技术领域
本发明涉及一种药物，具体地，涉及一种聚乙二醇缀合的艾塞那肽的合成及应用。
背景技术
随着我国人民生活水平的提高，糖尿病人群快速增长，根据2010年的统计，我国糖尿病发病率达到了9.7%，绝对数字接近1亿，而考虑到我国糖尿病的检出率尚不足40%，我国的实际患病人群是非常庞大的，而在我国的糖尿病患病人群中，2型糖尿病患者超过了90%，数量已经超过印度成为了世界第一，并且数量还在增长中。
目前，治疗2型糖尿病的几类常用药物都有可能造成身体的不良反应，特别是二甲双弧，有导致患者乳酸性酸中毒的危险性；磺服类、a-葡萄糖营酶抑制剂类和曝哇烷二酮类药物会诱发患者体重增加；此外，2型糖尿病患者应用口服降糖药后物治疗后会出现药物失效的现象，外周组织对胰岛素的敏感性降低。
艾塞那肽（Exendin-4）是含39个氨基酸的多肽，与人的胰高血糖素(Glucagon)有48%的同源性，与人的GLP-1有53%的同源性，可以模拟葡萄糖依赖性胰岛素分泌，增强其它抗高血糖作用，增加胰岛素的生物合成分泌，但不会引起严重低血糖，并具有降低食欲、减少食物的摄入、减肥、对神经细胞具有保护作用等功能，被誉为“聪明的降糖药”。虽然控制血糖效果明显，但是艾塞那肽在人体内的半衰期比较短，所以需要一天注射两次来维持药效，长效的艾塞那肽显然将会给病患带来生活的便利，符合大量2型糖尿病患者的需求。
随着近年来大分子药物的迅速发展，多肽和蛋白质药物的稳定性一直是医药研究人员关注的热点之一。有多种方式可以被用来增加大分子药物在体内的稳定性，包括不同的给药途径（口服，鼻腔给药，透皮吸收），不同的载体（白蛋白，脂质体，微球），不同的高分子材料 （多糖），不同药物释放技术 （前药，缓释技术）等等。其中聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG）缀合是一项比较常用的增加大分子药物稳定性的方式，该方法最早由Davis 和 Abuchowski等在20世纪70年代研究开发，活化的亲电PEG或者PEG衍生物可以和多肽或者蛋白质上的末端氨基，赖氨酸ε-胺基和半胱氨酸的巯基反应，反应后可以在多肽或者蛋白质分子上连接多个聚乙二醇长链，缀合以后的大分子药物，可以有效地降低免疫原性，提高稳定性和溶解性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种聚乙二醇缀合的艾塞那肽，本发明所提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽具有半衰期长、稳定性好、降糖效果好的优点，同时，本发明提出了其制备方法和应用。
为解决以上技术问题，本发明的技术方案如下：
一种聚乙二醇缀合的艾塞那肽，由结构通式（Ⅰ）表示：
（Ⅰ）
式中，mPEG表示甲氧基聚乙二醇的残基；
n取值为0-3；
R表示去除一个氨基的艾塞那肽分子，其中，所述氨基为艾塞那肽分子中赖氨酸残基的氨基或N末端组氨酸残基的氨基；
所述聚乙二醇缀合的艾塞那肽的分子量为9800-110000。
优选地，n取值为1。
优选地，聚乙二醇缀合的艾塞那肽的分子量为9800-15000。
本发明提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽的制备方法，包括以下反应：
具体地，反应过程包括以下步骤：
（1）将艾塞那肽（Ⅲ）用Tris-HCl缓冲液溶解，调节其pH为6.5-8.5；
（2）加入活化的化合物（Ⅱ），其中，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：0.1-100，反应时间为20-240分钟，反应的温度为0-37℃；
（3）反应完毕，加入超过反应物摩尔量100倍以上的甘氨酸终止反应，制得聚乙二醇缀合的艾塞那肽（Ⅰ）。
具体地，步骤（3）中所述聚乙二醇缀合的艾塞那肽（Ⅰ）的分离纯化和分析，包括以下步骤：
（1）聚乙二醇缀合的艾塞那肽（Ⅰ）的分离纯化：
将最终反应液过滤，以反相高效液相（HPLC）色谱进行纯化，色谱条件如下：
色谱柱： 10um，20 x 250mm
流动相： A： 0.1% 三氟乙酸（TFA）
B： 乙腈
35%B 等度洗脱
流速： 20ml/min
检测波长：210nm
以上述条件运行，通过峰值进行分离纯化；
（2）聚乙二醇缀合的艾塞那肽（Ⅰ）的分析：
将上步分离纯化以后的目标产物用高效液相色谱进行分析，色谱条件如下：
色谱柱： 5um，4.6 x 250mm
流动相： A： 0.1%的三氟乙酸
B： 乙腈
30%-40%B 10分钟内梯度洗脱，然后用95%B冲洗
流速：1ml/min
检测波长：210nm
柱温：35℃
以上述条件运行，通过峰值进行分析。
具体地，化合物（Ⅱ）为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯1000、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯1000、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000中的一种。
