一种检测黑曲霉的DNA探针、基因芯片及其应用.pdf

《一种检测黑曲霉的DNA探针、基因芯片及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种检测黑曲霉的DNA探针、基因芯片及其应用.pdf（12页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102031299 A (43)申请公布日 2011.04.27 CN 102031299 A *CN102031299A* (21)申请号 201010258305.4 (22)申请日 2010.08.18 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 李国辉 地址 025150 内蒙古自治区赤峰市大板镇索 博日嘎街政安小区一号楼 3-401 (72)发明人 李国辉 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 冯琼 李玉秋 (54) 发明名称 一种检测。

2、黑曲霉的 DNA 探针、 基因芯片及其 应用 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 公开了一种检测 黑曲霉的DNA探针。 本发明所述检测黑曲霉的DNA 探针具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列， 其检测黑曲霉特异性强， 灵敏度高达 0.04ng。本 发明还提供包含所述 DNA 探针的基因芯片。采用 本发明所述基因芯片可实现对可能含黑曲霉的样 品的高通量、 自动化及快速检测， 特异性强， 可保 证检测结果的精确性， 具有广泛的应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 1。

3、 页 CN 102031302 A1/1 页 2 1. 一种用于检测黑曲霉的 DNA 探针， 具有 SEQ ID No.1 所示序列。 2. 一种用于黑曲霉检测的基因芯片， 通过将寡核苷酸探针固定在固相载体表面形成， 其特征在于， 所述寡核苷酸探针包含权利要求 1 所述 DNA 探针。 3. 根据权利要求 2 所述的基因芯片， 其特征在于， 所述固相载体选自硝酸纤维素膜、 尼 龙膜、 聚苯乙烯、 玻璃片、 硅片、 微粒和塑料片。 4.根据权利要求2或3所述的基因芯片， 其特征在于， 所述寡核苷酸探针还包括阳性对 照探针、 阴性对照探针。 5.根据权利要求4所述的基因芯片， 其特征在于， 所述阳。

4、性对照探针如SEQ ID No.4所 示。 6.根据权利要求4所述的基因芯片， 其特征在于， 所述阴性对照探针如SEQ ID No.5所 示。 7. 一种用于检测黑曲霉的试剂盒， 包含权利要求 1 所述 DNA 探针。 8. 一种对可能含黑曲霉的样品进行检测的方法， 包含以下步骤 ： 步骤 1 ： 提取并扩增样品的核酸序列， 所述扩增将信标分子标记到扩增产物 ； 步骤 2 ： 取步骤 1 所得扩增产物与固定于权利要求 2-6 任一项所述基因芯片上的探针 进行杂交 ； 步骤 3 ： 根据所述信标分子采用相应的检测方法对基因芯片进行扫描分析。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 步。

5、骤 1 所述扩增步骤的引物具有序列表 SEQ ID No.2 或 SEQ ID No.3 所示的序列。 10. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 所述信标分子可以为荧光素或同位素， 所述荧光素包括 Cy3、 Cy5、 异硫氰酸荧光素、 德克萨斯红 ； 所述同位素包括 32P。 权 利 要 求 书 CN 102031299 A CN 102031302 A1/7 页 3 一种检测黑曲霉的 DNA 探针、 基因芯片及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种检测黑曲霉的 DNA 探针、 基因芯片及其 应用。 背景技术 0002 侵袭性真菌感染是真菌入侵人体而导致。

6、血液感染、 各个脏器感染或全身播散的严 重感染。近 20 年来侵袭性真菌感染的发病呈明显增长趋势， 这与大量应用广谱抗生素、 抗 癌放疗、 化疗以及其他免疫抑制剂、 类固醇药物、 器官移植、 静脉插管和各种侵袭性操作有 关。 0003 侵袭性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌属、 曲霉属、 隐球菌属等条件致病真菌， 还有组织胞浆菌、 皮炎芽生菌、 孢子丝菌等地方流行性致病真菌。不同环境下， 感染的真菌 种类不同。侵袭性真菌感染早期没有特异性表现， 所以很容易被掩盖， 病死率很高。 0004 目前临床常用的检测真菌的技术主要有 ： 0005 ( 一 ) 镜检及培养、 鉴定 ： 如六胺银染色、 PAS。

