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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710712079.4 (22)申请日 2017.08.18 (71)申请人 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店埔 档 (72)发明人 万春和陈翠腾黄瑜程龙飞 傅光华施少华陈红梅傅秋玲 刘荣昌 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2。
2、006.01) (54)发明名称 一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引 物及其试剂盒 (57)摘要 本发明提供一种鹅星状病毒的实时荧光定 量PCR检测引物及其试剂盒， 所述引物序列如SEQ IDNO.1-2所示， 具有很高的特异性和灵敏度。 当 前国内外尚未见可基于饱和荧光染料EvaGreen 检测一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测方法 的引物研究报道， 本发明的建立可填补国内外相 关领域空白。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 107385111 A 2017.11.24 CN 107385111 A 1.一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物， 其特征在于：。
3、 所述引物包括如下： 上游引物GoAst-F1： 5 - TCCAACCATCATAAGACA -3 ， 下游引物GoAst-R1： 5 - AGCCAGACATTACACATA -3 ， 目的片段大小为170 bp。 2.一种用于检测鹅星状病毒的实时荧光定量PCR的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包 括权利要求1所述的引物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107385111 A 2 一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒 技术领域 0001 本发明提供一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒， 属于动物 传染病学领域。 背景技术 0002 星状病毒属于星状病毒。
4、科(astroviridae)星状病毒属(astrovirus)， 根据宿主不 同分为两个属： 哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽类星状病毒属(Avastrovirus)。 禽星状病毒属现有3个属 （Avastrovirus 1-3） ， 包括鸭星状病毒(Duck astrovirus)、 鸟肾 炎病毒(Avian nephritisa strovirus)、 火鸡星状病毒(Turkey astrovirus)等， 火鸡星状 病毒其代表种。 近年来， 随着检测技术的不断优化和检测领域的扩展， 从人和动物中获得的 新毒株序列与已知的星状病毒毒株序列的进化距离较远， 发现其可能还。
5、会有更多新亚型和 基因型。 星状病毒是单股正链、 无囊膜的小RNA病毒， 其基因组长度大约6.8kb， 从5 端至3 端共包含4部分： 1个85个核苷酸的5 端非编码区、 3个开放阅读框(Open reading frames, ORFs) （包括ORF1a、 ORF1b、 ORF2） 、 1个80 个核苷酸的3 端非编码区、 1个30个核苷酸的多聚 腺苷酸尾巴。 0003 鸭星状病毒是鸭病毒性肝炎 （DHV） 的主要致病原之一， DHV是危害养鸭业的重要传 染病因其可导致雏鸭出现高死亡率， 其发生常给养鸭业造成重大经济损失。 DHV分为鸭甲肝 病毒 （DHAV） 、 鸭星状病毒1 型 （DA。
6、st V-1） 、 鸭星状病毒 2 型 （DAst V-2） 三个血清型， 三个 血清型之间均没有明显的抗原交叉保护。 近几年， 随着鸭养殖业的不断扩大与发展， 鸭病毒 性肝炎的危害也越来越多的引起人们的关注。 1965年， 在英国的Norfolk 首次报道发现 DHV-II （即现在所说的 DAst V-1） 以来， DAst V-1在各国均未被报道， 因此DAst V-1被认为 仅限于在英国流行。 2008 年， Fu等报道在我国发现DAstV-1， 并完成了第一株DAstV-1中国 分离株 （C-NGB） 的全基因组测序。 2014 年刘宁等中国南部发现了DAst V-2。 0004 但。
7、是关于鹅群中星状病毒感染情况及其类型， 之前尚未见相关研究报道。 2017年， 本研究团队从福建某鹅养殖场送检的病料中， 检测到鹅群中存在星状病毒感染 （鹅星状病 毒GsFJ2017株， GenBank登录号为MF576430） ， 该片段和禽星状病毒代表株 （火鸡星状病毒2 型） 的核苷酸同源性为69.1%， 和赤颈鸭 （Anas penelope） 星状病毒的核苷酸同源性仅为 60.6%， 为一种新发现的水禽星状病毒。 0005 实时荧光定量PCR方法 （Real time PCR） 是一种在DNA扩增反应中， 以荧光化学物 质检测每次聚合酶链式反应 （PCR） 循环后产物总量的方法。 通。
8、过内参或者外参法对待测样 品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中， 通过荧光 信号， 对PCR进程进行实时检测。 由于在PCR扩增的指数时期， 模板的Ct值和该模板的起始拷 贝数存在线性关系。 当前国内外尚未见利用Eva Green实时荧光定量PCR检测鹅星状病毒的 试剂盒相关研究报道， 本发明的建立可填补国内外相关领域空白。 发明内容 说明书 1/5 页 3 CN 107385111 A 3 0006 本发明的目的是填补现有国内外尚未见利用Eva Green实时荧光定量PCR检测鹅 星状病毒的试剂盒相关研究报道， 提供一种鹅星状病毒的Eva Gree。
