技术领域
本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及基于环介导的等温扩增寨卡病毒检测试剂盒。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，宿主不明确，主要在野生灵长类动物和栖息在树上的蚊子，如非洲伊蚊中循环。该病毒最早于1947年偶然通过黄热病监测网络在乌干达寨卡丛林的恒河猴中发现，随后于1952年在乌干达和坦桑尼亚人群中发现。该病毒活动一直比较隐匿，仅在赤道周围的非洲、美洲、亚洲和太平洋地区有寨卡病毒感染散发病例。最早一次暴发流行是2007年发生在西太平洋密克罗尼亚群岛的雅铺岛，更大的一次流行于2013年-2014年发生在大洋洲的法属波利尼西亚，感染了约32000人。伊蚊还传播黄病毒科中的另外三种病毒，包括登革热病毒、基孔肯雅病毒和黄热病毒，也主要在热带和亚热带地区流行。几十年前，非洲的研究者注意到伊蚊传播的寨卡病毒疫情莫名其妙地跟随伊蚊传播基孔肯雅病毒疫情之后。类似的规律开始于2013年，当基孔肯雅病毒从西到东传播时，寨卡病毒紧跟而来。
现有技术中，寨卡的检测方法主要包括病毒培养分离，酶联免疫检测，荧光定量PCR检测技术。
病毒培养技术用收集的样本与细胞共培养，通过观察细胞病变或其他方法检测病毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。此方法虽然是曾经的病毒感染检测“金色标准”，但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒，灵敏度不足。而且操作程序复杂，对实验场地和设备有生物安全等级要求，检测过程长(至少要一周以上)，不能用于现场检测，对不同病毒的检测结果不同。
基于抗体的酶标检测，直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测均利用抗原与抗体之间的特异结合，通过偶联了显色基团的抗体实现对病原体的可视化检测。抗体检测不依赖大型设备，而且检测结果可在30分钟以内得到。但抗 体检测由于没有信号放大的过程，灵敏性要比分子检测低，而且结果容易出现假阳性及假阴性。由于新抗体的制备周期较长，该方法很难用于新出现病毒的检测，而且对于由抗原漂变产生的新的病毒亚型的检测能力也值得怀疑。世界卫生组织(WHO)研究表明酶联免疫法很难区分寨卡病毒与登革热病毒。
病原的核酸分子检测通过聚合酶对病原的核酸分子进行扩增，然后利用荧光，电泳等方法对反应过程或产物进监测，根据反应是否进行或产物是否出现来判定病原是否出现。但基于PCR的方法都需要热循环仪等设备，对检测场地也有要求，定量PCR还需要专门训练，这些都限制了PCR相关技术在快速检测中的应用。
因此，本领域迫切需要开发快速简便有效的寨卡病毒检测方法和试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供基于环介导的等温扩增寨卡病毒检测方法以及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种检测寨卡病毒的引物集，所述引物集中包括的引物能够特异性结合于寨卡病毒的NS4B基因，并用于扩增对应于所述基因的特异性扩增产物。
在另一优选例中，所述引物集包括选自下组的一种或多种引物对：
第一引物对：
F3引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
B3引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
第二引物对：
FIP引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
BIP引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
第三引物对：
LF引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
LB引物：序列如SEQ ID NO:6所示。
在另一优选例中，所述的引物集用于寨卡病毒的环介导的等温扩增(LAMP)。
在本发明的第二方面，提供了一种PCR扩增体系，所述的体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的本发明第一方面所述的引物集。
在另一优选例中，所述的扩增体系中第一引物对、第二引物对和第三引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)：(4-6)，较佳地为1：(7-9)：(3-5)，更佳地为1:8:4。
在另一优选例中，所述的扩增包括环介导等温扩增。
在另一优选例中，所述的用于扩增的缓冲体系包含：缓冲液、扩增酶、dNTP、和RNA酶抑制剂。
在另一优选例中，所述的用于扩增的缓冲体系中还包含用于检测的染料。
在本发明的第三方面，提供了一种检测寨卡病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括(i)容器，和(ii)位于所述容器中的如本发明第一方面所述的引物集。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括：
