多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410490078.6 (22)申请日 2014.09.23 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104293730 A (43)申请公布日 2015.01.21 (73)专利权人 云南中科灵长类生物医学重点实 验室 地址 650500 云南省昆明市呈贡新城雨花 片区博大路1号 (72)发明人 李天晴蒋斌季维智 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) (56。

2、)对比文件 CN 103627671 A,2014.03.12, CN 102762718 A,2012.10.31, CN 103228782 A,2013.07.31, 审查员 李宁 (54)发明名称 多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方 法 (57)摘要 本发明提供一种在三维悬浮条件下将多能 干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法， 并提供 用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细胞分 化的培养基。 所述培养基包括用于将多能干细胞 诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基， 用于 将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养 基以及心肌细胞的长期维持培养基。 本发明方法 简单可靠， 价格低廉， 稳定高效。

3、， 安全性高， 由于 采用了悬浮培养系统， 可以工业化生产高品质的 心肌细胞， 无需任何后续的筛选和纯化步骤， 可 以直接用于心脏发育科学研究， 心脏疾病的细胞 治疗， 心脏损伤的移植以及药物筛选的应用需 求， 具有不可估量的科学和社会经济效益。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 104293730 B 2017.07.28 CN 104293730 B 1.用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细胞分化的培养基， 其特征在于， 所述培养 基包括用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基， 用于将中胚层前体细 胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持培养基； 所述用于。

4、将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基包括： 基础培养液为 DMEM/F12与IMDM的混合培养基、 KOSR、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA、 CHIR99021和BIO； 所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基包括： 基础培养液为DMEM/ F12与IMDM的混合培养基、 KOSR、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA、 IWP-2、 XAV939和抗坏血酸； 所述心肌细胞的长期维持培养基包括： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、 KOSR、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA和抗坏血酸； 在所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培。

5、养基中， DMEM/F12混合 IMDM的体积比为1:1-1:3； 所述KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.1-2； 所述 -巯 基乙醇的浓度为0.1-1； 所述谷氨酰胺的浓度为10-200mM； 所述CHIR99021的浓度为1-20 M； 所述BIO的浓度为1-20 M； 在所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基中， DMEM/F12混合IMDM的 体积比为1:3-1:5； 所述KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.1-2； 所述 -巯基乙醇 的浓度为0.1-1； 所述谷氨酰胺的浓度为10-200mM； 所述IWP-2的浓度为2-30 M； 所述 。

6、XAV939的浓度为1-20 M； 所述抗坏血酸的浓度为5-500 g/L； 在所述心肌细胞的长期维持培养基中， DMEM/F12混合IMDM的体积比为1:3-1:6； 所述 KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.1-2； 所述 -巯基乙醇的浓度为0.1-1； 所述 谷氨酰胺的浓度为10-200mM； 所述抗坏血酸的浓度为5-500 g/L。 2.在三维悬浮条件下将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： 1)将贴壁生长的多能干细胞消化下来， 通过直径为20-70 m的细胞筛切割成大小均一 的细胞团块； 2)切割得到的细胞团块放入细胞培养箱中进行三。

7、维悬浮培养， 在干细胞培养基中培养 4-5天获得直径为250-300 m的多能干细胞球； 3)将步骤2)的多能干细胞球除去干细胞培养基， 在三维悬浮的条件下， 添加权利要求1 所述的用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基进行分化培养， 记为D0 天； 在分化培养的D2天， 将培养基替换成权利要求1所述的用于将中胚层前体细胞分化为心 肌细胞的分化培养基继续进行分化培养； 在分化培养的D12天， 将培养基替换成权利要求1 所述的心肌细胞的长期维持培养基进行培养； 所述多能干细胞为非人灵长类动物胚胎干细胞、 人或非人灵长类动物诱导多能性干细 胞。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征。

8、在于， 所述干细胞培养基的配方为： DMEM/F12添 加KOSR、 NEAA、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺和bFGF； 所述KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为 0.1-2； 所述 -巯基乙醇的浓度为0.1-1， 所述谷氨酰胺的浓度为2-5mM， 所述bFGF的浓 度为5-10ng/ml。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104293730 B 2 多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞生物学领域， 具体地说， 涉及在三维悬浮条件下将多能干细胞体 外定向分化为心肌细胞的方法。 背景技术 0002 心脏疾病是威胁人类健康的常见疾病， 尤其是冠心病等。