9、n实时荧光定量PCR检测 引物及其试剂盒。 该方法灵敏度高、 稳定性好、 特异性强、 重复性好， 最低可检测13.8个拷 贝， 可用于对临床样本中鹅星状病毒的分子流行病学调查及其感染程度分析， 为明确鹅星 状病毒的分子流行病学特点及其致病机理提供检测方法和手段。 0007 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物， 所述引物序列如下： 上游引物GoAst-F1： 5 - TCCAACCATCATAAGACA -3 ， 下游引物GoAst-R1： 5 - AGCCAGACATTACACATA -3 ， 目的片段大小为170 bp； 一种用于检测鹅星状。
10、病毒的实时荧光定量PCR的试剂盒， 所述试剂盒包括一种鹅星状 病毒实时荧光定量PCR检测的引物 （上游引物GoAst-F1和下游引物GoAst-R1） 。 0008 一种检测鹅星状病毒的实时荧光定量PCR方法的建立： 1、 鹅星状病毒阳性标准品的构建 根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒 （鹅星状病毒GsFJ2017株， GenBank登录号为 MF576430） 聚合酶1b蛋白编码的基因 （ORF1b基因） 序列特点， 利用引物设计软件Oligo(版本 v7.37)设计特异性引物， 引物序列为： GoAst-F2： 5 - TGGACGAGGTACGACGGGAC -3 和GoAst- R2： 5。
11、 - TGACCCACTGCCGAAAATA -3 ， 用于扩增约432 bp的ORF1b基因片段， 引物由宝日医生 物技术 （北京） 有限公司合成。 0009 用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鹅星状病毒 （GsFJ2017 株） 核酸RNA， 按照PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)推荐的50 L体 系进行RT-PCR反应， 其中PrimeScript 1 Step Enzyme Mix反应液2 L、 21 Step Buffer （Dye Plus） 反应液25 L、 上下游引物 （Go。
12、Ast-F2和GoAst-R2， 10 M） 各2 L、 提取的核酸RNA 2 L， 补充灭菌去离子水至终体积50 L。 反应条件为： 50 反转录30 min后进行PCR扩增程 序； 94 预变性4 min； 94 50 s， 56 30 s， 72 45 s， 35个循环； 循环结束后72 延伸 10 min。 0010 用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定， 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特 异性目的片段进行切胶回收。 按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书 将RT-PCR扩增的特异性ORF1b基因片段克隆到pEASY-T1克隆载体上， 随机。
13、挑取8个单菌落于 氨苄青霉素 （含量为100 g/mL） 抗性的LB液体培养基培养14 h后， 利用快速质粒小提试剂 盒提取相应的质粒。 采用RT-PCR扩增时的引物 （GoAst-F2和GoAst-R2） 和条件对提取的质粒 进行PCR鉴定， 将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术 （北京） 有限公司进行测序。 将测 序结果在NCBI上进行BLAST分析验证， 符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR 的阳性标准品 （T- GoAst） ， 分装后置于-20 保存备用。 0011 鹅星状病毒实时荧光定量PCR方法的建立 按照SsoFast Eva Green 试剂盒 （BIO-RAD。
14、公司产品） 推荐的20 L反应体系配置反应 液， 其中SsoFas Eva Green Supermix为10 L， 上下游引物 （GoAst-F1和GoAst-R1） 分别为 0.2 L， 系列稀释的阳性标准品模板2 L， 补充灭菌去离子水终体积20 L。 0012 以鹅星状病毒阳性标准品 （T- GoAst） 为模板， 进行连续稀释 （质粒浓度为1.38 说明书 2/5 页 4 CN 107385111 A 4 106， 1.38105， 1.38104， 1.38103， 1.38102和1.38101拷贝/ L） ， 在不同退火温度 （54， 56， 58， 60， 62和64 ） 、。
15、 引物浓度 （2.5， 5.0， 10和20 mol/L） 下进行实时荧光定量PCR 反应， 对反应条件进行优化。 0013 优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为： 95 预变性60 s； 95 10s， 58退火10 s， 72 延伸15 s， 40个循环。 优化后的上下游引物 （GoAst-F1和GoAst- R1） 浓度为10 mol/L。 0014 用优化后的反应条件进行扩增， 获得扩增动力学曲线。 以标准品起始拷贝数的常 用对数 （lgC） 为横坐标， 以循环数阈值 （cycle threshold， Ct值） 为纵坐标， 推导出标准线性 回归方程 （标准曲线） ， 获得。
