技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一株地衣芽孢杆菌、含有该菌的菌剂及其应用、降解呕吐毒素的方法和试剂盒。
背景技术
呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，化学名称为3α,7α,15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，由于它可以引起猪的呕吐而得名，主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)感染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物产生的单端孢霉烯族毒素。在全世界范围内，呕吐毒素是粮食、饲料、食品的主要污染霉菌毒素之一，严重影响人和牲畜的健康。人畜摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，其严重危害性已经引起了各国的普遍重视。
呕吐毒素对我国谷物类原料的污染相当普遍，其检出率和检出量都是霉菌毒素中最高的一种，据甄阳光等人调查显示，中国饲料和原料呕吐毒素的超标比例接近70％，玉米中呕吐毒素的超标率为57.1％，毒素平均含量为1.01mg/kg，最高含量为2.13mg/kg。由于呕吐毒素在谷物、饲料中的普遍存在性、高含量特性和急慢性毒性，降低或者去除其毒性显得尤为重要与迫切。目前，国内外呕吐毒素脱毒方法主要有物理法、化学处理和生物方法三大类。虽然物理、化学方法脱毒已经取得一定程度的成功，但仍然存在脱毒效果有限、可能造成重要营养物质的丢失、成本较高等缺点，从而限制了这两种方法在实际生产中的应用。
生物法主要是利用微生物或其降解产物进行毒素降解的过程，具有可以在温和的条件下使毒素的毒力降低，对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小等优点，同时，还具有安全、环保、高效的特点，被认为是最佳脱毒方法。因此，利用现代生物技术去除粮油或/饲料中呕吐毒素的研究具有良好的应用前景。专利申请CN103243047A中公开了一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用，将900μL枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液与100μL呕吐毒素(100μg/ml)反应，反应2小时对呕吐毒素的降解率为25％，反应24小时对呕吐毒素的降解率为56％，反应48小时对呕吐毒素的降解率为80％，降解率尚有待提高。
另外，现有的降解呕吐毒素的生物法大多是在温和的条件(如温度25-37℃且最高不超过40℃，pH为7左右)下进行，然而，在较高的温度负荷下(如在容器中进行运输期间或在饲料粒化期间的情况下)或苛刻的酸碱性条件下尚无较好的解决办法，这就限制了生物法在降解呕吐毒素中的应用范围。
因此，有必要寻找一种高效的且安全性高的，并且在较高的温度负荷或苛刻的酸碱条件下可以使用的生物降解呕吐毒素的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有的呕吐毒素降解过程中存在的上述缺陷，提供了一株地衣芽孢杆菌、含有该菌的菌剂及其应用、降解呕吐毒素的方法和试剂盒。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其中，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.13314。
第二方面，本发明还提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
第三方面，本发明还提供了上述地衣芽孢杆菌和/或菌剂在降解呕吐毒素中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种降解呕吐毒素的方法，其中，该方法包括：将上述地衣芽孢杆菌和/或上述菌剂与呕吐毒素污染的样品接触，以降解样品中的呕吐毒素。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的枯草芽孢杆菌和/或本发明所述的菌剂。
本发明提供的地衣芽孢杆菌可以高效且快速地降解粮油和/或饲料中的呕吐毒素，特别是，即使粮油和/饲料中的呕吐毒素含量高达50ppm以上(优选至少为100ppm，进一步优选至少为150ppm，更进一步优选至少为200ppm)时，该地衣芽孢杆菌也可以高效且快速地降解呕吐毒素，并且对粮油和/或饲料的适口性无影响(即处理前后口味基本无差异)；同时，将该地衣芽孢杆菌添加至受呕吐毒素污染的粮油和/或饲料中，无有毒产物生成，具有安全性。因此，该地衣芽孢杆菌具有良好的应用前景。
此外，本发明提供的地衣芽孢杆菌还具有高温和酸碱稳定性，特别是在碱性条件下(如pH为8-10)仍具有良好的稳定性，这进一步扩大了其应用的范围。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，于2016年11月16日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.13314。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其中，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.13314。
