技术领域
本发明属于多糖的技术领域，具体涉及一种皱盖疣柄牛肝菌多糖及其制备方法与应用。
背景技术
多糖是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物高分子化合物。现代药理研究表明多糖具有多种生理活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、延缓衰老、增强免疫功能等。免疫调节作用是多糖最重要的生物活性功能，一直是人们研究的热点。免疫细菌多糖和人工合成的化合物，其不良反应和副作用已引起人们广泛注意。而大多数高等植物来源的多糖均为无不良反应的物质，不会对机体产生较大的副作用，因此，从植物中分离的多糖在生物医学上引起极大关注。目前已对百余种植物多糖进行了活性相关的研究报道。研究表明植物多糖可通过与免疫细胞表面的多种受体结合、激活不同的信号通路来调控动物机体内的免疫系统，包括：刺激巨噬细胞、T/B淋巴细胞、自然杀伤细胞的分泌或增殖；调节细胞因子的释放；促进抗体的分泌；激活补体系统等。对这些活性物质的作用机制也在不断发展，其中多糖对非特异性诱导的免疫机制更受到人们的重视。植物多糖是最理想的免疫候选药物。
皱盖疣柄牛肝菌(Leccinum rugosiceps)别名虎皮牛肝菌，隶属于担子菌真菌和牛肝菌属的种类，是一种丛生的大型食、药两用菌种。根据目前的大量科研成果发现，野生食用菌具有抗氧化、抗菌、抗辐射、护肝、降血糖及增强机体免疫力，甚至是抗肿瘤和抗癌等功能活性，其中皱盖疣柄牛肝菌具有很高的营养以及食用价值，它本身含钾、维生素、优质的蛋白质以及人体必需的八种氨基酸等，同时具有低脂肪、低热量、无胆固醇、无淀粉的特点，是比较健康的一种食用食材，可作为功能性食品。
植物活性多糖的提取方法有多种，常采用的有酶解、微波、超声波、膜处理和CO2超临界萃取等方法。微波法简单且高效率，具有高选择性，但其能耗较大，成本较高；超临界流体萃取技术和酶解法都比较环保，但条件难以控制且花费较大；对比以上几种方法，热水提取法设备简单，操作简易，目前工业广泛使用大量提取多糖的方法仍为热水提取法，但传统的热水浸提法生产效率较低且能耗高。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种皱盖疣柄牛肝菌粗多糖的快速提取方法。本发明的方法简单高效，从皱盖疣柄牛肝菌提取的多糖得率高，极大的节省了工业生产时间成本；并且本发明的方法不会破坏多糖的结构。
本发明的另一目的在于提供由上述方法得到皱盖疣柄牛肝菌多糖。
本发明的再一目的在于提供皱盖疣柄牛肝菌多糖的应用。所述皱盖疣柄牛肝菌多糖在医药、保健品、食品等领域中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种皱盖疣柄牛肝菌多糖的提取方法，包含如下步骤：
(1)将皱盖疣柄牛肝菌进行打浆处理，过滤，得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖溶液；
(2)将粗多糖溶液和经过预处理的大孔吸附树脂混合，脱色处理，获得脱色后的多糖溶液；
(3)采用沉淀剂对脱色后的多糖溶液进行沉淀，收集沉淀物并干燥，得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖；
(4)采用Sevage法脱除皱盖疣柄牛肝菌粗多糖中的蛋白，获得皱盖疣柄牛肝菌多糖。
步骤(1)中所述打浆处理是指采用打浆机进行打浆处理，打浆机为破壁料理机，打浆处理的转速40000-50000r/min；所述打浆处理的时间为5～7min；步骤(1)中所述打浆处理的水料比为20：1～40：1(质量比)。
步骤(1)中过滤后可将滤液进行浓缩，所述浓缩为减压浓缩，减压浓缩的温度为40～65℃。
步骤(1)中打浆处理后的浆液先经过离心处理，然后进行过滤；所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min；所述过滤的次数为2～4次。
步骤(2)中所述脱色处理的条件为于40～60℃水浴2～4h；步骤(2)中脱色处理后，过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液；所述减压浓缩的温度为40～65℃。
步骤(2)中所述大孔吸附树脂为D354FD树脂；
步骤(2)中所述大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂先用蒸馏水浸泡12～24h，再用质量分数为3～5％的盐酸溶液浸泡0.5～3h，蒸馏水洗至中性，然后用质量分数为3～5％的氢氧化钠溶液浸泡0.5～3h，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂。