16、其敏感性试验数据。 0015 有益效果： 本发明提供的一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒， 具有以下优 点和效果： 1、 检测快速、 高效： 该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测， 反应结束后即可通 过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。 从核酸提取到结果判定仅需3h， 且一 次可以同时进行96个样品检测。 对临床收集的75份鹅源病料进行检测后发现， 检测到4份鹅 星状病毒感染阳性， 阳性率为5.33%。 0016 2、 定量准确： 通过制备标准品、 绘制标准曲线， 可根据实时荧光定量试验检测的待 检样品中的Ct值， 直接计算出待见样品 （检测结果为阳性） 的。
17、拷贝数， 可直接对其鹅星状病 毒感染程度进行准确定量。 0017 3、 灵敏度高： 最低可检测13.8个拷贝， 较常规PCR检测灵敏度提高100倍。 0018 4、 特异性强： 和鹅群中的常见传染病 （如鹅大肠杆菌病、 鹅细小病毒病、 鹅呼肠孤 病毒病和鹅多瘤病毒病） 均无反应信号， 仅对鹅星状病毒检测出现单一的特异性峰， 无引物 二聚体及非特异性产物。 0019 5、 重复性好： 建立的Eva Green实时荧光定量PCR方法进行鹅星状病毒检测的组内 变异系数为0.37-1.89%， 组间变异系数0.59-1.96%， 重复性好。 附图说明 0020 图1实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方。
18、法的扩增曲线。 1： 1.38106 拷贝/ L； 2： 1.38105 拷贝/ L； 3： 1.38104 拷贝/ L； 4： 1.38103 拷贝/ L； 5： 1.38102 拷贝/ L； 6： 1.38101 拷贝/ L。 0021 图2 实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的标准曲线。 0022 图3实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的特异性试验。 具体实施方式 0023 下面实施例对本发明做进一步的描述。 0024 实施例1 1、 相关试验病原 试验用病原鹅星状病毒、 鹅大肠杆菌、 鹅细小病毒、 鹅呼肠孤病毒和鹅多瘤病毒均由福 建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。 说明书。
19、 3/5 页 5 CN 107385111 A 5 0025 、 引物和设计 根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒 （鹅星状病毒GsFJ2017株， GenBank登录号为 MF576430） 聚合酶1b蛋白 （ORF1b基因） 编码的基因序列片段， 设计特异性的针对鹅星状病毒 的引物， 其序列如下： 上游引物GoAst-F1： 5 - TCCAACCATCATAAGACA -3 ， 下游引物GoAst-R1： 5 - AGCCAGACATTACACATA -3 ， 目的片段大小为170 bp； 并在NCBI数据库进行引物Blast分析， 验证设计引物的特异性。 0026 上述引物均在宝日医生物技术。
20、 （北京） 有限公司合成。 0027 、 鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立 3.1 鹅星状病毒阳性标准品的构建 根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒 （鹅星状病毒GsFJ2017株） 聚合酶1b蛋白编码的基 因序列特点， 利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物， 引物序列为： GoAst- F2： 5 - TGGACGAGGTACGACGGGAC -3 和GoAst-R2： 5 - TGACCCACTGCCGAAAATA -3 ， 用于扩 增约432 bp的聚合酶1b蛋白基因片段， 引物由宝日医生物技术 （北京） 有限公司合成。 0028 用病毒核酸提取试剂盒EasyP。
21、ure Viral DNA/RNA Kit提取鹅星状病毒 （GsFJ2017 株） 核酸RNA， 按照PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)推荐的50 L体 系进行RT-PCR反应， 其中PrimeScript 1 Step Enzyme Mix反应液2 L、 21 Step Buffer （Dye Plus） 反应液25 L、 上下游引物 （GoAst-F2和GoAst-R2， 10 M） 各2 L、 提取的核酸RNA 2 L， 补充灭菌去离子水至终体积50 L。 反应条件为： 50 反转录30 min后进行PCR扩增程 序； 94 。
22、预变性4 min； 94 50 s， 56 30 s， 72 45 s， 35个循环； 循环结束后72 延伸 10 min。 0029 用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定， 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特 异性目的片段进行切胶回收。 按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书 将RT-PCR扩增的特异性聚合酶1b蛋白基因片段克隆到pEASY-T1克隆载体上， 随机挑取8个 单菌落于氨苄青霉素 （含量为100 g/mL） 抗性的LB液体培养基培养14 h后， 利用快速质粒 小提试剂盒提取相应的质粒。 采用RT-PCR扩增时的引物 （GoAst-F2和。