7、 染色、 银氨 G-S 染色法、 10 KOH 法 以及真菌培养法是临床最常用的鉴定手段， 但直接镜检特异性差、 敏感性不足， 不能鉴定出 真菌种类。 真菌培养虽能鉴定真菌种类， 但培养条件苛刻， 培养时间长， 假阴性高， 敏感性不 足， 无法辅助临床治疗。 0006 ( 二 ) 免疫学方法 ： 免疫学方法的基本原理是利用抗原与抗体的特异结合， 来达到 相互间的特异探察。该法主要用于检测真菌的抗原、 抗体、 代谢产物及细胞成分。能根据真 菌抗原性的不同将真菌分类。但抗体的特异性限制了该项技术的发展。 0007 免疫组化、 酶联免疫吸附试验、 免疫印迹法及凝集反应都是基于免疫学方法检测 真菌的手。

8、段， 但目前广泛应用于临床的仅有 G 试验， G 试验检测的是真菌的细胞壁成分 ： (1， 3)-D- 葡聚糖， 人体的吞噬细胞吞噬真菌后， 能持续释放该物质， 使血液及体液中含量 增高 ( 浅部真菌感染无类似现象 )。适用于除隐球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早 期诊断， 尤其是念珠菌和曲霉菌， 但不能确定菌种。临床应用中发现有诸多假阳性可能， 例 如 ： 0008 (1) 使用纤维素膜进行血透标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料 ； 0009 (2) 静脉输注免疫球蛋白、 白蛋白、 凝血因子或血液制品 ； 0010 (3) 链球菌血症 ； 0011 (4) 操作者处理标本时存在污染。

9、。 0012 另外， 使用多糖类抗癌药物、 放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植 的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。 0013 ( 三 ) 分子生物学技术 ： 0014 包括原位杂交、 聚合酶链反应、 DNA 中 G+C mol含量测定、 随机扩增多态性 DNA(RAPD) 分析、 限制性内切酶多态性分析 (RFLP) 等， 但上述技术均耗时耗力， 不具有高通 量的特点， 不能用少量的样本快速同时检测多种可能存在的真菌， 因此多局限于实验室研 说 明 书 CN 102031299 A CN 102031302 A2/7 页 4 究， 尚不能真正应用于临床。 发明内容 0015。

10、 本发明的目的是提供一种检测黑曲霉的 DNA 探针， 具有 SEQ IDNo.1 所示序列， 其 与黑曲霉 DNA 特异性结合， 检测黑曲霉灵敏度高。 0016 本发明所述DNA探针可广泛应用于生物学、 医学领域， 如与以PCR技术为基础的核 酸杂交技术结合， 进行生物学分析或临床诊断。 0017 本发明结合基因芯片技术， 可实现小样本、 高通量、 特异、 快速、 自动化检测黑曲霉 的目的。本发明提供的一种用于真菌检测的基因芯片， 通过将特异性寡核苷酸探针固定在 固相载体表面形成， 所述寡核苷酸探针包含具有 SEQ ID No.1 所示序列的 DNA 探针。探针、 引物与真菌目的基因之间的关系。

11、如表 1 所示。 0018 表 1. 本发明所述基因芯片所使用的引物及探针 0019 0020 作为优选， 所述固相载体选自硝酸纤维素膜、 尼龙膜、 聚苯乙烯、 玻璃片、 硅片、 微 粒和塑料片。 0021 本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料， 包括 但不限于硝酸纤维素膜、 尼龙膜、 聚丙乙烯、 玻璃片、 硅片、 微粒和塑料片。所述的固相载体 经不同的化学修饰后， 在其表面带有可以固定核酸分子的活性基团， 这些基团包括但不限 于氨基 (-NH2)、 醛基 (-CHO)、 羧基 (-COOH) 和巯基 (-SH)。 0022 本发明所述基因芯片在所述固相载体上连接针。

