技术领域
本发明涉及一种蛋白质纯化的方法及系统，更具体地说，本发明涉及使用淀粉结合蛋白的方法及系统。
背景技术
通过于微生物系统表达以生产蛋白质已成为高价、医药用蛋白质的主要来源。纯化及回收重组蛋白于设计发酵制程中为一重要考虑。而蛋白质纯化的传统方法可用于分离产物，改良方法包含重组蛋白质的使用。重组蛋白可以亲和管柱层析法纯化，重组蛋白的所需成分通过其共价性连接至多肽而纯化，该多肽连接于亲和性基质(亲和介质)。
有某些通过亲和性管柱层析原理而用于分离蛋白质的系统存在。
美国专利号第5,643,758号的专利描述了包含有麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)的系统。克隆基因(cloned gene)插入于来自可编码出麦芽糖结合蛋白的malE基因pMAL载体下游(down-stream)。该载体可转化至寄主细胞(host cell)，其后该重组蛋白可于该寄主细胞表达。该细胞的溶解产物或培养基部分可装载于包含亲和性基质淀粉糖(amylose)的管柱并清洗数次，其后使用大量的麦芽糖抽提重组蛋白。
美国专利号第5,202,247号的专利描述了包含有纤维素结合区域(cellulose-binding domain)的系统。纤维素管柱可用于纯化包含有纤维素结合区域的重组蛋白。该细胞的溶解产物或培养基部分可装载于该管柱并清洗。纤维素结合区域与纤维素的交互作用似乎是于中性pH值的疏水性交互作用而驱使。一般抽提方法使用低极性溶剂例如乙二醇，在移除低极性溶剂前使用透析或过滤。
这些现存蛋白质纯化系统具有某些缺点。其蛋白质纯化过程不方便且费力。用于纯化的管柱是昂贵的。这些系统进行蛋白质纯化的限制包含无法在某些情况下分离重组蛋白，例如含有EDTA的样品，以及现有使用的蛋白质标签与此发明的目标蛋白相比，相对较大者。
利用酵素产物于水中饲养现今尚存某些问题，例如(a)饲料加入水中后酵素快速流失，以及(b)当饲料制锭温度高于100℃时酵素活性将会被破坏。
相关申请案的交互参照
此申请案主张下列的优先权：于2009年05月15日申请的美国临时申请案第61/178,816号。前述申请案揭示内容全体皆引用作为本说明书的参考数据。
发明内容
本发明的具体说明及简要描述如下，本发明的特征在于淀粉结合蛋白标签化重组蛋白(starch binding protein(SBP)-tagged recombinant protein)、淀粉结合蛋白结合基质(SBP-binding matrix)及其在蛋白质纯化的应用。
在某些实施例中，提供一种纯化重组蛋白的方法，包含：
(a)提供包含淀粉结合蛋白标签化重组蛋白(starch binding protein(SBP)-tagged recombinant protein)的溶液；
(b)添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉结合蛋白结合基质(SBP-binding matrix)；
(c)抽提碱性缓冲液至步骤(b)的第一容器以获得混合物；
(d)将该混合物与溶液混合，该溶液用于在第二容器中切割淀粉结合蛋白及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉结合蛋白结合基质以回收重组蛋白。
再者，在其它实施例中，提供一种纯化重组蛋白的系统，包含：
装置(a)，用于提供包含淀粉结合蛋白标签化重组蛋白的溶液；
装置(b)，用于添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉结合蛋白结合基质；
装置(c)，用于抽提碱性缓冲液至(b)的第一容器以获得混合物；
装置(d)，用于将该混合物与溶液混合，该溶液用于在第二容器中切割淀粉结合蛋白及重组蛋白以生成反应混合物；以及
装置(e)，用于添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉结合蛋白结合基质以回收重组蛋白。
在某些方面，该淀粉结合蛋白结合基质包含：淀粉、分枝淀粉(amylopectin)、直链淀粉树脂(amylose resin)、糊精树脂(dextrin resin)或藻酸盐微粒(alginate beads)。