23、GoAst-R2） 和条件对提 取的质粒进行PCR鉴定， 将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术 （北京） 有限公司进行 测序。 将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证， 符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧 光定量PCR的阳性标准品 （T- GoAst） ， 分装后置于-20 保存备用。 0030 鹅星状病毒实时荧光定量PCR方法的建立 按照SsoFast Eva Green 试剂盒 （BIO-RAD公司产品） 推荐的20 L反应体系配置反应 液， 其中SsoFas Eva Green Supermix为10 L， 上下游引物 （GoAst-F1和GoAst-R1） 分别为 0.2 L。
24、， 系列稀释的阳性标准品模板2 L， 补充灭菌去离子水终体积20 L。 0031 以鹅星状病毒阳性标准品 （T- GoAst） 为模板， 进行连续稀释 （质粒浓度为1.38 106、 1.38105、 1.38104、 1.38103、 1.38102和1.38101拷贝/ L） ， 在不同退火温度 （54、 56、 58、 60、 62和64 ） 、 引物浓度 （2.5、 5.0、 10和20 mol/L） 下进行实时荧光定量PCR 反应， 对反应条件进行优化。 0032 优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为： 95 预变性60 s； 95 说明书 4/5 页 6 CN 1073。
25、85111 A 6 10s， 58退火10 s， 72 延伸15 s， 40个循环。 优化后的上下游引物 （GoAst-F1和GoAst- R1） 浓度为10 mol/L。 0033 用优化后的反应条件进行扩增， 获得扩增动力学曲线。 以标准品起始拷贝数的常 用对数 （lgC） 为横坐标， 以循环数阈值 （cycle threshold， Ct值） 为纵坐标， 推导出标准线性 回归方程 （标准曲线） ， 获得其敏感性试验数据。 0034 从图1可以看出， 建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为13.8拷贝/ L。 以各标 准品中质粒含量 （C） 的常用对数 （lgC） 为横坐标， 以循环数阈。
26、值 （cycle threshold， Ct值） 为 纵坐标， 获得鹅星状病毒实时荧光定量PCR标准曲线 （图2） ， 所获得标准曲线斜率为-3.514， Y轴截距为37.72， 相关系数为0.999， 扩增效率为100.0%， 符合实验预期。 0035 观察溶解曲线峰值 （Tm值） 分析试验结果： 在Tm= （80.180.13） 出现单一的特异 性峰判为鹅星状病毒阳性 （图3） 。 对其他病原 （如鹅大肠杆菌、 鹅细小病毒、 鹅呼肠孤病毒和 鹅多瘤病毒） 均未见特异性溶解曲线峰值 （图3） 。 0036 3.3 重复性试验 实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.37-。
27、1.89%， 组间变异系 数0.59-1.96%， 结果见表1， 表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。 0037 表1实时荧光定量PCR变异系数 3.4 临床样品的检测 对75份临床送检鹅源病料进行鹅星状病毒感染的实时荧光定量RT-PCR检测， 用病毒核 酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的RNA， 按照建立实时荧光定量PCR体 系和条件进行检测。 结果发现， 在Tm= （80.180.13） 出现单一的特异性峰的样品有4份 （Tm值分别为80.1、 80.3、 80.3、 80.2） ， 即存在鹅星状病毒感染阳性样品4份， 阳性 率为5.33%。
28、。 0038 将相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒 对特异性目的片段进行切胶回收。 按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说 明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上， 随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素 （含量为 100 g/mL） 抗性的LB液体培养基培养14 h后， 利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。 采用实时荧光定量PCR扩增时的引物对提取的质粒进行PCR鉴定， 将筛选出的阳性重组质粒 送宝日医生物技术 （北京） 有限公司进行测序。 将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证， 均 为相应的鹅星状病毒基因片段。
29、。 0039 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 5/5 页 7 CN 107385111 A 7 SEQUENCE LISTING 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒 4 4 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 人工序列 1 tccaaccatc ataagaca 18 2 18 DNA 人工序列 2 agccagacat tacacata 18 3 20 DNA 人工序列 3 tggacgaggt acgacgggac 20 4 19 DNA 人工序列 4 tgacccactg ccgaaaata 19 序列表 1/1 页 8 CN 107385111 A 8 图1 说明书附图 1/3 页 9 CN 107385111 A 9 图2 说明书附图 2/3 页 10 CN 107385111 A 10 图3 说明书附图 3/3 页 11 CN 107385111 A 11 。