12、对黑曲霉的特异性核酸探针， 所述 探针可以为单链或双链 DNA 分子， 其在适当的条件下可以与黑曲霉基因特异性杂交。所述 探针可以通过 DNA 自动合成或 PCR 扩增而获得。所述探针在其与载体连接的一端可以选择 性地添加一个目的在于增加探针的空间活动性以利于杂交的连接臂。 0023 本发明所述基因芯片的制备， 是将所述核酸探针有序地点样到载体上， 通过核酸 探针末端修饰的活性基团与载体表面相应的活性基团反应， 形成共价连接， 将探针固定于 载体上， 从而制成基因芯片。 同时， 在本发明所述基因芯片上， 按序与不同样品杂交后， 通过 对所捕获阳性信号的寻址即可明确对应的样品中是否有黑曲霉的存在。

13、。 0024 作为优选， 所述固相载体表面还固定有阳性对照探针、 阴性对照探针。 0025 更优选地， 所述阳性对照探针其序列如SEQ ID No.4所示， 其与阳性对照样品特异 说 明 书 CN 102031299 A CN 102031302 A3/7 页 5 性结合， 阳性对照样品片段序列如SEQ ID No.6所示， 其中与阳性对照探针结合部位的序列 为 CCCATGGGTCTTGTCTGGA。 0026 更优选地， 所述阴性对照探针， 其序列如 SEQ ID No.5 所示。 0027 本发明还提供一种用于检测黑曲霉的试剂盒， 包含 ： 与黑曲霉特异性结合的探针， 所述探针具有序列表。

14、 SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列中。本发明所述试剂盒优选还包含用 于对真菌基因扩增的引物， 其具有序列表 SEQ ID No.2 或 SEQ ID No.3 所示的序列。 0028 本发明还提供一种对可能含黑曲霉的样品进行检测的方法， 包含以下步骤 ： 0029 步骤 1 ： 提取并扩增样品的核酸序列， 所述扩增将信标分子标记到扩增产物 ； 0030 步骤 2 ： 取步骤 1 所得扩增产物与固定于所述基因芯片上的探针进行杂交 ； 0031 步骤 3 ： 根据所述信标分子采用相应的检测方法对基因芯片进行扫描分析。 0032 作为优选， 步骤 1 扩增步骤所用的 5 引物为真菌 18Sr。

15、RNA 通用引物， 具有序列表 SEQ ID No.2 所示序列， 3 引物为真菌 28SrRNA 通用引物， 具有 SEQ ID No.3 所示的序列。 0033 在所述的样品标记过程中， 可以利用本领域已知各种核酸标记方法使标本中的目 的基因标记信标分子， 所述方法包括但不限于， PCR、 RT-PCR、 体外转录、 随机引物标记、 缺口 平移以及末端转移标记等方法。所述信标分子可以为荧光素或同位素 ； 所述荧光素包括但 不限于， Cy3、 Cy5、 异硫氰酸荧光素、 德克萨斯红 ； 所述同位素包括但不限于 32P。 0034 在适当的温度和离子强度条件下， 将所述标记产物与本发明所述基因。

16、芯片进行杂 交。 杂交条件和方法是本领域已知的。 杂交后， 根据所选用的信标分子采用相应的检测方法 对基因芯片进行扫描分析， 根据所捕获的阳性信号寻址， 判断所述标本中是否含有黑曲霉。 0035 本发明采用黑曲霉特异性寡核苷酸作为探针， 在真菌检测过程中利用真菌通用引 物对样品中真菌基因扩增进行标记。 本发明所述基因芯片连接的探针和扩增所用的真菌通 用引物列于表 1 中。需要说明的是， 本发明所采用的寡核苷酸探针和真菌通用引物也可以 用于对目的基因的普通 PCR 扩增， 而扩增的 PCR 产物同样可以作为探针按照所述方法制备 真菌检测基因芯片， 因此所述 PCR 产物作为探针所制备的基因芯片也。

17、在本发明的保护范围 之内。 0036 分子生物学技术应用于真菌研究已显示出多方面的优点， 医学真菌研究已逐渐形 成了以基因分析为基础的鉴定和分类系统。我们基于分子生物学技术， 利用芯片的高通量 平台， 设计完善了基于基因芯片特异性诊断黑曲霉感染的技术。 0037 本发明所述 DNA 探针特异性强， 灵敏度高， 样品中含有 2-3CFU 以上黑曲霉经检测 即可见阳性信号， 黑曲霉 PCR 产物达 0.04ng 以上即可被检测出来。 0038 本发明所述基因芯片以及利用所述基因芯片进行样品检测的方法所需样本量少， 反应体积小， 试剂消耗少， 可实现样品的高通量、 自动化及快速检测， 分析过程客观，。