在某些方面，(a)的淀粉结合蛋白标签化重组蛋白来自于细胞，且(b)淀粉结合蛋白结合基质为淀粉。
在其它方面，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器为可抛弃式。
在其它方面，(d)的混合物进一步添加淀粉结合蛋白-内切蛋白酶(SBP-endoprotease)。在特定方面，该淀粉结合蛋白-内切蛋白酶为淀粉结合蛋白-急性严重呼吸道症候群蛋白酶(SBP-SARS protease)或淀粉结合蛋白-肠激酶(SBP-enterokinase)。
在另一方面，(a)的溶液具有4至6的pH值。
在另一方面，(c)的缓冲液具有7至11的pH值。
在又一方面，淀粉结合蛋白标签化重组蛋白于淀粉结合蛋白及目标蛋白间包含有内切蛋白酶识别位置。
在又一方面，(b)的溶液具有4至8的pH值。
在再一方面，某些实施例于步骤(e)前进一步包含中和步骤用于调整pH值直到5至7。
在再一方面，某些实施例进一步包含中和装置，用于调整pH值直到5至7。
在某些实施例中，提供一种具有热稳定性的重组蛋白，其以上述任一实施例的方法制备，其中该重组蛋白以淀粉结合蛋白标签及目标蛋白而融合。
在其它方面，该目标蛋白指脂酶(Lipase)、聚木糖酶(Xylanase)或植酸酶(Phytase)。
在其它实施例中，提供一种用于制备重组蛋白的方法，该重组蛋白包含有淀粉结合蛋白标签及蛋白质A(proteinA)，其中该重组蛋白通过酵母菌或细菌而表达。
在某些方面，该酵母菌为准赤酵母属(Pichia)。
在某些方面，该细菌为大肠杆菌(E.coli)。
本发明中一或多个实施例的细节将于下详细描述。而本发明的其它特征及优点将由下述的详细描述及权利要求中显现。
上述的一般性描述及后述的详细描述可通过例子而理解，且可提供如本发明所主张的进一步解释。
附图说明
图1表示一种系统，该系统设计用于高度专一性切割地融合蛋白质，接着将其快速、亲和性为主地获取并移除所有淀粉结合蛋白标签化(SBP-tagged)的残基。(即：SBP-标签化内切蛋白酶(SBP-taggedendoprotease)、SBP-标签化-目标蛋白(SBP-tagged target protein)及游离SBP(free SBP))。
图2表示SBP-植酸酶(SBP-Phytase)及植酸酶(Phytase)在水中的示意图。
图3表示SBP-植酸酶(SBP-Phytase)在水中释放实验的结果。
图4A-4C表示淀粉结合蛋白-增强型绿色荧光蛋白(SBP-eGFP)结合至不同类型树脂的结合试验的聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)的结果。图4A显示分枝淀粉(amylopectin)的结果。图4B显示直链淀粉树脂(amyloseresin)的结果。图4C显示糊精树脂(dextrin resin)的结果，其中，M：标记，In：流入物，P：结合蛋白，S：未结合蛋白。
图5显示淀粉结合蛋白-增强型绿色荧光蛋白(SBP-eGFP)结合至藻酸盐微粒(alginate beads)的结合试验的聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)的结果，其中，M：标记，In：流入物，S：未结合蛋白，E：抽提物。
图6显示亲和性标签化(affinity-tagged)的纯化及”完全切割(Clean-Cut)”的去标签化(de-tagging)过程的结果，其中，1：以第一淀粉管柱纯化的目标蛋白，2：SBP-蛋白酶切割的SBP，3：经纯化去标签化的目标蛋白，4：结合于第二淀粉管柱的SBP及SBP-蛋白酶。
图7A-7B表示以淀粉结合蛋白-蛋白质A直链淀粉树脂(SBP-SpAamylose resin)进行免疫球蛋白纯化的结果。图7A表示纯化来自E.coli.的淀粉结合蛋白-蛋白质A(SBP-SpA)的纯化结果。图7B表示纯化来自Pichia的淀粉结合蛋白-蛋白质A(SBP-SpA)的纯化结果，其中，M：标记，S：血清，FT：流过物(Flowthrough)，W：清洗溶液，E：抽提物。
具体实施方式
为描述及主张本发明，将使用依照下列定义的术语。