9、造成的心肌缺血导致的心 肌梗死病例， 每年在美国有150万， 在中国有200万。 发生心肌梗死后， 心室的局部心肌细胞 会发生坏死， 引起局部结疤而得不到修复， 引发心脏心律不全， 泵血不足， 轻者影响病人的 生产和生活， 重者引起休克或死亡， 严重威胁人类健康和社会稳定。 但目前没有很好的治疗 方法。 干细胞具有长期自我更新以及分化为体内任何细胞的能力， 因此使用干细胞分化来 的心肌细胞进行替代治疗， 为彻底治疗心肌梗死提供了可能。 有研究表明， 将人类胚胎干细 胞定向分化成为心肌细胞， 通过注射进入患有心肌梗死的猴子心脏中可以长期存活， 形成 和猴子原有心肌细胞的细胞连接， 产生具有跟猴子。

10、心脏一致的心电活动与钙传导信号， 明 显改善其心脏功能， 具有显著的治疗效果。 0003 安全、 均质、 规模化产生足够量的功能心肌细胞是其应用的前提和关键。 另外， 心 肌药物的筛选同样也需要大量具有功能的心肌细胞。 虽然， 目前有很多方法可以将干细胞 定向分化为心肌细胞， 但是心肌细胞的分化效率低， 价格高昂， 细胞系之间的差异很大， 不 利于规模化生产和应用。 目前将干细胞定向分化为心肌细胞的方法主要包括两种： 1)拟胚 体(Embryoid bodies,EBs)诱导分化法； 2)贴壁诱导分化法。 前者是将干细胞消化下来， 悬 浮培养4-5天形成拟胚体， 然后用生长因子和药物诱导后， 。

11、贴附在培养皿底分化为心肌细 胞。 但仅20-50EBs能自发搏动， 并且这种方法只能使EBs中50-75的细胞分化成具有功 能的心肌细胞， 另外分化的细胞中含有内、 中、 外三个胚层的非心肌细胞， 所以在用于药物 筛选和移植前， 需要对分化的心肌细胞经过复杂的分选纯化。 贴壁分化法是将干细胞以高 密度的方式培养在培养皿中， 用昂贵的细胞生长因子和小分子组合的培养基进行诱导。 贴 壁培养方法采用的是平面2D的培养方式， 干细胞以单层生长的方式诱导分化， 生产能力受 到极大的限制， 不利于实用化和工业化生产。 另外， 这些方法一方面需要特殊的基质如 martrigel、 laminin等； 另一方。

12、面需要各种昂贵的蛋白生长因子例如ActivinA、 BMP4、 bFGF 等。 这些基质和生长因子具有明显的缺陷： 成分不明、 价格昂贵、 不同批次之间存在巨大差 异； 部分是动物源性的， 导致安全性低等。 0004 因此， 开发出一种完全是由小分子物质组成的成分限定、 高效以及廉价的心肌分 化培养基， 并利用此培养基， 建立一种三维悬浮条件下诱导多能干细胞定向分化为心肌细 胞的方法， 是本领域亟待解决的一个技术问题。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种在三维(3D)悬浮培养环境中， 将多能干细胞体外定向分 化为心肌细胞的方法。 说明书 1/6 页 3 CN 104293730 B 3。

13、 0006 为了实现本发明目的， 本发明首先提供用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细 胞分化的培养基， 包括用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基， 用于 将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持培养基。 0007 其中， 所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基包括： 基 础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、 KOSR(血清替代品)、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA(非必需氨基酸)、 CHIR99021(Wnt信号通路的激动剂)和BIO(Wnt信号通路的激动剂)。 0008 所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培。

14、养基包括： 基础培养液为 DMEM/F12与IMDM的混合培养基、 KOSR、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA、 (Wnt信号通路的抑制 剂)、 XAV939(Wnt信号通路的抑制剂)和抗坏血酸。 0009 所述心肌细胞的长期维持培养基包括： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养 基、 KOSR、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA和抗坏血酸。 0010 本发明提供的诱导心肌分化的培养基， 包括中胚层分化培养基、 心肌分化培养基 和心肌细胞长期维持培养基， 分化培养基中含有多种可供多能干细胞分化为心肌细胞所需 的营养成分。 其中， CHIR99021和BIO小分子作为Wnt信号。