18、 特异性 强， 通过本方法检测出的结果与分离培养或测序比对结果的一致率达 100， 保证了检测结 果的精确性， 适于应用于临床。 附图说明 ： 0039 图 1 示本发明所述基因芯片与黑曲霉菌株杂交的检测结果 ； 0040 图 2 示不同数量黑曲霉孢子提取的 DNA 与本发明所述基因芯片杂交的检测结果 ； 0041 图 3 示不同剂量黑曲霉 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果。 说 明 书 CN 102031299 A CN 102031302 A4/7 页 6 具体实施方式 ： 0042 本发明公开了一种检测黑曲霉的 DNA 探针、 基因芯片及其应用， 本领域技术人员 可以借鉴本文内容， 适当。

19、改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已 经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本 文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0043 实施例 1 ： DNA 的提取 0044 可按照本领域常规方法进行提取， 样本可以为新鲜组织、 血液、 尿液、 脑脊液、 分泌 物(痰液、 胸水、 腹水、 肺泡灌洗液等)等。 在本实施例中使用Qiagen微量DNA提取试剂盒， 以新鲜组织为例 ： 0045 (1) 将新鲜组织放入高温灭菌。

20、的研钵中， 倒入液氮后研碎， 将研碎的组织移入 1.5ml 的 EP 管中 ； 0046 (2) 加入 1ml 生理盐水冲洗， 离心 3000rpm 5min， 弃上清 ； 0047 (3) 加入 200l NaOH(50mM)， 95孵育 10min， 离心 5000rpm10min， 弃上清 ； 0048 (4) 加入 500l Lyticase 溶壁酶溶液， 37孵育 30min ； 0049 (5) 离心 14000rpm 10min， 弃上清 ； 0050 (6) 迅速加 180l ATL 和 20l 蛋白酶 K 55 15min ； 0051 (7) 加 100l AL， 震荡 1。

21、5s. 充分混匀。70 10min(100l AL 缓冲液中加 1g 载体 RNA) ； 0052 (8)50l 乙醇 (96-100 ) 震荡 15s. 室温 5min(15-25 ) ； 0053 (9) 短暂离心 ； 0054 (10) 小心将所有溶胞产物移至柱， 避免沾湿管壁， 移液器勿触及膜， 离心 6000g(8000rpm)1min. 将柱子放进 2ml 收集管， 弃收集管。若溶胞产物未完全通过膜， 再次 用更高转速离心直至柱子空 ； (11) 往柱子里加 500l AW1( 摇匀 )， 避免沾湿管壁。离心 6000g(8000rpm)1min. 将柱子放进 2ml 收集管， 弃。

22、收集管 ； 0055 (12) 往柱子里加 500l AW2， 避免沾湿管壁。离心 6000g(8000rpm)1min. 将柱子 放进 2ml 收集管， 弃收集管 ； 0056 (13)14,000rpm， 3min 使膜完全干燥， 确保没有乙醇 ； 0057 (14) 将柱子置于 1.5ml 离心管， 弃收集管。加 20-100l AE 蒸馏水 (PH 大于 7) 于膜中央。 0058 (15) 室温 (15-25 )1min. 0059 (16) 将柱子置于收集管上， 20,000g(14,000rpm) 离心 1min， 将收集管内液体保存 备用。 0060 实施例 2 ： 样品的 P。

23、CR 扩增 0061 PCR 反应体系 ： PCR 反应总体积为 25l， 含模板 DNA( 黑曲霉， 烟曲霉， 黄曲霉， 土 曲霉， 构巢曲霉， 乳酒念珠菌， 皱褶念珠菌， 阿萨希毛孢子菌， 少根根霉， 小孢根霉， 微小根毛 霉， 伞状犁头霉， 白念珠菌， 克柔念珠菌， 光滑念珠菌， 热带念珠菌， 近平滑念珠菌， 季也蒙 念珠菌， 都柏林念珠菌或新生隐球菌 DNA)5l， 10Buffer2.5l， 2.5mM dNTP 1.25l， 说 明 书 CN 102031299 A CN 102031302 A5/7 页 7 25mM MgCl2 3l， 引物 ITS1、 ITS4 50pmol 。

