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1、(10)申请公布号 CN 102041250 A (43)申请公布日 2011.05.04 CN 102041250 A *CN102041250A* (21)申请号 200910153355.3 (22)申请日 2009.10.19 C12N 9/42(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (71)申请人 湖州礼来生物技术有限公司 地址 313100 浙江省湖州市八里店镇曹报村 D 幢 申请人 吴菁 (72)发明人 吴菁 史利斌 (54) 发明名称 一种黑曲霉产木聚糖酶方法 (57) 摘要 本发明提供了一种新的木聚糖酶生产方 法， 其步骤包括 ： 配置营养盐液、 配置液体。
2、种子 培养基， 将产孢子培养基上的黑曲霉按 2接种 量接种于种子培养基， 培养 3-4 天。然后配置 液体发酵培养基 ( 玉米芯 2， (NH4)2SO4 1， KH2PO40.13， CaCl2 0.025， MgSO47H2O 0.05， FeSO47H2O 0.008， ZnSO47H2O 0.003)。 将种子培养基菌种按25的接种量接 种于液体发酵培养基， 再加入 2的麸皮、 1的 酵母膏、 0.5的吐温， 调节 pH 为 5.0， 温度 28， 于 150r/min 放于恒温振荡培养箱中培养 72h。所 得发酵液4000r/min离心分离10min， 过滤得上清 液， 即为粗酶液，。
3、 经 (NH4)2SO4分级沉淀纯化后， 再 经 2 次葡聚糖凝胶柱层析。最后干燥后得木聚糖 酶粉末。本发明提供了一种新的木聚糖酶生产方 法， 利用该法生产木聚糖酶生产工艺简单， 操作方 便， 原料易得， 生产成本低， 无污染， 适于大规模工 业化生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 CN 102041253 A1/1 页 2 1. 一种黑曲霉产木聚糖酶方法， 其特征包括以下几个步骤 ： (1) 配制营养盐液 取 1000ml 烧杯加入 14g(NH4)SO4， 20g KH2PO4， 4g CaCl22。
4、H2O， 1.5gMgSO4搅拌均匀， 放 于 4冰箱中保藏。 (2) 黑曲霉菌种保藏 黑曲霉X-1接种在马铃薯、 葡萄糖、 琼脂的试管斜面上， 在30恒温箱中培养7天后， 于 冰箱内 4以下保藏。 (3) 黑曲霉的选育及培养 将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌接种到产孢子培养基上， 于 28下放入恒温培养箱中 培养 4-5d。 (4) 黑曲霉种子培养基配置 取葡萄糖 30g， 玉米浆 10g， 营养盐 100g， 配置 1000ml 营养液。 (5) 黑曲霉接种培养 将产孢子培养基上的菌种按 2的接种量接种于种子培养基， 30、 180r/min 放于恒 温振荡培养箱中培养 3-4 天。 (6) 。
5、产酶基础培养基制备 配置液体发酵培养基 ： 加入玉米芯 2， (NH4)2SO4 1， KH2PO4 0.13， CaCl20.025， MgSO47H2O 0.05， FeSO47H2O 0.008， ZnSO47H2O 0.003。 (7) 接种发酵培养 将种子培养基菌种按 25的接种量接种于液体发酵培养基， 再加入 2的麸皮、 1的 酵母膏、 0.5的吐温， 调节 PH 为 5.0， 温度 28， 于 150r/min 放于恒温振荡培养箱中培养 72h。 (8) 盐析分离 将发酵液 4000r/min 离心分离 10min， 过滤得上清液， 即为粗酶液， 粗酶液经 20饱和 硫酸铵沉淀，。
6、 纯化倍数为 3.0 倍。追加硫酸铵饱和度至 60， 纯化倍数为 5.9 倍 . 在 4静 至 12h 后， 取上清液。 (9) 凝胶过滤提取木聚糖酶 经硫酸铵分级沉淀后的酶样经 SephadexG-25 葡聚糖凝胶柱层析， 再经 SephadexG-100 葡聚糖凝胶柱层析， 干燥后得木聚糖酶粉末。 2. 如权利要求 (2) 所诉， 其特征在于所用的试管斜面培养基为 PDA 斜面培养基。 3. 如权利要求 (7) 所诉， 其特征在于加 2麸皮为碳源时发酵效果最好。 4. 如权利要求 (7) 所诉， 其特征在于加 1酵母膏为氮源时产酶效果最佳。 5. 如权利要求 (7) 所诉， 其特征在于添加。