如本文所使用的术语：“重组蛋白”为源自于重组DNA的蛋白质。术语“重组DNA”指一种DNA形式，其非自然存在，通过结合不会正常发生的DNA序列而创造。
如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白(starch binding protein)”将可缩写为“SBP”，且其定义为所有对于结合至淀粉具有亲和性的多肽。
如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白标签(SBP tag(s))”指淀粉结合蛋白(SBP)的亲和性标签，且术语“亲和性标签(affinity tags)”指附于蛋白质的标签致使蛋白质可由其粗生物来源，使用亲和性技术而纯化。
如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白标签化重组蛋白(SBP-taggedrecombinant protein，以下简称SBP-tagged重组蛋白)”指重组蛋白，其具有以遗传方式接合的淀粉结合蛋白胜肽序列作为亲和性标签者。
如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白结合基质(SBP-binding matrix，以下简称SBP结合基质)”指任何可与淀粉结合蛋白结合的基质。SBP结合基质的例子包含但不限于淀粉、分枝淀粉(amylopectin)、直链淀粉树脂(amylose resin)、糊精树脂(dextrin resin)及藻酸盐微粒(alginate beads)。如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白-内切蛋白酶(SBP-endoprotease，以下简称SBP-内切蛋白酶)”指任何以淀粉结合蛋白作为标签并与其结合的内切蛋白酶。内切蛋白酶(Endoprotease)为一种可以切割非末端氨基酸(即在分子内)的肽键的酵素。SBP-内切蛋白酶的例子包含但不限于：淀粉结合蛋白-急性严重呼吸道症候群蛋白酶(SBP-SARS protease，以下简称SBP-SARS蛋白酶)或淀粉结合蛋白-肠激酶(SBP-enterokinase，以下简称SBP-肠激酶)。本发明的实施于后述详细描述关于用于纯化目标蛋白的方法及系统，其使用可再利用、方便及低价的SBP-tagged重组蛋白及SBP结合基质。
在某些实施例中，提供一种纯化重组蛋白的方法，包含
(a)提供包含SBP-tagged重组蛋白的溶液；
(b)添加该溶液至第一容器，该第一容器包含SBP结合基质；
(c)抽提碱性缓冲液至步骤(b)的第一容器以获得混合物；
(d)混合该混合物与溶液，该溶液是用于在第二容器中切割SBP及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含SBP结合基质以回收重组蛋白。
在本发明的某些实施例，其中该SBP结合基质包含：淀粉、分枝淀粉、直链淀粉树脂、糊精树脂或藻酸盐微粒。
在某些实施例中，提供一种纯化重组蛋白的方法，包含步骤：
(a)提供包含来自于SBP-tagged重组蛋白的溶液；
(b)添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉基质；
(c)抽提碱性缓冲液至步骤(b)的第一容器以获得混合物；
(d)混合该混合物与溶液，该溶液是用于在第二容器中切割SBP及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉基质以回收重组蛋白。
在较佳实施例中，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器为可抛弃式。(d)的混合物进一步添加SBP-内切蛋白酶。在最佳实施例中，该SBP-内切蛋白酶为SBP-SARS蛋白酶或SBP-肠激酶。
在较佳实施例中，步骤(a)的溶液具有4至6的pH值，且步骤(c)的缓冲液具有7至11的pH值。在最佳实施例中，步骤(a)的溶液具有5至6的pH值，且步骤(c)的缓冲液具有8至9的pH值。尽管当pH值为11时，步骤(c)的缓冲液有最佳中和电荷效果(discharge effect)，过于碱性的环境可能会破坏目标蛋白。因此，推荐的缓冲液pH值范围为8至9。当pH值范围为2至4时，该缓冲液也可中和蛋白质电荷，但推荐碱性环境。
