，pNPP，H2O)，再加入10μL PTP1B。将96 孔板置于VERSAmax上动态检测波长为410nm 处检测光吸收值，时间为3 分钟。
实验结果的评判与解释：
筛选结果是化合物浓度为20μg/ml 时对酶活性的百分抑制率，抑制率高于50％时，按常规筛选(将抑制率高于50％的被检测化合物稀释成不同的浓度，依上述测试方法进行反应，所有试验均设置复孔)得出IC50，阳性对照正钒酸钠的IC50为2μM。
实验结果：本发明式 I 化合物对PTP1B酶抑制活性的IC50为2.3μM。
实验结论：通过分子生物学试验，可以看出化合物I对蛋白酪氨酸酯酶1B（PTP1B）具有较好的抑制活性。因此，本发明的化合物I可用于制备糖尿病、肥胖症及其并发症的药物中，为了改善性能还可以进一步的添加常用的药用辅料方便制成更易接受的药物形式。