技术领域
本发明涉及熊果酸的衍生物及熊果酸衍生物的制备方法。
背景技术
熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌苏酸，属五环三萜类化合物，它广泛存在于天然植物中。其结构式为：
熊果酸具有多种药理活性，尤其是抗肿瘤活性，且抗肿瘤谱广。熊果酸能够抑制多种肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞分化、抗肿瘤组织血管形成及诱导肿瘤细胞凋亡等，因此，熊果酸在抗肿瘤方面具有广阔的开发和应用前景。为了提高熊果酸的抗肿瘤活性以及生物利用度，提高其成药性，需通过不同的化学修饰方法将熊果酸的化学结构进行修饰。
目前对熊果酸结构进行修饰的较多，其修饰又主要集中在3-位的羟基和28-位的羧基上。例如，《生物有机及医药化学》［Meng,Y.Q.,Liu,D.,Cai,L.L.,Chen,H.,Cao,B.,Y. Bioorganic & Medicinal Chemistry,2009,17: 848–854.］就报道了进行这类修饰之产物的乙酰熊果酸28-酰胺衍生物。其制备方法是先对熊果酸3-位的羟基进行乙酰化保护，进而生成3-O-乙酰基熊果酸，然后将其与草酰氯反应，再与氨基酸酯盐酸盐中的一种——甘氨酸甲酯盐酸盐反应，最后再通过水解而制备出乙酰熊果酸28-酰胺衍生物。该熊果酸衍生物具有抑制宫颈癌细胞增殖的作用，其效果优于熊果酸。但是，该制备方法较复杂，应用于工业生产成本较高，且该化合物在抗其他肿瘤方面不尽如人意，例如，在对人体白血病U937细胞增殖方面，其效果与并未修饰过熊果酸之效果基本相当。
发明内容
本发明的第一目的是，提供一种在抑制人体白血病U937细胞增殖方面有较好效果的熊果酸衍生物。
本发明的第二目的是，提供一种制备实现所述第一目的之熊果酸衍生物的简便方法。
实现所述第一发明目的之技术方案，是这样一种熊果酸衍生物，与现有技术相同的方面是，该衍生物结构中熊果酸母体的3-位为3β-乙酰氧基，其改进之处是，在熊果酸母体的28-位为28-酰（8’-氨基辛酸），该熊果酸衍生物是3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸），其结构式Ⅰ为：
；
或者，在母体熊果酸的28-位为28-酰（4’-氨基丁醇），该熊果酸衍生物是3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇），其结构式Ⅱ为：
。
实现所述第二发明目的之技术方案，是这样一种熊果酸衍生物的制备方法，该方法制备的是实现所述第一发明目的之熊果酸衍生物；该方法有如下制备步骤：
（1）将熊果酸和乙酸酐反应，以对熊果酸3-位上的羟基进行乙酰化保护而生成3-O-乙酰熊果酸；
（2）将3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应，以在28-位上修饰而生成3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体；
（3）将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体作为反应物之一来生成熊果酸衍生物；
其改进之处是，步骤（3）所述的3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体是没有经过纯化的粗品，该步骤（3）中的另一反应物是8-氨基辛酸、或者4-氨基丁醇，其具体步骤如下：
（3-1）用二氯甲烷将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品充分溶解；
（3-2）在所得溶液中加入催化剂三乙胺并充分混合，然后加入所需反应量的8-氨基辛酸、或者4-氨基丁醇；在20～30℃下搅拌反应；其中，催化剂三乙胺的摩尔量不少于3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯的摩尔量；
反应结束后，再进行水洗，之后分液；
（3-3）将分液后所得有机相用足量的无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩而得3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）粗品、或得3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇）粗品；
（3-4）将所述粗品用300～400目硅胶过柱，得呈白色粉末状的3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品、或得呈白色粉末状的3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇）纯品；其中，过柱分离3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，其体积比为，二氯甲烷∶甲醇＝50∶1，过柱分离3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇）所用洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚的混合液，其体积比为，乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1。