第一容器，以及位于所述第一容器中的第一引物对；
第二容器，以及位于所述第二容器中的第二引物对；和/或
第三容器，以及位于所述第三容器中的第三引物对；
其中，所述的第一容器、第二容器、第三容器可以是各自独立的或为同一容器(包括二个或三个容器为同一容器)。
在另一优选例中，第一容器、第二容器和第三容器是同一容器；并且所述的第一、二和三引物对被混合在一起，得到一引物混合物。
在另一优选例中，所述的引物混合物中第一引物对的单个引物浓度为0.1-0.3μM，较佳地为0.2μM。
在另一优选例中，所述的引物混合物中第二引物对的单个引物浓度为1.4-1.8μM，较佳地为1.5-1.6μM。
在另一优选例中，所述的引物混合物中第三引物对的单个引物浓度为0.6-1.0μM，较佳地为0.7-0.9μM。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括用于扩增的试剂，包括扩增酶、缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂等；RNA提取试剂、和用于检测的染料。
在另一优选例中，所述的扩增酶包括Bst2.0DNA聚合酶和热启动反转录酶。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括寨卡病毒的检测标准品。
其中，所述的缓冲液包括：Thermolpol RB(Isothermal Amplification Buffer)、硫酸镁和甜菜碱(Betaine)。
在另一优选例中，所述的用于检测的染料选自下组：羟基萘酚蓝染料(Hydroxy naphthol blue，HNB)、绿色荧光核酸染料SYTO 9(SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain)、钙黄绿素染料(Calcein)、或其组合。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。
在本发明的第四方面，提供了一种基于环介导的等温扩增方法，包括步骤：
(a)利用本发明第一方面所述的引物集，对检测样品进行环介导的等温扩增。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性的方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在本发明的第五方面，提供了一种检测寨卡病毒的方法，包括步骤：
(a)利用本发明第一方面所述的引物集，对检测样品进行扩增；
(b)检测扩增情况，从而判断所述检测样品中寨卡病毒的存在与否。
在另一优选例中，所述的待测样品为核酸提取物，较佳地为RNA提取物。
在另一优选例中，在步骤(b)中，如果有特异性扩增产物产生，则说明检测样品中存在寨卡病毒；如果没有特异性扩增产物产生，则说明检测样品中不存在寨卡病毒。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的扩增为环介导等温扩增。
在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的反应温度为60-65℃，较佳地为61-63℃。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用本发明第二方面所述的扩增体系对检测样品进行环介导等温扩增，从而获得包含扩增产物的反应混合物。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的检测通过目测进行，并且步骤(a)中的环介导等温扩增时间为30min-120min，较佳地为50min-80min。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的检测通过目测进行，并且在目测前向所述反应混合物中加入HNB染料、或Calcein染料。
在另一优选例中，向所述的反应混合物中加入HNB染料，并且如果反应混合物变为天蓝色，则表明扩增阳性，检测样品中存在寨卡病毒；如果反应混合 物变为浅紫色，则表明扩增阴性，检测样品中不存在寨卡病毒。
在另一优选例中，向所述的反应混合物中加入Calcein染料，并且如果反应混合物变为绿色，则表明扩增阳性，检测样品中存在寨卡病毒；如果反应混合物变为橘黄色，则表明扩增阴性，检测样品中不存在寨卡病毒。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的检测通过实时定量PCR仪进行，并且，步骤(a)中的环介导等温扩增包括50-70个循环，较佳地为50-60个循环。
在另一优选例中，所述的循环包括步骤：
(i)60-65℃保温20-40秒，较佳地为30秒；
(ii)60-65℃采集荧光20-40秒，较佳地为30秒。
在另一优选例中，所述的环介导等温扩增在进行循环之前还包括60-65℃恒温反应1-3min，较佳地为1-2min的步骤。