15、激活剂， 可以抑制多能干细胞自我 更新， 促进其往中胚层谱系细胞的分化； IWP-2和XAV939小分子作为Wnt信号通路的抑制剂， 促进中胚层前体细胞往心肌前体和心肌细胞分化； 抗坏血酸可以抑制细胞分化过程中细胞 的死亡， 并且具有促进心肌细胞分化的功能。 0011 优选地， 在所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基中， DMEM/F12混合IMDM的体积比为1:1-1:3； 所述KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.1- 2； 所述 -巯基乙醇的浓度为0.1-1； 所述谷氨酰胺的浓度为10-200mM； 所述CHIR99021 的浓度为1-20 M； 所述B。

16、IO的浓度为1-20 M。 0012 优选地， 在所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基中， DMEM/ F12混合IMDM的体积比为1:3-1:5； 所述KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.1-2； 所述 -巯基乙醇的浓度为0.1-1； 所述谷氨酰胺的浓度为10-200mM； 所述IWP-2的浓度为 2-30 M； 所述XAV939的浓度为1-20 M； 所述抗坏血酸的浓度为5-500 g/L。 0013 优选地， 在所述心肌细胞的长期维持培养基中， DMEM/F12混合IMDM的体积比为1: 3-1:6； 所述KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.。

17、1-2； 所述 -巯基乙醇的浓度为 0.1-1； 所述谷氨酰胺的浓度为10-200mM； 所述抗坏血酸的浓度为5-500 g/L。 0014 本发明还提供在三维悬浮条件下将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法， 包括以下步骤： 0015 1)将贴壁生长的多能干细胞消化下来， 通过直径为20-70 m的细胞筛切割成大小 均一的细胞团块； 0016 2)切割得到的细胞团块放入细胞培养箱中进行三维悬浮培养， 在干细胞培养基中 培养4-5天获得直径为250-300 m的多能干细胞球； 0017 3)将步骤2)的多能干细胞球除去干细胞培养基， 在三维悬浮的条件下， 添加上述 用于将多能干细胞诱导分化为。

18、中胚层前体细胞的分化培养基进行分化培养， 记为D0天， 以 后在此时间的分化培养下， 不同天数分别表示为D1、 D2、 D3等； 在分化培养的D2天， 将培养基 替换成上述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基继续进行分化培养； 在分 化培养的D12天， 将培养基替换成上述心肌细胞的长期维持培养基进行培养。 说明书 2/6 页 4 CN 104293730 B 4 0018 在本发明所述的心肌分化过程中， 对人的干细胞在D6-D8天开始出现明显的心肌 跳动球； 对非人灵长类动物的干细胞在D4-D6天开始出现明显的心肌跳动球。 0019 优选地， 利用所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层。

19、前体细胞的分化培养基能 产生80-100纯度的中胚层前体细胞。 0020 优选地， 利用所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基能产生 80-100纯度的心肌前体细胞。 0021 优选地， 利用所述心肌细胞的长期维持培养基能产生80-100纯度的心肌细胞。 0022 本发明中涉及的多能干细胞包括人和非人灵长类动物胚胎干细胞(embryonic stem cell)以及诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell)。 0023 前述方法中， 所述干细胞培养基的配方为： DMEM/F12添加KOSR、 NEAA、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺和bFGF； 所述K。

20、OSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.1-2； 所述 -巯基乙醇 的浓度为0.1-1， 所述谷氨酰胺的浓度为2-5mM， 所述bFGF的浓度为5-10ng/ml。 本发明还 提供利用上述方法获得的分化的中胚层前体细胞系、 心肌前体细胞系和心肌细胞系。 0024 本发明进一步提供上述细胞系在细胞替代治疗， 心脏疾病致病机制研究及药物筛 选中的应用。 0025 采用本发明方法可以在12天内将多能干细胞在3D悬浮培养系统中高效的分化为 心肌细胞， 分化效率达到95以上， 分化的心肌细胞95以上表达CTnT、 a-Actinin等心肌 细胞特有的标记物。 经过透射电镜分析， 分化的心肌细胞。