24、各 0.25l， Hotstart Taq 酶 (5U/l)0.1l， 补超纯水至 25l。 0062 PCR 反应条件 ： 95 15 分钟， 扩增变性、 退火、 延伸的条件分别为 94变性 30 秒， 60退火 30 秒， 72延伸 1 分钟， 35 个循环， 最后 72延伸 10 分钟。取 8l PCR 产物于 1.5的琼脂糖中电泳 30 分钟， 电泳后染色 30 分钟， 于凝胶成像系统照相。剩余的 PCR 产 物用于杂交 (5l PCR 产物即可 )。 0063 实施例 3 ： 探针的标记以及基因芯片的制备 0064 (1) 用 0.5M NaHCO3(PH 8.4) 稀释本发明所述探。

25、针至适宜浓度， 取 4ul 探针溶液 入微孔板中， 每孔加入 4ul 点样液， 充分混匀， 空白对照为等量上述 NaHCO3与点样液的混合 液。 0065 (2) 将 BiodyneC 尼龙膜裁剪至合适大小。 0066 (3) 室温下， 16 w/v EDAC 孵育 Biodyne C 尼龙膜 10 分钟。 0067 (4) 去离子水漂洗 Biodyne C 尼龙膜 1 分钟。 0068 (5) 用滤纸吸干尼龙膜。 0069 (6) 用点样仪取探针溶液及空白对照溶液点样于制备好的尼龙膜上。 0070 (7) 室温下孵育 5 分钟。 0071 (8) 吸除尼龙膜表面液体， 将尼龙膜放入 0.1M。

26、 NaOH 液中灭活 9 分钟。 0072 (9) 在摇床中用 100ml 2SSPE 漂洗 Biodyne C 尼龙膜 5 分钟。 0073 (10) 在摇床中用 60 2SSPE/0.5 SDS 液漂洗 Biodyne C 尼龙膜 5 分钟。 0074 (11) 于室温下在摇床中用 200ml 20mM EDTA 液清洗 Biodyne C 尼龙膜 20 分钟。 0075 (12) 将 Biodyne C 尼龙膜放入洁净的塑料袋中， 并加入 10ml 的 EDTA， 密封保存于 4冰箱中， 备用。 0076 实施例 4 ： 利用本发明所述探针进行样品的检测 0077 使用链亲和素-过氧化物。

27、酶(Roche Diagnostics Co.)用2SSPE(SSPE is 0.18M NaCl， 10mM NaH2PO4， 和1mM EDTApH 7.7-0.5SDS)14,000稀释 ； 杂交温度为60； 胶 片 (Hyperfilm ； Amersham) 的曝光时间为 2 分钟。具体步骤如下 ： 0078 (1) 取 5l PCR 扩增产物、 与 1l 阳性对照片段 ( 序列如 SEQ IDNo.6 所示 ) 样 本同时加入 150l 2SSPE/0.1 SDS 混匀， 加入 EP 管中。 0079 (2)99加热 10 分钟， 然后将 EP 管迅速放置于冰上至少 5 分钟。 0。

28、080 (3) 在杂交箱中用 250ml 60的 2SSPE/0.1 SDS 液体摇动漂洗已标记了探针 的 Biodyne C 尼龙膜 5 分钟。 0081 (4) 吸除尼龙膜表面液体。 0082 (5) 用自制模具加入经 2SSPE/0.1 SDS 溶液稀释后的 PCR 扩增产物 150l 于 对应位置。 0083 (6) 在杂交箱中， 60杂交 60 分钟。 0084 (7)用250ml 602SSPE/0.5SDS溶液于摇床中洗Biodyne C尼龙膜两次， 每 次 10 分钟。 0085 (8) 加入 15ml 2SSPE/0.5 SDS 和 1/5000 链亲和素 - 过氧化物酶结合。