从实现第一发明目的之方案中可以看出，本发明的熊果酸衍生物——3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）、或3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇），与现有技术在熊果酸母体28-位处接上的衍生物是不一样的，也即本发明熊果酸衍生物与现有技术有在本质上完全不同的结构，验证表明，本发明在抑制人体白血病U937细胞增殖方面，具有现有技术所不具备的较好效果。
从实现第二发明目的之方案中可以看出，本发明在修饰熊果酸母体28-位的羧基时，采用了与现有技术不同的合成路线，本发明是直接将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体的粗体来与8-氨基辛酸（氨基酸中的一种）或4-氨基丁醇（氨基醇中的一种）反应，而制得熊果酸衍生物的。这样一来，不但节省了纯化3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体的步骤，而且还节省了现有技术因采用甘氨酸甲酯盐酸盐（或其他氨基酸酯盐酸盐），而需要水解才能值得熊果酸衍生物的步骤，所以，与现有技术相比较，本发明不但能够制备出抑制人体白血病U937细胞增殖有较好效果的熊果酸衍生物，而且在保证纯度的情况下，还因节省了制备步骤、或简化了合成路线而降低了制备成本。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一、一种熊果酸衍生物，该衍生物结构中熊果酸母体的3-位为3β-乙酰氧基，本发明中，在熊果酸母体的28-位为28-酰（8’-氨基辛酸），该熊果酸衍生物是3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸），其结构式Ⅰ为：
；
或者，在母体熊果酸的28-位为28-酰（4’-氨基丁醇），该熊果酸衍生物是3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇），其结构式Ⅱ为：
。
二、一种熊果酸衍生物的制备方法，该方法制备的是本具体实施方式一所述的熊果酸衍生物；该方法有如下制备步骤：
（1）将熊果酸和乙酸酐反应，以对熊果酸3-位上的羟基进行乙酰化保护而生成3-O-乙酰熊果酸；
（2）将3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应，以在28-位上修饰而生成3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体；
（3）将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体作为反应物之一来生成熊果酸衍生物；
在本发明中，步骤（3）所述的3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体是没有经过纯化的粗品，该步骤（3）中的另一反应物是8-氨基辛酸（H2NCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2COOH）、或者4-氨基丁醇（NH2CH2CH2CH2CH2OH），其具体步骤如下：
（3-1）用二氯甲烷（CH2Cl2）将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品充分溶解；
（3-2）在所得溶液中加入催化剂三乙胺［N(CH2CH3)3］并充分混合，然后加入所需反应量的8-氨基辛酸、或者4-氨基丁醇；在20～30℃下搅拌反应；其中，催化剂三乙胺的摩尔量不少于3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯的摩尔量（催化剂的用量可适度过量，以提高反应速率；但以不超过3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯摩尔量的两倍为度，过多的用量将造成不必要浪费。在该催化剂用量范围内，其反应时间通常为12～24小时）；
反应结束后，再进行水洗，之后分液；
（3-3）将分液后所得有机相用足量的无水硫酸钠（元明粉，Na2SO4）干燥，然后减压浓缩而得3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）粗品、或得3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇）粗品（显然，无水硫酸钠的实际用量，以能确保所述“干燥”能够比较好而快地进行为度）；
（3-4）将所述粗品用300～400目硅胶过柱，得呈白色粉末状的3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品、或得呈白色粉末状的3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇）纯品；其中，过柱分离3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，其体积比为，二氯甲烷∶甲醇＝50∶1，过柱分离3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇）所用洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚的混合液，其体积比为，乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1（本领域技术人员从上述步骤中可知，石油醚仅取30～60℃沸程规格的即可）。