优选地，步骤（1）所述pH为 6.5-7.5；步骤（2）所述摩尔比为1：8-10，所述反应时间为20-30分钟，所述反应温度为20-25℃。
本发明提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽在制备治疗2型糖尿病的药物中的应用。
以上所述的mPEG的化学通式为CH3O-(CH2CH2O)a-CH2CH2OH，a≥1；所述Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷与盐酸的混合溶液。
本发明所提出的技术方案，具有以下有益效果：
（1）聚乙二醇缀合的艾塞那肽在体内的半衰期为20小时，而无缀合的艾塞那肽在体内的半衰期为2小时，因此，本发明所合成的聚乙二醇缀合的艾塞那肽与无缀合的艾塞那肽相比，在体内稳定性上大大优于无缀合的艾塞那肽分子。
（2）由于聚乙二醇缀合的艾塞那肽的半衰期长、稳定性好，因此，其在体内作用时间更长、对2型糖尿病降糖效果更加明显。
（3）本发明所提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽的制备方法简便有效，一步反应即可制得终产物，特别适于工业化大生产。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1中聚乙二醇缀合的艾塞那肽分离纯化的HPLC色谱图；
图2是实施例1中聚乙二醇缀合的艾塞那肽分析的HPLC色谱图；
图3是实施例1中无缀合的艾塞那肽分析的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
一、聚乙二醇缀合的艾塞那肽产品的具体实施方式
本发明所提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽，由结构通式（Ⅰ）表示：
（Ⅰ）
在式中，mPEG表示甲氧基聚乙二醇的残基；n取值为0-3；R表示去除一个氨基的艾塞那肽分子，其中，所述氨基为艾塞那肽分子中赖氨酸残基的氨基或N末端组氨酸残基的氨基；其中，在mPEG的化学通式CH3O-(CH2CH2O)a-CH2CH2OH中，通过控制a的取值，可将聚乙二醇缀合的艾塞那肽的分子量控制在9800-110000。
在艾塞那肽的氨基酸序列中，有2个赖氨酸残基，它们在艾塞那肽分子上一个接近N末端，另一个接近C末端，这2个赖氨酸残基的氨基都可以与聚乙二醇发生缀合，同时N末端的氨基也是聚乙二醇缀合的位点。
作为本发明的优选方式，n取值为1，此时，聚乙二醇缀合的艾塞那肽的分子式为：
更优选地，通过mPEG的分子量，即通过控制a的取值，使聚乙二醇缀合的艾塞那肽的分子量位于9800-15000之间。
二、聚乙二醇缀合的艾塞那肽合成的实施例
实施例1
本发明所提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽的制备方法，包括以下反应：
具体地，反应过程包括以下步骤：
（1）将艾塞那肽（Ⅲ）用Tris-HCl缓冲液溶解，调节其pH为7.0；
（2）加入活化的化合物（Ⅱ），其中，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：8，反应时间为30分钟，反应的温度为25℃；
其中，化合物（Ⅱ）为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000（mPEG-SPA-5000）；
（3）反应完毕，加入超过反应物摩尔量110倍的甘氨酸终止反应，制得聚乙二醇缀合的艾塞那肽（Ⅰ）。
本发明所提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽分离纯化，包括以下步骤：
将反应液过滤，以反相HPLC纯化，色谱条件如下：
色谱柱：RP-C18，10um，20 x 250mm
流动相： A： 0.1% TFA
B： 乙腈
35%B 等度洗脱
流速：20ml/min
检测波长：210nm
如图1所示，运行28分钟以后，出现了3个主要吸收峰，保留时间在28min左右的是多个残基缀合连接聚乙二醇的艾塞那肽分子，保留时间在31min的是单个残基缀合聚乙二醇的艾塞那肽分子，保留时间在34min的是未缀合的艾塞那肽分子，未缀合的艾塞那肽为非目标峰，因此没有完整收集。
本发明所提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽的分析，包括以下步骤：
分离纯化以后的目标产物用高效液相HPLC进行分析，条件如下：
色谱柱：RP-C18，5um，4.6 x 250mm
流动相： A： 0.1% TFA
B： 乙腈
30%-40%B 10分钟内梯度洗脱，然后用95%B冲洗