在较佳实施例中，SBP-tagged重组蛋白于SBP及目标蛋白间包含有内切蛋白酶识别位置。在某些实施例中，该(b)的溶液具有4至8的pH值以回收重组蛋白。在某些较佳实施例，推荐5至7的pH值。
在某些实施例中，该方法在步骤(e)前进一步包含中和步骤，用于调整pH值直到5至7。
本发明还提供一种用于纯化重组蛋白的系统，包含：
(a)一装置，用于提供包含SBP-tagged重组蛋白的溶液；
(b)一装置，用于添加该溶液至第一容器；
(c)一装置，用于抽提碱性缓冲液至(b)的第一容器以获得混合物；
(d)一装置，用于将该混合物与溶液混合，该溶液是用于在第二容器中切割SBP及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)一装置，用于添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含SBP结合基质以回收重组蛋白。
在本发明的某些实施例，其中该SBP结合基质包含：淀粉、分枝淀粉、直链淀粉树脂、糊精树脂或藻酸盐微粒。
在较佳实施例中，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器为可抛弃式。(d)的混合物进一步添加SBP-内切蛋白酶。在最佳实施例中，该SBP-内切蛋白酶为SBP-SARS蛋白酶或SBP-肠激酶。
在较佳实施例中，(a)的溶液具有4至6的pH值，且(c)的缓冲液具有7至11的pH值。在最佳实施例中，(a)的溶液具有5至6的pH值，且(c)的缓冲液具有8至9的pH值。
在较佳实施例中，SBP-tagged重组蛋白在SBP及目标蛋白间包含有内切蛋白酶识别位置。在某些实施例中，该(b)的溶液具有4至8的pH值以回收SBP-tagged重组蛋白。在某些较佳实施例，推荐5至7的pH值。
在某些实施例中，该系统在装置(e)前进一步包含中和装置，用于调整pH值直到5至7。此外，当SBP标签、SBP内切蛋白酶及未被切割的SBP-tagged重组蛋白在SBP结合基质被捕获时，第三容器中的反应混合物可回收无标签的重组蛋白。
在某些实施例中，提供一种具有热稳定性的重组蛋白，其以上述任一实施例的方法制备，其中该重组蛋白以SBP标签及目标蛋白而融合。在特定实施例中，该目标蛋白指脂酶、聚木糖酶或植酸酶。如此一来，蛋白质的热稳定性可轻易提升并相当广泛地扩大其应用领域。
在其它实施例中，提供一种用于制备重组蛋白的方法，该重组蛋白包含有SBP标签及蛋白质A，其中该重组蛋白通过酵母菌或细菌而表达。在某些方面，该酵母菌为毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)。在其它方面，该细菌为大肠杆菌(E.coli)。因此，本发明可适用于任何关于纯化所需蛋白的应用，例如诊断、研究或产业上利用。
实施例：下述提供的实施例用于描述但非限制本发明。
实施例1蛋白质纯化
SBP-tagged重组蛋白构建及表达
以PCR扩增SBP基因且融合至目标蛋白的N端，其于SBP及目标蛋白基因间包含有内切蛋白酶识别位置。该融合蛋白在毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)的表达载体pPICZαA中复制，其在AOX1启动子控制下并转化至毕赤巴斯德酵母GS115而表达。载有SBP-目标蛋白基因的毕赤巴斯德酵母转化物在BMGY培养基中培养24小时。该细胞以在包含0.5％甲醇的BMMY中离心及再悬浮而取得。0.5％甲醇(0.5％v/v)每24小时添加以诱导SBP-tagged重组蛋白的表达。诱导5天之后，细胞以离心方式移除且收集不含细胞的发酵液供后续纯化。后续纯化方式请参考图1及下列描述：
以第一淀粉管柱纯化SBP-tagged重组蛋白
不含细胞的发酵液使用于第一淀粉管柱。该SBP-tagged重组蛋白结合至淀粉且不纯物流出。该结合的SBP-tagged重组蛋白以pH11的甘氨酸缓冲液抽提，其后以pH7.4的Tris缓冲液透析而储存。