7、 0.5的吐温对黑曲霉产木聚糖酶促进作用 最佳。 6. 如权利要求 (8) 所诉， 其特征在于用质量分数为 60的 (NH4)2SO4盐析效果最佳。 权 利 要 求 书 CN 102041250 A CN 102041253 A1/2 页 3 一种黑曲霉产木聚糖酶方法 一、 技术领域 0001 本发明提供了一种新的木聚糖酶的制备方法， 涉及微生物发酵法生产木聚糖酶。 二、 技术背景 0002 木聚糖 (xylan) 是一种多聚五碳糖， 是半纤维素的重要组成部分， 广泛存在于植 物界。许多谷物饲粮中存在的木聚糖是阻碍营养物质消化的抗营养因子， 随着农业生产力 水平的提高， 小麦产量大幅度增加， 。
8、已远远超出作为食用粮的需要。从经济角度来看， 就地 转化用作饲料比较合算， 但是包括小麦在内的谷物中都含有多种抗营养因子。有关资料表 明小麦中的抗营养因子主要是木聚糖， 此外还有少量的 - 葡聚糖。这两类聚合物具有增 加食糜粘度、 降低动物采食量、 抑制生长以及防碍养分消化吸收等抗营养作用， 使饲料消化 利用率大大降低。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称， 它可以 将木聚糖降解为寡聚木糖、 木糖和少量单糖。 在饲料中添加木聚糖酶， 可显著降低阿拉伯木 聚糖分子的大小， 将其分解成较小聚合度的低聚木糖， 从而改善饲料性能。 如果在造纸时添 加木聚糖酶则可以使木质素的提取变得更。
9、容易， 同时保留纤维素成分， 又可在随后的工艺 中减少氯的浓度， 降低有机卤素的水平， 达到既环保又经济的目的。在食品业中， 如果在饮 料中添加一定量的低聚木糖， 可以提高饮料的稳定性。 在其他工业中， 木聚糖酶也都显示出 了广阔的应用前景。因此， 木聚糖酶制剂的开发和研究已受到世界各国科学工作者的广泛 关注。 0003 我国是农业大国， 每年都会生产大量农业脚料如秸秆、 玉米芯、 稻壳等， 绝大部分 因为难以利用仅作为农家燃料。这些物质中都含有大量的木聚糖， 若利用木聚糖酶将其转 化为低聚木糖， 既可处理农业废料， 变废为宝， 保护环境， 又可促进我国低聚糖工业的发展， 因此对木聚糖酶制剂的。
10、研究将具有十分可观的社会效益和经济效益。 三、 发明内容 0004 1. 黑曲霉产木聚糖酶， 其特征包括以下几个步骤 ： 0005 (1) 配制营养盐液 0006 取 1000ml 烧杯加入 14g(NH4)2SO4， 20g KH2PO4， 4g CaCl22H2O， 1.5gMgSO4搅拌均 匀， 放于 4冰箱中保藏。 0007 (2) 黑曲霉菌种保藏 0008 黑曲霉 X-1 接种在马铃薯、 葡萄糖、 琼脂的试管斜面上， 在 30恒温箱中培养 7 天 后， 于冰箱内 4以下保藏。 0009 (3) 黑曲霉的选育及培养 0010 将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌接种到产孢子培养基上， 于 28。
11、下放入恒温培养 箱中培养 4-5d。 0011 (4) 黑曲霉种子培养基配置 0012 取葡萄糖 30g， 玉米浆 10g， 营养盐 100g， 配置 1000ml 营养液。 说 明 书 CN 102041250 A CN 102041253 A2/2 页 4 0013 (5) 黑曲霉接种培养 0014 将产孢子培养基上的菌种按 2的接种量接种于种子培养基， 30、 180r/min 放 于恒温振荡培养箱中培养 3-4 天。 0015 (6) 产酶基础培养基制备 0016 配 置 液 体 发 酵 培 养 基 ： 加 入 玉 米 芯 2 ， (NH4)2SO41 ， KH2PO40.13 ， C。
12、aCl20.025， MgSO47H2O 0.05， FeSO47H2O 0.008， ZnSO47H2O 0.003。 0017 (7) 接种发酵培养 0018 将种子培养基菌种按 25的接种量接种于液体发酵培养基， 再加入 2的麸皮、 1的酵母膏、 0.5的吐温， 调节 PH 为 5.0， 温度 28， 于 150r/min 放于恒温振荡培养箱中 培养 72h。 0019 (8) 盐析分离 0020 将发酵液 4000r/min 离心分离 10min， 过滤得上清液， 即为粗酶液， 粗酶液经 20 饱和硫酸铵沉淀， 纯化倍数为 3.0 倍。追加硫酸铵饱和度至 60， 纯化倍数为 5.9 倍 . 在 4静至 12h 后， 取上清液。 0021 (9) 凝胶过滤提取木聚糖酶 0022 经 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 后 的 酶 样 经 SephadexG-25 葡 聚 糖 凝 胶 柱 层 析， 再 经 SephadexG-100 葡聚糖凝胶柱层析， 干燥后得木聚糖酶粉末。 0023 本发明提供了一种新的木聚糖酶生产方法， 利用该法生产木聚糖酶生产工艺简 单， 操作方便， 原料易得， 生产成本低， 适于大规模工业化生产。 说 明 书 CN 102041250 A 。