步骤(3)中所述沉淀剂为无水乙醇或体积分数为90～100％的乙醇溶液；
步骤(3)中所述沉淀的温度为0～4℃。
步骤(3)中所述沉淀剂的加入量为多糖溶液体积的3～5倍；步骤(3)中所述沉淀的时间为8～24h；
步骤(3)中沉淀完成后，进行离心，弃去上清液，获得沉淀物；所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为12～15min；
步骤(3)中所述干燥的温度为40～60℃，干燥至恒重。
步骤(4)的具体步骤为：Sevage法脱蛋白：取粗多糖，加水复溶后，加入氯仿和正丁醇的混合溶液，振荡，离心，收集上层溶剂层，重复2～3次后，加入沉淀剂进行沉淀，离心，弃去上清液，收集沉淀物并干燥，得到皱盖疣柄牛肝菌多糖。
步骤(4)中所述沉淀剂为无水乙醇或体积分数为90～100％的乙醇溶液；所述沉淀的温度为0～4℃；所述沉淀的时间为8～24h。
所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为12～15min；所述干燥的温度为40～60℃，干燥至恒重；
所述氯仿：正丁醇比值为4：1～5：1。
本发明方法提取的皱盖疣柄牛肝菌多糖的重均分子量为11157～11221Da。本发明以湿法打浆快速提取法的方式提取皱盖疣柄牛肝菌多糖，并且通过单因素试验及Box-Behnken中心组合试验设计、响应面分析法，优化多糖的最佳快速提取工艺，以期待得出提取率高、时间成本以及设备成本低的提取工艺。同时，粗多糖通过大孔树脂脱色、无水乙醇醇沉、Sevage试剂法脱蛋白，得到皱盖疣柄牛肝菌多糖，以Vc作对比，使之分别与ABTS+、DPPH自由基反应，检测多糖对它们的抑制能力，根据对自由基的抑制能力大小测定皱盖疣柄牛肝菌多糖的抗氧化能力强弱，为开发药食两用的真菌资源提供数据支持。
所述皱盖疣柄牛肝菌多糖用于制备药物、保健品和/或食品。
所述皱盖疣柄牛肝菌多糖用于制备抗氧剂。
本发明提取的方法对活性多糖结构的破坏小，同时对多糖提取的时间短，极大的节省了工业生产时间成本。本发明的提取方法能够在非常短的时间内达到甚至优于水热提取法的提取效果。本发明的活性多糖具有抗肿瘤、抗氧化、调节机体免疫力等功效；与其他外源性抗氧化剂相比，本发明的多糖具有低毒、安全和来源广等优点。
本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：
(1)相对于其他传统提取方法，在同等其他条件下，本发明使用快速打浆处理提取皱盖疣柄牛肝菌多糖，处理时间(5-7min)远低于传统提取法(180min)，多糖得率高于传统热水浸提法，纯度高于或近似于水热提取法，本发明所获的多糖具有水热提取法提取的多糖的结构，多糖在提取的过程中，结构的破坏较小；
(2)本发明提取的皱盖疣柄牛肝菌多糖对ABTS+和DPPH·具有一定的清除作用作用。
附图说明
图1为实施例1制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖对DPPH自由基抑制率的曲线图；
图2为实施例1制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖对ABTS+自由基抑制率的曲线图；
图3为实施例1制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖的GPC图；
图4为对比例制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖的GPC图；
图5为实施例2制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖的GPC图；
图6为实施例3制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖的GPC图；
图7为实施例4制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖的GPC图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。皱盖疣柄牛肝菌干品购买于云南马龙县云南滇彩农产品公司。
本发明提取多糖的过程中Sevage法脱蛋白时，复溶多糖溶液与氯仿正丁醇混合液的体积比为(2～5)：1，复合多糖溶液的浓度为(1～10)mg/mL。
实施例1从皱盖疣柄牛肝菌中制备得到皱盖疣柄牛肝菌多糖：