本发明提供的地衣芽孢杆菌分离自受呕吐毒素污染的土壤样本(采集地为北京)。所述地衣芽孢杆菌的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的方法，例如可以为液相富集法或土壤环流法。
液相富集法具体可以包括：称取适量受呕吐毒素污染土壤样品加入到装有LB液体培养基的三角瓶中，加入适量玻璃珠。将三角瓶在28-37℃，160-180rpm下振荡；将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为呕吐毒素钝化微生物的来源。将所述上清液接种到含有呕吐毒素的LB液体培养基中，在28-37℃，160-180rpm下振荡培养。用无菌吸管吸取1-2mL，移入另一个富集培养三角瓶中。如此转移三次后，将上清液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8倍，吸取适量涂布于含有50、100、200或300mg/L的呕吐毒素的LB固体培养基上进行平板划线，28-37℃培养3-4天后，分离单菌落。
土壤环流法具体可以包括：称取100g受呕吐毒素污染土壤与适量粒径约为3mm的砂粒混合均匀，置于环流装置的上层。下层装入LB培养基200mL作为环流液。启动空气压缩机，开始驯化过程，期间根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。驯化结束后，将下层环流液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8倍，吸取适量涂布于含有50、100、200或300mg/L的呕吐毒素的LB固体培养基上进行平板划线，28-37℃培养3-4天后，分离单菌落。
本发明的发明人从筛选出的菌株中选取了一株对呕吐毒素降解作用最强的细菌进行了DNA提取与鉴定，鉴定结果显示，该菌株的16srDNA序列与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)有100％的同源性，可以确定该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并于2016年11月16日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13314。
本发明提供的地衣芽孢杆菌经过培养能够产生大量的地衣芽孢杆菌的活菌体。本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述地衣芽孢杆菌大量增殖即可，例如可以按照105CFU/mL的接种量将地衣芽孢杆菌的活菌体接种于培养基中，并且在好氧条件下，在28-38℃的温度下培养12-48小时后，得到培养液。其中，所述培养基可以为本领域常规使用的培养基，例如，可以为LB液体培养基(0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠；pH为6.8-7.0；培养温度为28-38℃)或营养肉汤培养基(0.8-1重量％蛋白胨，0.3-0.5重量％牛肉膏，0.5-0.8重量％氯化钠；pH为7.2-7.6；培养温度为28-38℃)，优选为LB液体培养基。
本发明可以进一步分离上述培养液中的地衣芽孢杆菌的菌体，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件，此为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
在本发明中，对所述菌剂中地衣芽孢杆菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。
根据本发明，所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体和/或死菌体。优选地，所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体或者活菌体和死菌体的混合菌体。当所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体和死菌体的混合菌体时，优选为活菌体的数量高于死菌体的数量。最优选为所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体。
根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为菌液)和/或固态菌剂(例如可以为冻干后的菌体)，优选为固态菌剂。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所熟知，在此不再详细赘述。
另外，本发明的发明人在研究过程中发现，虽然本发明提供的地衣芽孢杆菌是在高浓度呕吐毒素(至少50ppm)的条件下筛选得到的，但其对土壤中常见的其他真菌毒素污染(如呕吐毒素、黄曲霉毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、T2毒素等)均有一定的降解作用。