在另一优选例中，所述的检测通过实时定量PCR仪进行，并且所述扩增体系中含有绿色荧光核酸染料SYTO 9。
在另一优选例中，在环介导等温扩增反应结束后，如果有扩增曲线，则表明扩增阳性，检测样品中存在寨卡病毒；如果没有扩增曲线，则表明扩增阴性，检测样品中不存在寨卡病毒。
在另一优选例中，所述的方法为寨卡病毒预检测方法。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性的方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在本发明的第六方面，提供了一种本发明第一方面所述的引物集的用途，用于制备检测寨卡病毒的试剂盒。
本发明还提供了一种鉴定寨卡病毒的方法，所述方法包括：
以待测样品的RNA为模板，以特异性扩增引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含寨卡病毒；
其中，所述的特异性扩增引物包括：
引物对1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
引物对2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
引物对3：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
在另一优选例中，所述的扩增是环介导等温扩增。
在另一优选例中，所述的环介导等温扩增条件是：
(1)62±2℃(较佳地62±1℃)恒温反应2±1min(较佳地1±1min)；
(2)①62±2℃(较佳地62±1℃)30秒，②62℃±2℃(较佳地62±1℃)30秒采集荧光；步骤①-②重复进行60±10次(较佳地55±5次)。
在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括：引物对1-3混合物，环介导等温扩增反应缓冲液，Bst2.0DNA聚合酶(Bst2.0DNA polymerase，Bst2.0)，热启动反转录酶(WarmStart RTx Reverse Transcriptase，WSRTx)，羟基萘酚蓝染料(Hydroxy naphthol blue，HNB)，绿色荧光核酸染料SYTO 9(SYTO 9Green Fluorescent Nucleic Acid Stain)，钙黄绿素染料(Calcein)，RNA酶抑制剂(Rnase inhibitor)。
其中，所述的环介导等温扩增反应缓冲液包括：dNTP，Thermolpol RB(Isothermal Amplification Buffer)，硫酸镁，甜菜碱(Betaine)。
在另一优选例中，(a)目视检测，所述的染料是羟基萘酚蓝染料(Hydroxy naphthol blue，HNB)；在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在天蓝色，则表明扩增阳性；扩增产物中存在浅紫色，则表明扩增阴性。(b)目视检测，所述的染料也可选择钙黄绿素染料(Calcein)；在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在绿色，则表明扩增阳性；扩增产物中存在橘黄色，则表明扩增阴性。(c)Real-time实时定量监测使用绿色荧光核酸染料SYTO 9作为染料；在环介导等温扩增反应结束后，有扩增曲线，则表明扩增阳性；没有扩增曲线，则表明扩增阴性。
在另一优选例中，所述鉴定寨卡病毒的方法是非疾病诊断方法。
在另一优选例中，所述的引物以混合物的形式用于扩增：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在引物混合物中终浓度均为0.2μM；
SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4在引物混合物中终浓度均为1.6μM；
SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6在引物混合物中终浓度均为0.8μM；
本发明还提供了一种用于环介导等温扩增的缓冲液，所述缓冲液包括：dNTP，Thermolpol RB(Isothermal Amplification Buffer)，硫酸镁，甜菜碱。
在另一优选例中，所述缓冲液中各试剂在反应体系的最终浓度分别为：dNTP(1.0-1.6mM)，Thermolpol RB(1X)，硫酸镁(6-10mM)，甜菜碱(0-0.8M)。
本发明还提供了一种鉴定寨卡病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括：所述试剂盒中包括(i)容器，和(ii)位于所述容器中的本发明第一方面的引物组合。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：
用于环介导等温扩增的缓冲液或独立分装dNTP、Thermolpol RB和硫酸镁；含有寨卡病毒的检测标准品；RNA提取试剂；Bst 2.0DNA聚合酶；WSRTx反转录酶；RNA酶抑制剂；