SBP-tagged的内切蛋白酶切割
该抽提的SBP-tagged重组蛋白与SBP-内切蛋白酶于适当缓冲液中混合。SBP标签及目标蛋白间的蛋白酶识别位置可以SBP-蛋白酶而移除SBP标签。
以第二淀粉管柱移除SBP标签残基
经SBP-内切蛋白酶处理后，该反应混合物使用于第二淀粉管柱。该不纯物包含SBP标签、SBP内切蛋白酶及未切割的SBP-tagged重组蛋白以淀粉管柱捕获。完全消化切割的天然N端的目标蛋白于流过部分(flowthrough fraction)重新获得。
实施例2热稳定性的比较
以PCR扩增SBP基因且融合至目标酵素的N端。脂酶基因来自于R.oryzae，聚木糖酶基因来自于未纯化的瘤胃真菌培养基以及植酸酶基因来自于E.coli，其均复制并与SBP融合。该SBP-脂酶、SBP-聚木糖酶及SBP-植酸酶等融合蛋白以上述方法表达并于本发明中使用。
不同来源脂酶的热稳定性
脂酶活性单位(U)定义为当样品每分钟释出1μmole的磷硝基酚(p-Nitrophenol)在0.3mM的4-硝基苯基软脂酸盐(4-Nitrophenlypalmitate)在30℃、pH值7.0的条件下。SBP-脂酶(52500U/g)及F-AP15脂酶(32430U/g，R.oryzae脂酶购买自Amano Enzyme Inc.)与含水15％或20％的发酵黄豆粉混合以达每克100U。来自不同来源的100U/g混合脂酶秤重并挑选12g至100ml血清瓶。含样品的血清瓶于此固定并以85℃或90℃高压灭菌10分钟。每一脂酶的每一情况均测试两次。经处理后测量脂酶的活性。结果显示于表1及表2。
表1含水15％发酵黄豆粉
样品名 处理温度℃ 处理时间(min) 百分比％ SBP-脂酶 25℃ 0 100％
样品名 处理温度℃ 处理时间(min) 百分比％ SBP-脂酶 85℃ 10 86.78％ SBP-脂酶 90℃ 10 86.2％ F-AP15 25℃ 0 100％ F-AP15 85℃ 10 66.82％ F-AP15 90℃ 10 37.02％
表2含水20％发酵黄豆粉
样品名 处理温度℃ 处理时间(min) 百分比％ SBP-脂酶 25℃ 0 100％ SBP-脂酶 85℃ 10 75％ SBP-脂酶 90℃ 10 58％ F-AP15 25℃ 0 100％ F-AP15 85℃ 10 19.61％ F-AP15 90℃ 10 8.56％
数据显示SBP-脂酶的热稳定性明显较F-AP15脂酶更佳。在含水15％发酵黄豆粉的情况下，加热至85℃10分钟后SBP-脂酶残存活性为86.78％，且F-AP15脂酶的残存活性为66.82％。加热至90℃10分钟后SBP-脂酶残存活性为86.2％，但F-AP15脂酶的残存活性仅37.02％。
在含水20％发酵黄豆粉的情况下，加热至85℃10分钟后SBP-脂酶残存活性为75％，且F-AP15脂酶的残存活性为19.61％。加热至90℃10分钟后SBP-脂酶残存活性仍为58％，但F-AP15脂酶的残存活性仅8.56％。
不同来源聚木糖酶的热稳定性
聚木糖酶活性单位(U)定义为当样品每分钟释出1μmole的木糖(xylose)在0.3mM的木胶(xylan)在50℃、pH值5.3的条件下。SBP-聚木糖酶(3028U/g)及聚木糖酶(304U/g，无SBP的聚木糖酶在P.pastoris中表达)与含水15％或20％的发酵黄豆粉混合以达每克100U。来自不同来源的100U/g混合脂酶秤重并挑选12g至100ml血清瓶。含样品的血清瓶于此固定并以85℃或90℃高压灭菌10分钟。经处理后测量聚木糖酶的活性。结果显示于表3及表4。
表3含水15％发酵黄豆粉
样品名 处理温度℃ 处理时间(min) 百分比％ SBP-聚木糖酶 25℃ 0 100％ SBP-聚木糖酶 85℃ 10 96.40％ SBP-聚木糖酶 90℃ 10 91.01％ 聚木糖酶 25℃ 0 100％ 聚木糖酶 85℃ 10 85.43％ 聚木糖酶 90℃ 10 79.52％
表4含水20％发酵黄豆粉
样品名 处理温度℃ 处理时间(min) 百分比％ SBP-聚木糖酶 25℃ 0 100％ SBP-聚木糖酶 85℃ 10 93.79％ SBP-聚木糖酶 90℃ 10 86.27％ 聚木糖酶 25℃ 0 100％ 聚木糖酶 85℃ 10 84％ 聚木糖酶 90℃ 10 79％