流速：1ml∕min
检测波长：210nm
柱温：35℃
如图2和图3所示，聚乙二醇缀合的艾塞那肽和未缀合的艾塞那肽纯度都可以达到98%以上。
通过SDS-PAGE对纯化后的多肽进行检测，聚乙二醇缀合的艾塞那肽比未缀合的艾塞那肽多5000道尔顿，显示聚乙二醇和多肽分子的单个氨基酸残基发生了缀合。
实施例2
与实施例1不同的是，pH为6.5；，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：10，反应时间为60分钟，反应的温度为30℃；其中，化合物（Ⅱ）中，n取值为1，mPEG中a取值120。
实施例3
与实施例1不同的是，pH为7.5；，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：0.1，反应时间为240分钟，反应的温度为37℃；其中，化合物（Ⅱ）为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯1000。
实施例4
与实施例1不同的是，pH为8.0；，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：100，反应时间为20分钟，反应的温度为0℃；其中，化合物（Ⅱ）为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯1000。
实施例5
与实施例1不同的是，pH为8.5；，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：50，反应时间为120分钟，反应的温度为10℃；其中，化合物（Ⅱ）为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000。
实施例6
与实施例1不同的是，pH为8.0；，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：20，反应时间为180分钟，反应的温度为5℃；其中，化合物（Ⅱ）为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000。
实施例7
与实施例1不同的是，pH为7.2；，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：1，反应时间为200分钟，反应的温度为15℃；其中，化合物（Ⅱ）为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000。
实施例8
与实施例1不同的是，pH为6.7；，艾塞那肽（Ⅲ）与化合物（Ⅱ）的摩尔比为 1：0.5，反应时间为220分钟，反应的温度为22℃；其中，化合物（Ⅱ）为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000。
三、聚乙二醇缀合的艾塞那肽应用的实施例
实施例9
本发明所提出的聚乙二醇缀合的艾塞那肽，用于治疗2型糖尿病，本实施例是以实施例1制备的聚乙二醇缀合的艾塞那肽对大鼠进行检测，同时，以无缀合的艾塞那肽和生理盐水进行比对，具体如下：
将生理状态相同的健康大鼠分为三组，禁食24小时，在三组大鼠腹腔同时注射葡萄糖 （20 mmol/kg 体重），然后分别按照以下处理：
实验组：注射聚乙二醇缀合的艾塞那肽（10 nmol/kg 体重）；
对照组1：注射无缀合的艾塞那肽（与实验组相同剂量）；
对照组2：注射生理盐水（体积与实验组相同）。
分别在注射完毕15，30，60，240分钟抽取血样，用葡萄糖氧化酶法（GOD法）检验血液中的葡萄糖含量，检测结果如表1所示：
从实验结果看，无缀合的艾塞那肽组大鼠血糖在15分钟时达到了稳定的降糖效果，和生理盐水对照组比较，血糖降低约15.7%，相应的聚乙二醇缀合的艾塞那肽组大鼠在15分钟时也实现了血糖降低，在60分钟时达到了最为显著的降血糖效应，和生理盐水组比较，血糖降低了约68.4%，并且降糖效应可以维持超过240分钟。
通过胰岛素的酶联免疫试剂盒检验血液中的胰岛素含量，检测结果如表2所示：
在胰岛素含量的检测中，无缀合艾塞那肽组大鼠血液中的胰岛素含量在15分钟后达到了峰值，而聚乙二醇缀合的艾塞那肽组大鼠在30分钟后实现了血液中胰岛素的峰值，在30分钟后，聚乙二醇缀合艾塞那肽组大鼠的血液中胰岛素浓度是无缀合组大鼠的4.2倍。
经测定（按小时抽取实验小鼠血液，检测其中艾塞那肽含量），聚乙二醇缀合的艾塞那肽在大鼠体内的半衰期为20小时，而无缀合艾塞那肽在大鼠体内的半衰期为2小时，因此，聚乙二醇缀合的艾塞那肽的半衰期长、稳定性优，降糖效果更加明显。
综合以上结果，聚乙二醇缀合的艾塞那肽拥有相当或超过无缀合的艾塞那肽的生物活性，并在体内稳定上大大优于无缀合的艾塞那肽。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。