21、具有跟体内心脏一致的微观组织 结构如丰富的肌丝， 清晰的肌节， 大量的线粒体， 丰富的细胞间连接， 如闰盘等。 采用本发明 方法可以在一个心肌球中检测到窦性电信号， 心房电信号和心室电信号三种具有跟体内心 脏相似的生理电信号。 另外， 采用本发明方法获得的心肌细胞可以对现有的心脏病药物产 生相似的反应， 通过钙波分析， 添加加速心率的药物咖啡因可加速本发明方法所产生心肌 球的钙波频率， 添加心得安等降低心率的药物可以明显的减低心肌球的钙波频率， 这些证 据充分表明本发明所生产的心肌细胞是具有与体内心肌细胞一致的有功能的细胞。 此外， 本发明方法无需昂贵且成分不明的生物产物如Matrigel、 。

22、laminin等作为基质， 整个分化过 程都是在悬浮培养系统中培养诱导分化， 所用的诱导分化剂均为价格低廉的化学小分子。 本发明方法简单可靠， 价格低廉， 稳定高效， 安全性高， 由于采用了悬浮培养系统， 可以工业 化生产高品质的心肌细胞， 无需任何后续的筛选和纯化步骤， 可以直接用于心脏发育科学 研究， 心脏疾病的细胞治疗， 心脏损伤的移植以及药物筛选的应用需求， 具有不可估量的科 学和社会经济效益。 附图说明 0026 图1为本发明实施例二中利用人和非人灵长类动物的胚胎干细胞制备大小均一的 多能干细胞小球的示意图。 0027 图2为本发明实施例二中多能干细胞小球在三维悬浮培养条件下定向分化。

23、为自主 搏动心肌球的示意图。 0028 图3为本发明实施例二中分化的心肌细胞以及心肌球用药物筛选的示意图。 具体实施方式 说明书 3/6 页 5 CN 104293730 B 5 0029 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0030 以下实施例中使用的干细胞培养基的配方为DMEM/F12添加KOSR， NEAA， -巯基乙 醇， 谷氨酰胺， bFGF； 所述KOSR的浓度为2-20； 所述NEAA的浓度为0.1-2； 所述 -巯基 乙醇的浓度为0.1-1， 所述谷氨酰胺的浓。

24、度为2-5mM， 所述bFGF为5-10ng/ml。 0031 实施例一用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细胞分化的培养基 0032 本实施例中提供的用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细胞分化的培养基包 括： 用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基， 用于将中胚层前体细胞 分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持培养基。 0033 所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基包括： 基础培养 液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、 KOSR(血清替代品)、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA(非必 需氨基酸)、 CHIR99021(Wnt信号通路的激动剂。

25、)和BIO(Wnt信号通路的激动剂)。 0034 所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基包括： 基础培养液为 DMEM/F12与IMDM的混合培养基、 KOSR、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA、 (Wnt信号通路的抑制 剂)、 XAV939(Wnt信号通路的抑制剂)和抗坏血酸。 0035 所述心肌细胞的长期维持培养基包括： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养 基、 KOSR、 -巯基乙醇、 谷氨酰胺、 NEAA和抗坏血酸。 0036 以下为本实施例的用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基， 用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞。

26、的长期维持培养基的 具体实例。 0037 用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基： 0038 实例1： DMEM/F12与IMDM按1:2体积比混合、 5KOSR、 1NEAA、 0.025 -巯基乙 醇、 100mM谷氨酰胺、 5 M CHIR99021和5 M BIO。 0039 实例2： DMEM/F12与IMDM按1:1体积比混合、 10KOSR、 1NEAA、 0.025 -巯基乙 醇、 50mM谷氨酰胺、 10 M CHIR99021和10 M BIO。 0040 实例3： DMEM/F12与IMDM按1:3体积比混合、 10KOSR、 1NEAA、 0.025 -巯。