(1)称取皱盖疣柄牛肝菌干品100g，放入S3破壁料理机(东莞市阿道夫电器有限公司S3破壁料理机)中打浆处理；其中，水料比为30:1(质量比)，水的温度为80℃，打浆提取时间为7min，打浆转速为46000r/min；然后取提取后上清液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，滤纸过滤3次，将滤液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；
(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡12h，然后用质量分数为5％的盐酸溶液浸泡0.5h，蒸馏水洗涤至中性，再用质量分数为5％的氢氧化钠溶液浸泡0.5h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(3)将步骤(1)得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于55℃恒温水浴锅中恒温水浴3h进行脱色，脱色的过程中间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗5次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(4)在搅拌的条件下，在步骤(3)得到的浓缩糖液中加入4倍体积的体积分数为95％乙醇，于4℃条件下醇沉8h，然后4000rpm下离心分离15min，弃去上清液，取出沉淀物于45℃烘干，得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖；
(5)Sevage法脱蛋白：取粗多糖，加水复溶(5mg/ml)后，加入氯仿和正丁醇的混合溶液(复溶后多糖溶液：氯仿：正丁醇＝25：5：1)，剧烈振荡，离心，收集上层溶剂层，重复2～3次后，加入体积分数为95％乙醇沉淀剂沉淀12h，离心，弃去上清液，收集沉淀物并55℃下干燥，得到皱盖疣柄牛肝菌多糖样品。本实施例获得多糖纯度为62.58％，多糖得率为4.61％，多糖重均分子量为11221Da，质均分子量为15529Da(多糖的GPC图如图3所示)。
对比例：水热浸提法提取皱盖疣柄牛肝菌多糖：
(1)称取皱盖疣柄牛肝菌干品100g，热水浸提法提取多糖；其中，水料比为20:1(质量比)，加水温度为80℃，热水浸提时间为180min，取提取后上清液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，滤纸过滤3次，将滤液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；
(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡24h，然后用质量分数为5％的盐酸溶液浸泡2h，蒸馏水洗涤至中性，再用质量分数为5％的氢氧化钠溶液浸泡2h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(3)将步骤(1)得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于40℃恒温水浴锅中恒温水浴2h进行脱色，脱色过程中间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗4次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(4)在步骤(3)中制备得到的浓缩糖液中加入3倍体积的体积分数为95％的乙醇，边加边磁力搅拌，于0℃条件下醇沉12h，然后3000rpm下离心分离12min，弃去上清液，取出沉淀物于50℃烘干，得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖；
(5)Sevage法脱蛋白：取粗多糖加水溶解(5mg/ml)后，加入氯仿和正丁醇的混合溶液(加水溶解后的多糖：氯仿：正丁醇＝25：5：1)，剧烈振荡，离心，收集上层溶剂层，重复2～3次后，加入体积分数为95％乙醇沉淀剂4℃下进行沉淀12h，离心，弃去上清液，收集沉淀物并于55℃干燥，得到皱盖疣柄牛肝菌多糖样品。本实施例中测得多糖纯度为61.79％，得率为4.22％，多糖重均分子量为11253Da，质均分子量为15558Da(多糖的GPC图如图4)。
实施例2从皱盖疣柄牛肝菌中制备得到皱盖疣柄牛肝菌多糖：
(1)称取皱盖疣柄牛肝菌干品100g，放入S3破壁料理机中打浆处理。其中，水料比为40:1(质量比)，加水温度为80℃，打浆提取时间为6min，打浆转速为46000r/min；然后取提取后上清液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，滤纸过滤3次，将滤液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；