染料：目视检测使用HNB染料(最终浓度为120μM)，或者钙黄绿素染料(钙黄绿素和氯化锰按浓度比为1:100，最终浓度分别为500μM：5mM)；real-time实时监测使用SYTO 9染料(终浓度为0.4μM)。
说明鉴定寨卡病毒的方法的使用说明书。
在另一优选例中，所述试剂盒用于从待测样品中鉴定寨卡病毒。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Real-time实时定量PCR检测LAMP反应条件的正交试验结果。
图2显示了Real-time实时定量PCR检测LAMP的灵敏度。
图3显示了Real-time实时定量PCR检测LAMP的特异性。
图4显示了Zika LAMP的反应过程的目视监测结果图。其中，上排为HNB染料染色，阳性为天蓝色，阴性为紫色；中排和下排为钙黄绿素染料染色，分别显示可见光和肉眼下的结果，且钙黄绿素阳性为绿色，阴性为黄色(肉眼，可见光)，钙黄绿素阳性为亮，阴性为暗(紫外)。
图5显示了Zika LAMP的反应过程的实时监测图。
图6显示了Zika LAMP的对临床样本HNB染料的目视监测结果图。
图7显示了Zika LAMP的对模拟临床样本的实时监测图。
图8显示了Zika LAMP临床样本检测图。
图9显示了RT-QPCR(电泳)验证Zika LAMP的结果。
图10显示了不同Zika LAMP引物组合灵敏度的实时监测图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法。经过比较筛选，找到了针对Zika病毒特异性良好的引物，所述引物针对含有Zika病毒以外的核酸不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于鉴定Zika病毒成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
本发明人通过对大量Zika病毒基因组序列的分析，找到了在很多Zika病毒基因组中相对保守的序列区段，基于此进行引物的筛选，获得一类可特异性鉴定Zika病毒的引物，其对于Zika病毒的RNA发生特异性扩增，而对其它病毒的核酸不发生特异性扩增。
LAMP(Loop-mediated isothermal amplification，环介导的等温扩增)是于2000年首次报道并在其后经过不断改进形成的一种等温，连续，快速，高特异和可视化检测的核酸扩增方法。鉴于难以找到合适的、较广谱的扩增引物，以及，难以实现根据颜色变化进行结果判定，目前国内外还没有检测Zika病毒的RT-LAMP检测产品出现。
与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)，且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场、战时野外或条件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术以其快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、病原微生物鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系。
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)快速检测技术，设计三对针对目的序列的八段区域的引物，利用链置换聚合酶和扩增产物自身形成的可与引物结合的颈环结构实现目的片段的循环扩增，最终产物为一系列不同长度的目的序列的串联长链。该扩增方法的扩增效率是PCR的100倍。同时反应的副产物焦磷酸根会大量积累，可以通过焦磷酸根和反应体系内的镁离子形成的白色沉淀的量来监测反应的进行程度并可用来判定结果的阳性及阴性。
因此，本发明提供一种引物，所述的引物是LAMP扩增引物，包括：引物对1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；引物对2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 4；引物对3：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
利用本发明的引物，进行LAMP反应，可通过肉眼直接观察或者通过浊度仪检测，快速地判断待测样品是否含有Zika病毒。优选地，本发明在LAMP反应体系中运用HNB作为染料，在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在天蓝色，则表明扩增阳性；扩增产物中存在浅紫色，则表明扩增阴性，肉眼可明显观察到。优选地，本发明在LAMP反应体系中运用Calcein作为染料，在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在绿色，则表明扩增阳性；扩增产物中存在橘黄色，则表明扩增阴性，肉眼可明显观察到。优选地，Real-time实时定量监测可使用SYTO 9作为染料，在环介导等温扩增反应结束后，有扩增曲线，则表明扩增阳性；没有扩增曲线，则表明扩增阴性。