进一步讲，为取得更好效果，在本具体实施方式中，步骤（1）所述的3-O-乙酰熊果酸，由如下方法制得：
将熊果酸与足量的吡啶（Pyridine，C5H5N）混合，搅拌并升温到100℃以让熊果酸完全溶解在吡啶中；再滴加过量的乙酸酐，并保持在100℃状态下让熊果酸与乙酸酐反应；
本领域技术人员清楚，将熊果酸溶解于吡啶中的目的，是为确保熊果酸与乙酸酐之间的反应能够正常进行；用过量乙酸酐的目的，是为了让全部熊果酸都能参与反应而得到尽量多的产物。因此，吡啶的用量、乙酸酐的过量程度，均应当以能够达到上述目的为度——在这种情况下，其反应时间通常为4～5小时。
反应结束后，将反应液倾入冰水混合液中（冰水混合液的用量以能使反应液充分冷却为度，其量可适当增加），过滤，并用水反复洗至无吡啶味，烘干得白色粉末状的3-O-乙酰基熊果酸。
特别说明，通过上述反复过滤、洗涤之后，多余的乙酸酐也早已被除去了，即在本步骤产物3-O-乙酰基熊果酸中，不另含没有参与反应的乙酸酐。
在本具体实施方式中，步骤（2）所述3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体，由如下方法制得：
将3-O-乙酰基熊果酸完全溶解于足量的二氯甲烷中，再加入过量的草酰氯［乙二酰氯，(COCl)2］，于室温下搅拌，以使3-O-乙酰基熊果酸与草酰氯反应；
本领域技术人员清楚，将3-O-乙酰基熊果酸溶解于二氯甲烷中的目的，同样也是为了确保3-O-乙酰基熊果酸和草酰氯之间的反应能够正常进行；用过量草酰氯的目的，当然也是为了全部3-O-乙酰基熊果酸均参与反应而得到尽量多的产物。因此，二氯甲烷的用量、草酰氯的过量程度，均应当以能够达到上述目的为度——在这种情况下，其反应时间通常为12～24小时；
反应结束后，除去二氯甲烷和多余草酰氯，得3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品；
最后，或将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品提纯以备用，或直接用所述粗品为原料去制备熊果酸衍生物。
为本领域技术人员能够更加清楚地理解本发明，再按照步骤（1）、（2）、（3）顺序，将各步骤的反应式披露如下。
步骤（1）：
。
步骤（2）：
。
步骤（3）：
；
或者：
。
本发明通过了实验室的试验验证。制备两种熊果酸衍生物的方法及步骤与本具体实施方式的步骤相同。验证时，首先用核磁共振仪分别测试了两种熊果酸衍生物的1HNMR和13CNMR谱图。
3β-乙酰氧基-熊果烷-12烯-28-酰（8’-氨基辛酸）的1HNMR和13CNMR如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ0.77(3H, s); 0.87(9H, s) ; 0.95(6H, s); 1.06(3H, s); (7×CH3); 2.05(3H, s, CH3CO); 2.33(2H,t, J=7.2Hz H-7’); 2.99(1H, m, Ha-1’); 3.33(1H, m, Hb-1’); 4.50(1H,t,H-3); 5.30(1H, H-12); 5.92(1H, t-like, NH)。
13CNMR(100MHz,CDCl3)：
δ178.2(C-28), 171.0(-COOH), 140.0(C-13), 125.4(C-12), 80.8(C-3)。
3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（4’-氨基丁醇）的1HNMR和13CNMR如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ0.78(3H, s); 0.85(9H, s) ; 0.95(6H, s); 1.07(3H, s); (7×CH3); 2.01(3H, s, CH3CO); 3.01(1H, m, Ha-1’); 3.41(1H, m, Hb-1’); 3.67(2H,t, H-3’); 4.49(1H,t,H-3); 5.31(1H, H-12); 6.02(1H, NH)。
13CNMR(100MHz,CDCl3)：
δ178.2(C-28), 171.0(CH3CO), 139.9(C-13), 125.4(C-12), 80.8(C-3), 62.2(-CH2OH)。
从上述1HNMR和13CNMR中可知两个化合物的结构为我们所需的目标化合物结构。
然后，采用MTT［3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝］染色法，针对人体白血病U937细胞增殖的抑制结果，用制得的两种熊果酸衍生物与熊果酸进行了对比验证。验证结果见下表的：
从验证表中的抑制率可以看出，本发明的两种熊果酸衍生物在抑制人体白血病U937细胞增殖方面，几种浓度的效果均优于熊果酸；尤其从浓度为10μmol的3β-乙酰氧基-熊果烷-12烯-28-酰（8’-氨基辛酸）比浓度为20μmol的熊果酸的抑制率还高的这一对比中可以看出，在人体白血病U937细胞增殖较严重的情况下，用本发明的熊果酸衍生物能够取得比熊果酸更快、更好的抑制效果；在人体白血病U937细胞增殖不很严重的情况下，本发明的熊果酸衍生物的实际用量能够取得比熊果酸更少，进而又可节省治疗成本。