数据显示SBP-聚木糖酶的热稳定性明显较不含SBP标签者更佳。在含水15％发酵黄豆粉的情况下，加热至85℃10分钟后SBP-聚木糖酶残存活性为96.40％，且聚木糖酶的残存活性为85.43％。加热至90℃10分钟后SBP-聚木糖酶残存活性为91.01％，且聚木糖酶的残存活性为79.52％。
在含水20％发酵黄豆粉的情况下，加热至85℃10分钟后SBP-聚木糖酶残存活性为93.79％，且聚木糖酶的残存活性为84％。加热至90℃10分钟后SBP-聚木糖酶残存活性为86.27％，且聚木糖酶的残存活性为79％。
不同来源植酸酶的热稳定性
聚木糖酶活性单位(U)定义为由每分钟1.5mM植酸钠中释出1μmol无机磷(P)所需的酵素量。SBP-植酸酶(10500U/g)及植酸酶(6972U/g)与含水15％或20％的发酵黄豆粉混合以达每克100U。来自不同来源的100U/g混合脂酶秤重并挑选12g至100ml血清瓶。含样品的血清瓶于此固定并以85℃或90℃高压灭菌10分钟。每一植酸酶每一情况均测试两次。经处理后测量脂酶的活性。结果显示于表5及表6。
表5含水15％发酵黄豆粉
样品名 处理温度℃ 处理时间(min) 百分比％ SBP-植酸酶 25℃ 0 100％ SBP-植酸酶 85℃ 10 88.1％ SBP-植酸酶 90℃ 10 74.3％ 植酸酶 25℃ 0 100％ 植酸酶 85℃ 10 82.8％ 植酸酶 90℃ 10 59.5％
表6含水20％发酵黄豆粉
样品名 处理温度℃ 处理时间(min) 百分比％ SBP-植酸酶 25℃ 0 100％ SBP-植酸酶 85℃ 10 76.6％ SBP-植酸酶 90℃ 10 48.5％ 植酸酶 25℃ 0 100％ 植酸酶 85℃ 10 55％ 植酸酶 90℃ 10 28.9％
水中植酸酶产物的发展
本发明证实SBP-植酸酶可适用于水中饲料，其通过(a)吸收淀粉使水中饲料上的酵素无法移动而在当饲料加入水中时，酵素无法轻易流走，以及(b)实质增加酵素的热稳定性两种机制而适用。图2显示SBP-植酸酶及植酸酶于水中的示意图。图3显示SBP-植酸酶于水中释放实验的结果。
0.4g不同来源的植酸酶粉末加入40ml纯水并于25℃下摇晃。该溶液其后以3000rpm离心30分钟。5ml醋酸缓冲液(pH 6.0)加入沉淀物中并以超声波震动器摇晃30分钟。最后，测量植酸酶的活性。A或B公司的植酸酶于加入水中后快速流失。相比较之下，SBP-植酸酶在加入水中16小时的后仍维持至少80％的活性。
实施例3淀粉结合蛋白-增强型绿色荧光蛋白(以下简称SBP-eGFP)结合至不同类型SBP基质的结合试验。
SBP-eGFP结合至不同类型树脂的结合试验
2mg未清洗的分枝淀粉、直链淀粉树脂(购于Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，U.S.)、糊精树脂(购于GE Healthcare.，Waukesha，US)及sephadex(一种葡聚糖商品，购于Sigma.，Saint Louis，Missouri，U.S)与SBP-eGFP在结合缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)中一起搅拌，其浓度为0.3mg/mL，整体体积为200μL。在25℃搅拌并培养3小时后，将样品离心。煮沸该悬浮液(未结合蛋白)及树脂粒(结合蛋白)后用于SDS-PAGE。该结合测试的结果显示于图4A至图4C。
SBP-eGFP结合至藻酸盐微粒的结合试验
未清洗的藻酸盐微粒与SBP-eGFP在结合缓冲液(50mM NaOAc，pH5.5)中一起搅拌，其浓度为0.6mg/mL，整体体积为1mL。在25℃搅拌并培养3小时后，将样品离心。煮沸该悬浮液(未结合蛋白)及树脂粒(结合蛋白)后用于SDS-PAGE。其后藻酸盐微粒以1mL结合缓冲液清洗。接着加入1mL抽提缓冲液(10mM glycine/NaOH，pH11)并与藻酸盐微粒在25℃下搅拌30分钟。该抽提物及保留的微粒也煮沸且用于SDS-PAGE。该结合测试的结果显示于图5。