本发明还提供了一种鉴定Zika病毒的方法，所述方法包括：以待测样品的RNA为模板，以特异性扩增Zika病毒的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含Zika病毒。更优选地，基于本发明所提供的适用于鉴定Zika病毒的特异性引物，所述方法包括：以待测样品的RNA为模板，以引物对1～引物对3的混合引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含Zika病毒。
获取待测样品的RNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的RNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。
本发明还涉及一种用于鉴定Zika病毒的试剂盒，所述试剂盒中含有针对Zika病毒的LAMP扩增引物。
此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定Zika病毒的试剂，如(但不限于)：含有Zika病毒的检测标准品；用于环介导等温扩增的缓冲液；含有寨卡病毒的检测标准品；RNA提取试剂；Bs2.0聚合酶；WarmStart RTx反转录酶；HNB；Calcein和SYTO 9染料；说明鉴定寨卡病毒方法的使用说明书。
此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定Zika病毒的使用说明书和标准操作程序。
本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测Zika病毒的目的。
寨卡病毒
如本文所用，术语“Zika病毒”和“寨卡病毒”可互换使用。
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，直径20nm，是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，宿主不明确，主要在野生灵长类动物和栖息在树上的蚊子，如非洲伊蚊中循环。
寨卡病毒分为有非洲型和亚洲型2个亚型。根据被感染宿主的来源来分，又可以分为：人源的寨卡病毒，蚊源的寨卡病毒，猴源的寨卡病毒(也就是感染人的寨卡病毒，感染蚊子的寨卡病毒，感染猴子的寨卡病毒)。
寨卡病毒病的潜伏期(从接触到出现症状的时间)尚不清楚，可能为数天。寨卡病毒感染者中，只有约20％会表现轻微症状，典型的症状包括急性起病的低热、斑丘疹、关节疼痛(主要累及手、足小关节)、结膜炎，其他症状包括肌痛、头痛、眼眶痛及无力。另外少见的症状包括腹痛、恶心、呕吐、黏膜溃疡和皮肤瘙痒。症状通常较温和，持续不到一周，需要住院治疗的严重病情并不常见。2013年和2015年分别在法属波利尼西亚和巴西寨卡疫情期间，有报道称寨卡病毒病可能会造成神经和自身免疫系统并发症。
2015年巴西的寨卡暴发流行中发现了很多小头畸形的新生儿(出生的新生儿头围与匹配的相同性别和孕龄的孩子比，低于平均值超过了两个标准差)。在2015年5月-2016年1月间，共报道4000例感染寨卡病毒的孕妇分娩了小头畸形儿，与往年小头畸形的比例相比，上升了20倍。35例小头畸形新生儿的头颅CT及头颅超声提示存在弥漫性脑组织钙化，主要发生在侧脑室旁，薄壁组织旁和丘脑区域、基底节区域。皮质和皮质下萎缩造成的脑室萎缩也能见到。小部分婴儿出现关节挛缩，提示周围和中枢神经系统受累。对寨卡疫情开展调查发现，越来越多的证据表明寨卡病毒与小头症之间存有关联。然而，在解释婴儿小头症与寨卡病毒之间的关系之前仍需要做出更多调查。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示一种可特异性鉴定Zika病毒的引物，所述的引物特异性良好，对于Zika病毒能够实现特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。
(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测Zika病毒，从待测样品中快速准确地区分Zika病毒，并且所需样品量少，操作简单。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.通用材料和方法
病毒核酸提取方法
实施例中用到的Zika病毒RNA片段由中科院上海巴斯德研究所体外反转录合成。其它非Zika病毒样本中的核酸使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)RNA提取试剂盒提取，并用无RNA酶水洗脱，洗脱液可以作为反应模板使用。
LAMP反应缓冲液
取1μL 100mM MgSO4，3.5μL 10mM dNTPs，2.5μL 10×Thermolpol RB，7μL无RNA酶的水。