(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡24h，然后依次用质量分数为5％的盐酸溶液浸泡2h，蒸馏水洗涤至中性，再用质量分数为5％的氢氧化钠溶液浸泡2h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(3)将步骤(1)得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于40℃恒温水浴锅中恒温水浴2h进行脱色，间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗4次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(4)在步骤(3)得到的浓缩糖液中加入3倍体积的体积分数为95％的乙醇，边加边磁力搅拌，于0℃条件下醇沉12h，然后3000rpm下离心分离12min，弃去上清液，取出沉淀物于50℃烘干，得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖；
(5)Sevage法脱蛋白：取粗多糖，加水复溶(5mg/ml)后，加入氯仿和正丁醇的混合溶液(复溶后多糖溶液：氯仿：正丁醇＝25：5：1)，剧烈振荡，离心，收集上层溶剂层，重复2～3次后，加入体积分数为95％乙醇沉淀剂4℃下沉淀12h，离心，弃去上清液，收集沉淀物并55℃下干燥，得到皱盖疣柄牛肝菌多糖样品。测得多糖纯度为61.99％，得率为4.49％，重均分子量为11157Da，质均分子量为15433Da(多糖的GPC图如图5)。
实施例3从皱盖疣柄牛肝菌中制备得到皱盖疣柄牛肝菌多糖：
(1)称取皱盖疣柄牛肝菌干品100g，放入S3破壁料理机中打浆处理。其中，水料比为30:1(质量比)，加水温度为90℃，打浆提取时间为7min，打浆转速为46000r/min；然后取提取后上清液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，滤纸过滤3次，将滤液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；
(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡18h，然后依次用质量分数为5％的盐酸溶液、质量分数为5％的氢氧化钠溶液各自浸泡3h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(3)将步骤(1)中制备得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于60℃恒温水浴锅中恒温水浴4h进行脱色，间隔搅拌，之后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗5次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(4)在步骤(3)制备得到的浓缩糖液中加入5倍体积的体积分数为95％的乙醇，边加边磁力搅拌，于4℃条件下醇沉24h，然后5000rpm下离心分离14min，弃去上清液，取出沉淀物于60℃烘干，得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖。
(5)Sevage法脱蛋白：取粗多糖，加水复溶(5mg/ml)后，加入氯仿和正丁醇的混合溶液(复溶后多糖溶液：氯仿：正丁醇＝25：5：1)，剧烈振荡，离心，收集上层溶剂层，重复2～3次后，加入体积分数为95％乙醇沉淀剂4℃下沉淀24h，离心，弃去上清液，收集沉淀物并55℃下干燥，得到皱盖疣柄牛肝菌多糖样品。测得多糖纯度为62.59％，得率为4.51％，多糖重均分子量为11179Da，质均分子量为15546Da(多糖的GPC图如图6)。
实施例4从皱盖疣柄牛肝菌中制备得到皱盖疣柄牛肝菌多糖：
(1)称取皱盖疣柄牛肝菌干品100g，放入S3破壁料理机中打浆处理。其中，水料比为30:1(质量比)，加水温度为80℃，打浆提取时间为8min，打浆转速为46000r/min；然后取提取后上清液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，滤纸过滤3次，将滤液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；