第三方面，本发明还提供了上述地衣芽孢杆菌和/或上述菌剂在降解呕吐毒素中的应用，优选为在降解粮油和/或饲料中的呕吐毒素中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种降解呕吐毒素的方法，其中，该方法包括：将上述地衣芽孢杆菌和/或上述菌剂与呕吐毒素污染的样品接触，以降解样品中的呕吐毒素。
根据本发明，所述呕吐毒素污染的样品可以为呕吐毒素污染的粮油和/或饲料。
在优选的情况下，以所述呕吐毒素污染的样品的总重量为基准，所述呕吐毒素的含量至少为1ppm，进一步优选至少为50ppm，更进一步优选至少为100ppm，再进一步优选至少为150ppm，再更进一步优选至少为200ppm。在本发明中，当所述待处理的样品为液体时，“ppm”表示的是“μg/mL”；当所述待处理的样品为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。
在本发明中，术语“粮油”是指对谷类、豆类等粮食和油料及其加工成品和半成品的统称，特别是指人类可以食用的产品。例如，所述粮油可以为本领域常见的人类可以食用的粮油产品，具体地，所述粮油可以包括谷物及其农副产品、油和脂肪制品、酒类、奶及其制品等中的至少一种。
在本发明中，术语“饲料”是指农业或牧业饲养的动物的食物的总称。例如，所述饲料可以为本领域常见的饲养动物所使用的食物，具体地，所述饲料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。
在本发明中，所述粮油或饲料还可以含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4和滑石粉以及它们的混合物。
在本发明中，对所述地衣芽孢杆菌和/或菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述地衣芽孢杆菌和/或菌剂可以为液态和/或固态。其中，在何种剂型中添加何种赋形剂为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。
根据本发明，相对于1g所述样品，所述地衣芽孢杆菌和/或所述菌剂中的菌体数至少为105CFU，优选地，所述地衣芽孢杆菌和/或所述菌剂中的活菌体数至少为105CFU。在本发明中，菌体数可以按照GB4789.2-94进行测定。
根据本发明，所述接触的条件可以包括：温度为25-55℃，pH值为5-11，时间为1-48h；优选地，温度为30-40℃，pH值为7-10，时间为12-36h。
在本发明中，当所述样品为固体时，所述pH值按照GB/T 12456-2008的方法进行测定。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的枯草芽孢杆菌和/或本发明所述的菌剂。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
在以下制备例、制备对比例、实施例和对比例中：
呕吐毒素标准品购自Sigma公司，其余所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
LB液体培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，去离子水定容至1L，调节pH至7。
LB固体培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，16g琼脂粉，去离子水定容至1L，调节pH至7。
本发明提供的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并于2016年11月16日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.13314。
参比菌株1为保藏编号为CGMCC NO.1.807的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，购自CGMCC。
参比菌株2为CN103243047A中公开的保藏编号为CGMCC NO.7344的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，购自CGMCC。
菌体数按照GB4789.2-94进行测定。
按照《GB/T 30956-2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法》测定呕吐毒素含量。
呕吐毒素的降解率(％)＝(反应前样品中呕吐毒素的质量-反应后样品中呕吐毒素的质量)/反应前样品中呕吐毒素的质量×100％。
制备例1
将本发明提供的保藏编号为CGMCC NO.13314的地衣芽孢杆菌活化后，以1体积％的接种量接种于经121℃灭菌15min的LB液体培养基中，在160rpm，37℃条件下振荡培养，培养的时间使得菌液中菌体浓度为(1±0.1)×105CFU/mL。同时制成干粉，每克干粉中所含的总活菌数为(1±0.1)×105CFU。
制备对比例1
按照制备例1的方法，不同的是，用保藏编号为CGMCC NO.1.807的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)代替本发明提供的保藏编号为CGMCC NO.13314的地衣芽孢杆菌。
制备对比例2