其中10×Thermolpol RB是NEB公司的Bst 2.0DNA聚合酶缓冲液，由200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-20组成，pH8.8(25℃)。
反应用酶
每次反应加入1μL 8U/μL的Bst2.0聚合酶，0.5μL 15U/μL的热启动反转录酶(WarmStart RTx Reverse Transcriptase)，0.5μL 40U/μL的RNA酶抑制剂(Rnase inhibitor)。
核酸染料
目视检测加入1μL 3mM的HNB(Sigma公司)或者1μL 500μM的Calcein(Sigma公司)，real-time实时定量检测使用1μL 10μM的SYTO 9(Life公司)。
寨卡病毒
除实施例6，其他实施例中所用寨卡病毒均是巴斯德所细胞体外培养的寨卡病毒。
RT-LAMP反应
RT-LAMP反应基本体系如表1。
表1 Zika RT-LAMP反应基本体系
反应步骤如下：
(a)目视检测：62℃，60min直接观察颜色变化。
染料为HNB或者Calcein。
(b)Real-time实时荧光定量检测为：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
染料为SYTO 9，采集荧光的通道设定为SYBR Green I通道。
II.实施例
实施例1
引物设计与筛选
获得GenBank所有Zika病毒的全基因组序列，进行多重序列比对以及序列分析，寻找保守区域，Zika病毒(以KU740184.1为例)序列7621bp-7813bp区段的保守性较高，适于作为引物设计区域。将上述区域从比对结果中截取出来，经重新比对后，进行引物设计。
对设计出的引物用所建立的RT-LAMP检测体系进行筛选，得到符合要求的引物，筛选得到6条引物如表2，把这6条引物按照表3所示配成A、B、C 3种不同终浓度的引物对组合。
表2 Zika病毒RT-LAMP特异性引物序列
表3 Zika病毒ABC3对引物组合
实施例2
RNA体外转录
体外转录的实施例中，Zika病毒质粒模板(pGH-new vector)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列为7621bp-7813bp区段(以KU740184.1为例)用特异性引物对Zika病毒质粒模板进行扩增，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，确定大小正确后对目的条带切胶回收，纯化的DNA产物就可作为体外转录的模板。
体外转录使用Promega的“RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7”试剂盒，反应过程采用试剂制造商提供的方法。体外转录RNA产物使用Nanodrop进行浓度和纯度测量，将单位换算成copies/μL(拷贝/μL)。为避免RNA反复冻融，取适量稀释至1×1010copies/μL进行分装，并置-80℃保存。
实施例3
体系建立及优化
以Zika病毒RNA片段为模板，以表1中的体系为基础体系，通过优化反应体系中Tween(0％，10％，30％)，dNTP(1.0，1.4，1.6mM)，甜菜碱(0，0.4，0.8M)和镁离子(6，8，10mM)的最终浓度，四个因素设置三个水平记性正交试验，设计了9个条件组合如表4。Real-time荧光定量检测体系使用SYTO 9作为染料，采集荧光的通道设定为SYBR Green I。
反应方法与步骤如下：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
采集荧光的通道设定为SYBR Green I，使用SYTO 9染料。
表4 Zika病毒体系优化条件组合
体系中不同反应条件对LAMP扩增的real-time荧光定量检测结果如图1所示，对反应过程中的荧光扩增曲线变化过程进行分析，反应进行速度最快，Cycle Time值(CT值)最小的条件组合作为最优组合。
实施例4
灵敏度和特异性评估
使用无RNase的H2O分别对Zika病毒体外转录得到的RNA模板进行梯度稀释，得到浓度依次为1×106copies/μL，1×105copies/μL，1×104copies/μL，1×103copies/μL，1×102copies/μL，1×101copies/μL和1×100copi es/μL的RNA模板，使用实施例3中的最佳体系进行检测。检测反应步骤如下：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
采集荧光的通道设定为SYBR Green I，使用SYTO 9染料。
灵敏度结果如图2所示，出现的“对数曲线”表示Zika病毒在该浓度下有扩增。其中：扩增曲线从左至右依次为1×106copies/μL，1×105copies/μL，1×104copies/μL，1×103copies/μL，1×102copies/μL和1×101copies/μL。
浓度为1×100copies/μL的RNA模板和阴性对照没有扩增曲线，表明LAMP体系的最低可检测到1×101copies/μL，由于上样量为5μL，所以本方法的最低检测线为5×102copies/μL。