(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡18h，然后依次用质量分数为5％的盐酸溶液、质量分数为5％的氢氧化钠溶液各自浸泡3h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(3)将步骤(1)中制备得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于60℃恒温水浴锅中恒温水浴4h进行脱色，间隔搅拌，之后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗5次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(4)在步骤(3)制备得到的浓缩糖液中加入5倍体积的体积分数为95％的乙醇，边加边磁力搅拌，于4℃条件下醇沉24h，然后5000rpm下离心分离14min，弃去上清液，取出沉淀物于60℃烘干，得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖。
(5)Sevage法脱蛋白：取粗多糖，加水复溶(5mg/ml)后，加入氯仿和正丁醇的混合溶液(复溶后多糖溶液：氯仿：正丁醇＝25：5：1)，剧烈振荡，离心，收集上层溶剂层，重复2～3次后，加入体积分数为95％乙醇沉淀剂4℃下沉淀12h，离心，弃去上清液，收集沉淀物并55℃下干燥，得到皱盖疣柄牛肝菌多糖样品。测得多糖纯度为61.56％，得率为4.54％，多糖重均分子量为11192Da，质均分子量为15512Da(多糖的GPC图如图7)。
实施例5皱盖疣柄牛肝菌多糖对DPPH自由基的抑制作用
标准曲线的制作:准确称取19.7mg DPPH先用少量无水乙醇溶解，再以无水乙醇定容至250ml，配成200μmol/L的标准溶液，置棕色瓶中于冰箱内保存。分别取1.5ml浓度为0，10，20，50，100，150，200μmol/L DPPH标准溶液，和0.5ml无水乙醇混匀后，静置30min，然后在最大吸收波长517nm处测定吸光值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制作DPPH·标准曲线，选择合适的DPPH·浓度作为测定样品中的DPPH·标准溶液实验浓度。
配置不同浓度的样品(实施例1制备得到的皱盖疣柄牛肝菌多糖)和标准品(抗坏血酸VC)溶液，分别取50μl样品或标准品溶液，加入150μl选择好的合适浓度的DPPH·标准液(现配现用)，以无水乙醇代替样品作为空白对照，以无水乙醇代替DPPH溶液作为本底对照，将混合溶液摇匀后静置30min，用比色皿在517nm波长处测定吸光值。样品对DPPH自由基的清除率按如下公式计算：
DPPH清除率(％)＝[1－(A样品－A本底对照)/A空白对照]×100％。
测试结果如图1所示，图1是实施例1制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖对DPPH自由基抑制率的曲线图。结果显示由实施例1制备得到的皱盖疣柄牛肝菌多糖对DPPH自由基具有微弱的清除和抑制作用，但并不显著(图1)。
实施例6皱盖疣柄牛肝菌多糖对ABTS+自由基的抑制作用
ABTS工作液浓度的确定:准确称取0.3841g ABTS先用少量乙醇溶解，再用乙醇定容至100ml，配成7mmol/L的标准溶液，置棕色瓶中于冰箱内保存。准确称取0.1324g过硫酸钾先用少量水溶解，再定容至100ml，配成4.9mmol/L的标准溶液。取ABTS标准溶液和过硫酸钾1：1混合均匀，得到ABTS母液，用锡铂纸包裹，4℃下保存备用。用无水乙醇稀释ABTS母液，直到ABTS溶液在734nm处的吸光值为0.7±0.2，此时溶液浓度为0.25mmol/L，该溶度即为ABTS溶液的工作浓度。
配置不同浓度的样品(实施例1制备得到的皱盖疣柄牛肝菌多糖)和标准品(抗坏血酸VC)溶液，分别取20μL样品或标准品溶液，加入180μl选择好的合适浓度的ABTS工作液(现配现用)，以无水乙醇代替样品作为空白对照，以无水乙醇代替ABTS工作液作为本底对照，在37℃下避光震荡6分钟后，于734nm波长下测上述反应后的试液，样品对ABTS+自由基的清除率按如下公式计算：
DPPH清除率(％)＝[1－(A样品－A本底对照)/A空白对照]×100％。
测试结果如图2所示，图2是实施例1制备的皱盖疣柄牛肝菌多糖对ABTS+自由基抑制率的曲线图。结果显示由实施例1制备得到的皱盖疣柄牛肝菌多糖对ABTS+自由基具有微弱的清除和抑制作用，但并不显著(图2)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。