实施例4显示亲和性标签化(affinity-tagged)的纯化及“完全切割(Clean-Cut)”的去标签化(de-tagging)过程以纯化LZ8(一种来自医用真菌的免疫调节子)或eGFP。
以PCR扩增SBP基因且融合至LZ8的C端(LZ8-eks-SBP)或eGFP的N端(SBP-eks-eGFP)，两者均于SBP及目标蛋白基因间包含有肠激酶识别位置(enterokinase cleavage site，eks)。以PCR扩增SBP基因且融合至肠激酶的C端，产生的融合蛋白为EK-SBP。LZ8-eks-SBP及EK-SBP皆于毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)表达，而SBP-eks-eGFP于昆虫细胞中表达。
将带有SBP-目标蛋白(LZ-8-eks-SBP或SBP-eGFP)以第一淀粉亲和性管柱纯化后，加入有SBP-蛋白酶(EKL-SBP)，在pH5.5的50mM醋酸钠及37℃的环境下作用3小时。将此混合物加入第二淀粉亲和性管柱后，流出的即为去标签化的目标蛋白(LZ-8-eks或eGFP)，再以50mM醋酸钠(pH5.5)冲洗管柱，用10mM甘氨酸/NaOH pH11缓冲液可抽提出SBP-tagged蛋白：游离SBP、SBP-tagged蛋白酶(EKL-SBP)以及SBP-tagged的目标蛋白LZ-8-eks-SBP或是SBP-eks-eGFP。该抽提物用于SDS-PAGE其结果显示于图6(左边为LZ8的结果；右边为eGFP的结果)。
实施例5以淀粉结合蛋白-蛋白质A直链淀粉树脂(以下简称SBP-SpA直链淀粉树脂)进行免疫球蛋白纯化的结果。
为了纯化IgG，SBP-SpA，一种纯化于E.coli或Pichia的SBP及蛋白质A融合蛋白固定于CNBr-activated洋菜树脂(购于SantaCruz Biotechnology)。IgG纯化可用样品于覆有SBP-SpA树脂的管柱而完成。澄清的血清用于树脂之前，血清样品以结合缓冲液(100mM Tris+150mM NaCl，pH 8.5)稀释四倍以0.5-1ml/min的流速通过树脂，且以10倍管柱体积的结合缓冲液(100mM Tris+150mM NaCl，pH 8.5)冲洗。以50mM甘氨酸/HCl(pH 2.5)抽提。一旦IgG已抽提，就以1M Tris(pH 8.0)中和并浓缩20倍。该抽提物用于SDS-PAGE且其结果显示于图7A-7B，其中图7A显示纯化来自E.coli.的SBP-SpA的结果。图7B显示纯化来自Pichia的SBP-SpA的结果。
本发明的优点可总结如下：
1.极低的生产成本：举例来说，使用淀粉作为植酸酶(饲料酵素)的亲和性标签生产的花费小于每克1.5美元。
2.无标签目标蛋白的纯化：无标签目标蛋白的纯化可以如本文所述的SBP-内切蛋白酶去标签系统而生产。
3.高回收率：本发明揭示的系统具有相当高的回收率且该回收率大于70％，并且视情况于实验室规模可大于90％。
4.非常高的发酵效价：本发明揭示的系统具有相当高的发酵效价且该发酵效价大于10g/l，(即：Pichia表达系统)。
5.成功于许多寄主中表达蛋白质：许多蛋白质与酵素可于许多寄主中表达(例如：p.pastoris，S.cerevisae，E.col.昆虫细胞、酵母菌、动物细胞、植物细胞或类似者)。
6.现在可获得表达较差的蛋白质：表达较差的蛋白质现在可通过较大量批次加上低价淀粉树脂获得而仍维持低成本。
7.可抛弃式的蛋白质纯化及去标签化次系统：本发明提供可抛弃式的蛋白质纯化及去标签化次系统而降低可能的污染。
其它实施例
所有说明书中的特征均可以任何方式结合。每一此说明书中揭示的特征均可以使用相同、相等或类似目的的替代特征而置换。因此，除非另有说明，每一揭示的特征仅为相同或相似特征的广泛系列中的实施例。从上述描述，所属技术领域的技术人员可轻易确知本发明的必要特征，在不偏离本发明的精神与范围之下，将可达成本技术领域的技术人员将意识到可以多样化的改变及修饰而适用于各种的用法或情况。因此，其它实施例也在权利要求的范围内。
所有说明书中提及的专利及刊物表示本发明所属技术领域的技术人员程度。本文中提及的专利及刊物均以其各自全文引用，且视为每个专利或刊物均明确独立地全文引用。