实施例中用到的Zika病毒RNA片段由中科院上海巴斯德研究所体外反转录合成。其它阴性对照的病毒标准株包括：登革热病毒的4个亚型(Dengue-1，Dengue-2，Dengue-3，Dengue-4)以及常见的几种呼吸道病毒RSV A(VR-26)，RSVB(VR-1580)，Influenza A(VR-99)，Influenza B(VR-789)，PIV-3(VR-93)，Adenovirus(VR-930)，Rhinovirus(VR-1162)，HCoV-229E(VR-740)和HCoV-OC43(VR-1558)(以上病毒株均由上海巴斯德研究所提供，购自ATCC公司)。
使用实施例3中的最佳体系和实施例1中的步骤(b)方法对上述病毒进行检测，结果如图3和表5所示，实验结果表明，LAMP体系设计的Zika病毒引物组具有很高的特异性。
结果可见，设计的Zika病毒LAMP引物组的特异性良好，对于非Zika病毒检测阴性。
表5 Zika LAMP的特异性结果
实施例5
反应过程的目视及实时监测
分别以5μL浓度为1×106copies/μL，1×105copies/μL，1×104copies/μL，1×103copies/μL，1×102copies/μL，1×101copies/μL，1×100copies/μL Zika病毒RNA和水(阴性对照)作为模板，用下述反应体系 分别在PCR仪及荧光定量PCR仪上反应确定引物组的有效性。
使用实施例3中的最佳体系，目视及实时监测反应的检测方法如下：
(1)目视检测反应步骤如下：
目视检测为62℃恒温反应60分钟，然后目测和扫描拍照。使用HNB染料和Calcein染料；
(2)荧光定量实时检测反应步骤如下：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
采集荧光的通道设定为SYBR Green I，使用SYTO 9染料。
目视检测结果和荧光定量实时检测结果如图4，图5所示，可见3种方法在LAMP反应60分钟后结果是一致的：浓度为1×105copies/μL，1×104copies/μL，1×103copies/μL，1×102copies/μL，1×101copies/μL的Zika病毒RNA为阳性；而浓度1×100copies/μL Zika病毒RNA和水(阴性对照)结果为阴性。可见，LAMP体系的检测结果稳定，方法重复性好，准确率很高。
实施例6
对临床样本的检测
由于国内的Zika病毒临床样本很有限，故采用人工基因合成的方式合成Zika病毒的7621bp-7813bp区段(以KU740184.1为例)，并反转录成RNA片段，作为Zika病毒的阳性样本。从上海市南翔医院收集16份感冒儿童的呼吸道的鼻拭子样本。将2μL浓度为1×108copies/μL人工合成的Zika病毒RNA片段加到2mL份鼻拭子样本中，16份样品中只有7份添加Zika病毒RNA片段，其余9份添加的是水，混匀用于核酸提取。用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)RNA提取试剂盒提取样本浸出液中的病毒RNA，并用无RNA酶水洗脱。洗脱液可以作为反应模板使用。
结果如图6和图7所示，目视检测结果(HNB染料)和荧光定量实时检测(SYTO9染料)2种方法一致：16份鼻拭子样本中有7份为Zika病毒阳性，9份为Zika病毒阴性。结果表明，本发明的LAMP体系和方法的准确率高，检测效果好。
以1名感染Zika病毒病人的尿液作为Zika病毒的阳性样本。以2名未感染Zika病毒的人的尿液作为Zika病毒的阴性样本。分别取上述3种尿液140μL 用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)RNA提取试剂盒提取样本浸出液中的病毒RNA，并用无RNA酶水洗脱。洗脱液作为反应模板使用，同时也采用RT-QPCR(加电泳)方法来验证Zika LAMP的检测结果。
LAMP结果如图8所示，Zika病毒病人的尿液中有Zika病毒扩增，而其它2个Zika病毒阴性样本没有扩增。如图9所示，Zika LAMP结果与RT-QPCR(电泳)结果一致。以上结果表明本发明的Zika LAMP体系和方法的灵敏性高，准确率高，检测效果好。
对比例
在获得本申请的引物组合之前，申请人进行了大量的针对寨卡病毒的引物筛选工作。以其中的一组引物为例，进行说明。
采用与实施例1类似的方法，设计了针对寨卡病毒NS5基因9731bp-9923bp区段(以KU740184.1为例)的LAMP扩增引物组合(a)，具体引物表6所示：
表6 Zika病毒RT-LAMP引物序列(对比例)
分别以表6所示的引物组合与实施例1表2所示的引物组合(本申请的引物组合)，检测1×103copies/μL的人源的寨卡病毒，每组进行3个重复。
结果如图10所示，以表2所示的引物组合进行检测，灵敏度显著优于以表6所示引物进行检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。