27、基乙 醇、 50mM谷氨酰胺、 3 M CHIR99021和3 MBIO。 0041 用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基： 0042 实例1： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM按1:3体积比混合、 5KOSR、 0.025 -巯基 乙醇、 100mM谷氨酰胺、 1NEAA、 10 MIWP-2、 5 MXAV939(Wnt信号通路的抑制剂)和50 g/L抗 坏血酸。 0043 实例2： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM按1:2体积比混合、 10KOSR、 0.025 -巯 基乙醇、 50mM谷氨酰胺、 1NEAA、 5 M IWP-2、 2 M XAV939(Wnt信号。

28、通路的抑制剂)和25 g/L 抗坏血酸。 0044 实例3： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM按1:4体积比混合、 10KOSR、 0.025 -巯 基乙醇、 100mM谷氨酰胺、 1NEAA、 20 MIWP-2、 10 M XAV939(Wnt信号通路的抑制剂)和100 g/L抗坏血酸。 0045 心肌细胞的长期维持培养基： 0046 实例1： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM按1:4体积比混合、 5KOSR、 0.025 -巯基 说明书 4/6 页 6 CN 104293730 B 6 乙醇、 100mM谷氨酰胺、 1NEAA和50 g/L抗坏血酸。 0047 实例2： 基础。

29、培养液为DMEM/F12与IMDM按1:2体积比混合、 10KOSR、 0.025 -巯 基乙醇、 50mM谷氨酰胺、 1NEAA和25 g/L抗坏血酸。 0048 实例3： 基础培养液为DMEM/F12与IMDM按1:6体积比混合、 10KOSR、 0.025 -巯 基乙醇、 100mM谷氨酰胺、 1NEAA和100 g/L抗坏血酸。 0049 实施例二在三维悬浮条件下将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法 0050 利用实施例一中实例1对应的用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分 化培养基， 用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持 培养基， 建立三维悬。

30、浮条件下将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法。 包括以下步 骤： 0051 1、 利用人和非人灵长类动物的多能干细胞制备大小均一的多能干细胞小球。 具体 地， 在该步骤中， 二维条件下的多能干细胞用于实验， 所述多能干细胞涉及饲养层共培养和 无饲养层培养的多能干细胞， 除去干细胞培养基， 1PBS清洗2遍； 添加1mg/ml的dispase2- 4ml覆盖多能干细胞， 37条件下孵育4-8mins； 待干细胞克隆边缘卷起时， 除去dispase， 1 PBS清洗2遍； 添加3ml干细胞培养基， 将干细胞克隆轻轻吹洗下来； 将干细胞克隆收集起 来， 添加3ml干细胞培养基和10 M Y-27。

31、632混匀； 将重悬的干细胞通过50 m网径的细胞筛； 将干细胞悬液铺在Petri皿中， 在37， 5CO2培养箱中培养过夜； 4-5天后可以收获大小均 质的多能干细胞小球(图1)。 0052 图1示出了多能干细胞三维悬浮培养产生大小均质的多能干细胞球的过程。 其中， (A-B)用于切割多能干细胞的细胞筛； (C)经过细胞筛切割后的多能干细胞小团快； (D)为切 割后的多能干细胞在三维悬浮条件下， 形成多能干细胞球的方法示意图； (E-G)多能干细胞 团块在三维悬浮培养过程中， 不同天数产生的多能干细胞球； (H-I)为一个具有代表性的多 能干细胞球在五天之内， 干细胞球大小和细胞数量的增值情。

32、况； (J)三维悬浮长期培养的多 能干细胞仍然保持了稳定的核型； (K-O)三维悬浮培养的多能干细胞仍然保持干细胞的多 能性， 表达干细胞的标志蛋白， 如Oct4、 SSEA-4、 TRA-1-60和TRA-1-80， 但不表达分化细胞的 标志蛋白SSEA-1和Nestin； (P-Q)三维悬浮培养的多能干细胞注射到免疫缺陷的小鼠里能 够分化产生三种不同胚层的细胞， 显示分化的多能性。 0053 2、 将多能干细胞小球在悬浮培养条件下定向分化为自主搏动的心肌球。 具体地， 在该步骤中， 将多能干细胞小球收集到离心管里面， 离心， 速度600rpm， 时间3min； 除去干细 胞培养基， 添加中。