按照制备例1的方法，不同的是，用CN103243047A中公开的保藏编号为CGMCC NO.7344的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)代替本发明提供的保藏编号为CGMCC NO.13314的地衣芽孢杆菌。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的地衣芽孢杆菌降解呕吐毒素的能力。
①降解时间测定
取900μL制备例1培养得到的菌液置于1.5mL离心管中，加入呕吐毒素标准品溶液，混合均匀，得到混合液，其中，混合液中呕吐毒素的终浓度为50ppm。
将上述混合液于37℃、pH为7的条件下进行反应，分别在反应1h、12h、24h、36h、48h时取反应的样品20μL用于检测呕吐毒素的残留。结果如表1所示。
通过表1的结果可知，反应24h可以使呕吐毒素的降解率达90％以上。因此，在接下来的实验中以24h作为反应时间。
②热稳定性测定
将培养得到的菌液分别于40℃、45℃、50℃和55℃，pH为7的条件下处理30min后，分别取900μL上述处理后的菌液置于1.5mL离心管中，加入呕吐毒素标准品溶液，混合均匀，得到混合液，其中，混合液中呕吐毒素的终浓度为50ppm。然后再将上述混合液于37℃、pH为7的条件下反应24h，反应完成后，取样品20μL用于检测呕吐毒素的残留。结果如表2所示。
通过表2的结果可知，菌液在40-55℃下保存30min仍具有较高的呕吐毒素降解活性。
③酸碱稳定性测定
将培养得到的菌液分别于pH为5、6、7、8、9、10和11，37℃下处理30min后，分别取900μL上述处理后的菌液置于1.5mL离心管中，加入呕吐毒素标准品溶液，混合均匀，得到混合液，其中，混合液中呕吐毒素的终浓度为50ppm。然后再将上述混合液于37℃、pH为7的条件下反应24h，反应完成后，取样品20μL用于检测呕吐毒素的残留。结果如表3所示。
通过表3的结果可知，菌液在pH值为5-11下保存30min仍具有较高的呕吐毒素降解活性。
对比例1
按照实施例1的方法进行测定，所不同的是，分别使用制备对比例1制备得到菌液代替实施例1中使用的菌液。
降解时间测定的结果如表1所示，热稳定性测定的结果如表2所示，酸碱稳定性的结果如表3所示。
对比例2
按照实施例1的方法进行测定，所不同的是，分别使用制备对比例2制备得到菌液代替实施例1中使用的菌液。
降解时间测定的结果如表1所示，热稳定性测定的结果如表2所示，酸碱稳定性的结果如表3所示。
表1
表2
表3
测试实施例1
将由制备例1得到的干粉10g与1kg污染有200ppm呕吐毒素污染的玉米粉混合，加入1kg蒸馏水，做三个重复，混合均匀后于37℃、pH值为7的条件下脱毒1天。然后按照《GB/T 30956-2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法》测定处理1天后各样品中呕吐毒素的含量，并计算降解率。经计算，玉米粉中呕吐毒素的降解率为90.8％。并且，干粉的添加未对玉米粉的适口性产生任何的影响。
使用以上经处理后的玉米粉喂养猪14天，结果表明，在此期间，猪的饮食、饮水和日常活动均表现正常，并且猪的体重也一直保持稳定增长的趋势。以上结果说明将制备例1得到的干粉添加至玉米粉中用于猪的饲养，具有安全性。
测试实施例2
按照测试实施例1的方法，不同的是，玉米粉中呕吐毒素的含量为100ppm，经检测呕吐毒素的降解率为95.9％。并且，干粉的添加未对玉米粉的适口性产生任何的影响。
使用以上经处理后的玉米粉喂养猪14天，结果表明，在此期间，猪的饮食、饮水和日常活动均表现正常，并且猪的体重也一直保持稳定增长的趋势。以上结果说明将干粉添加至玉米粉中用于猪的饲养，具有安全性。
测试实施例3
按照测试实施例1的方法，不同的是，玉米粉中呕吐毒素的含量为50ppm，经检测呕吐毒素的降解率为100％。并且，干粉的添加未对玉米粉的适口性产生任何的影响。
使用以上经处理后的玉米粉喂养猪14天，结果表明，在此期间，猪的饮食、饮水和日常活动均表现正常，并且猪的体重也一直保持稳定增长的趋势。以上结果说明将干粉添加至玉米粉中用于猪的饲养，具有安全性。
测试对比例1
按照测试实施例1的方法进行，所不同的是，使用制备对比例1得到的干粉代替实施例1中使用的干粉。经检测呕吐毒素的降解率为16.8％。
测试对比例2
按照测试实施例1的方法进行，所不同的是，使用制备对比例2得到的干粉代替实施例1中使用的干粉。经检测呕吐毒素的降解率为18.1％。
通过以上实施例1与对比例1-2的结果相比较可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌可以高效且快速地降解粮油和/或饲料中的呕吐毒素，并且该地衣芽孢杆菌还具有高温和酸碱稳定性，特别是在碱性条件下(如pH为8-10)仍具有良好的稳定性。
通过以上测试实施例1与测试对比例1-2的结果相比较可知，即使将本发明提供的地衣芽孢杆菌应用于呕吐毒素含量高达50ppm以上的粮油和/饲料中，该地衣芽孢杆菌也可以高效且快速地降解呕吐毒素，并且对粮油和/或饲料的适口性无影响(即处理前后口味基本无差异)；同时，将该地衣芽孢杆菌添加至受呕吐毒素污染的粮油和/或饲料中，无有毒产物生成，具有安全性。因此，该地衣芽孢杆菌具有良好的应用前景。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。