33、胚层前体细胞分化培养基， 重新悬浮细胞， 该时间段记为D0天； 细胞培养 在Petri皿以及在37， 5CO2培养箱中； 在D2天， 将中胚层前体细胞分化培养基完全换成 心肌分化培养基， 每1-2天换液一次； 在D6天可见自主搏动的心肌球； 从D12天， 将心肌分化 培养基换成心肌细胞长期维持培养基， 每1-2天换液一次(图2)。 0054 图2示出了三维悬浮产生的多能干细胞球分化为心肌细胞球的过程。 其中， (A)为 整个分化过程的示意图； (B-D)为多能干细胞球在中胚层前体细胞分化培养基中作用两天 后， 分化为中胚层前体细胞， 99.6的细胞表达Brachyury； (E-G)为分化的中。

34、胚层前体细胞 在心肌分化培养基作用两天后， 分化为心肌前体细胞， 99.3的细胞表达NKX2.5； (H-M)为 分化的心肌前体细胞在心肌分化培养基继续作用12-14天后， 分化为成熟的心肌细胞， 95.7的细胞表达 -actinin和cTnT； (N)为分化过程中， 不同天数产生自发跳动的心肌球 说明书 5/6 页 7 CN 104293730 B 7 占整个干细胞球的比率； (O)分化的心肌球， 被消化为单个心肌细胞， 重新进行单层培养， 进 行染色显示， 分化的心肌细胞具有多核以及表达丰富的肌节， 显示心肌细胞的成熟。 0055 3、 通过荧光染色鉴定多能干细胞小球的多能性及其心肌分化标。

35、记物。 在该步骤 中， 将多能干细胞小球及其后续分化的细胞采用4PFA(多聚甲醛)固定； 使用OCT包埋， 进 行冰冻切片， 切片厚度10 m； 使用1PBS浸泡切片10min， 去除包埋剂OCT； 1PBS浸泡切片， 5min； 0.2TritonX100透膜10min； 5血清封闭2h； 添加一抗4过夜， 抗体比例为SSEA41: 400， Brachyury 1:300， Nkx2.51:300， CTnT 1:400， a-Actinin 1:400； 1PBS， 3min， 4遍添 加二抗， 常温1小时， 抗体比例均为1:1000； 1PBS， 3min， 4遍； 添加DAPI染色，。

36、 5min； 1PBS， 3min， 2遍， 封片， 镜检。 0056 4、 分化的心肌细胞表现心肌细胞的功能， 显示出对心脏药物的反应潜力。 具体地， 在该步骤中， 分化的心肌球放在心肌细胞功能检测仪上， 检测其动作电位； 对于钙波的检 测， 将Furo 4的荧光钙指示剂与培养基1： 1混合作用20分钟后， 利用Leica共聚交显微镜进 行连续的快扫， 拍摄出连续的钙波； 在此基础上将咖啡因和propranolol按照一定浓度加入 心肌细胞长期维持液中， 检测心肌细胞的钙波， 测试这两种药物对心肌球的作用， 建立药物 筛选平台(图3)。 0057 图3示出了利用三维悬浮分化的心肌球进行药物筛。

37、选的过程。 其中， (A)为分化的 心肌球表现出心肌细胞三种典型动作电位， 分别为心房的、 心室的以及窦房节的； (B-C)分 化的心肌球具有典型的心肌钙波； (D-E)咖啡因显著地促进心肌细胞的收缩， 而 propranolol则显著地抑制心肌细胞的收缩。 这些结果显示， 分化的心肌球可以作为一个药 物筛选的细胞模型。 0058 此外， 通过本实施例的方法建立的中胚层前体细胞、 心肌前体细胞、 心肌细胞以及 利用该三类细胞培养产生的细胞系； 以及这三类细胞培养产生的细胞系在细胞替代治疗、 心脏疾病致病机制以及药物筛选中的应用也属于本发明的保护范围。 0059 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 6/6 页 8 CN 104293730 B 8 图1 说明书附图 1/3 页 9 CN 104293730 B 9 图2 说明书附图 2/3 页 10 CN 104293730 B 10 图3 说明书附图 3/3 页 11 CN 104293730 B 11 。