29、物混合 液， 42孵育 45 分钟。 说 明 书 CN 102031299 A CN 102031302 A6/7 页 8 0086 (9)用250ml 422SSPE/0.5SDS液于摇床中洗Biodyne C尼龙膜两次， 每次 10 分钟。 0087 (10)室温下用250ml 2SSPE液在摇床中洗Biodyne C尼龙膜两次， 每次5分钟。 0088 (11) 加入 20ml ECL 显影剂于 Biodyne C 尼龙膜上， 室温孵育 1 分钟。 0089 (12) 将 Biodyne C 尼龙膜放入暗盒中。 0090 (13) 在暗盒中放入 X 光片， 曝光， 洗片， 观察结果。 0。

30、091 (14) 将 Biodyne C 尼龙膜用 80 250ml 1 SDS 液摇动漂洗两次， 每次 30 分钟。 0092 (15) 再用 200ml 20mM EDTA 液于摇床中清洗 Biodyne C 尼龙膜 15 分钟。 0093 (16) 将 Biodyne C 尼龙膜放入洁净的塑料袋中， 并加入 10ml 的 EDTA， 密封 4保 存备用。 0094 实施例 5 ： 结果的判定 0095 在探针对应的底片位置上， 出现黑点， 表示结果为阳性。 无黑点， 表示结果为阴性。 0096 图 1 示按照实施例 1-4 制备的标记了本发明探针的基因芯片杂交结果。基因芯片 上标记的探针。

31、的顺序为 ： 1 阳性对照 ( 如 SEQ ID No.4 所示 )， 2 阴性对照 ( 如 SEQ ID No.5 所示 )， 3 空白对照， 4-23 本发明所述探针 ； 0097 菌株 PCR 产物杂交顺序 ： 1-4 黑曲霉， 5 烟曲霉， 6 黄曲霉， 7 土曲霉， 8 构巢曲霉， 9 乳酒念珠菌， 10皱褶念珠菌， 11阿萨希毛孢子菌， 12少根根霉， 13小孢根霉， 14微小根毛霉， 15 伞状犁头霉， 16 白念珠菌， 17 克柔念珠菌， 18 光滑念珠菌， 19 热带念珠菌， 20 近平滑念珠 菌， 21 季也蒙念珠菌， 22 都柏林念珠菌， 23 新生隐球菌。 0098 从。

32、图1可见， 本发明所述特异性探针仅仅与黑曲霉的PCR产物杂交， 未与其它真菌 PCR 产物发生非特异性杂交， 证实其与黑曲霉结合特异性强。 0099 实施例 6 ： 灵敏度及重复性检测 0100 不同数量黑曲霉孢子提取 DNA 后， 经本发明所述基因芯片检测， 结果如图 2 所 示， 1-2.5ng( 相 当 于 100CFU)， 2-1.25ng( 相 当 于 50CFU)， 3-0.63ng( 相 当 于 25CFU)， 4-0.31ng( 相 当 于 12.5CFU)， 5-0.15ng( 相 当 于 6CFU)， 6-0.08ng( 相 当 于 3CFU)， 7-0.04ng( 相当于。

33、 1.5CFU)， 8-0.02ng( 相当于 0.75CFU)， 9-0.01ng( 相当于 0.4CFU)。 0101 取不同剂量黑曲霉 PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 3 所示。Marker 为 750bp、 500bp， C 为 阴 性 对 照， 1-1103ng， 2-500ng， 3-250ng， 4-50ng， 5-5ng， 6-0.5ng， 7-0.05ng， 8-510-3ng。 0102 以上结果说明， 样品中含有 2-3CFU 以上黑曲霉经检测即可见阳性信号 ； 真菌 PCR 产物达 0.04ng 以上即可被检测出来。而利用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物时， 。

34、至少要 5ng 以上 PCR 产物进行电泳方可见肉眼所见条带。说明本发明所述检测方案的敏感性明显高于 单纯 PCR 检测。 0103 重复性检测 ： 本发明具有良好的重复性， 取 10 份阳性黑曲霉进行重复检测， 阳性 率达 100。 0104 实施例 8 ： 临床分离菌株检测结果 0105 检测自临床标本中分离培养的菌株， 利用本发明所述基因芯片检测出的结果经分 离培养或测序比对验证， 其检测结果一致率达 100， 结果见表 2。 0106 表 2. 本发明所述方法进行临床病例检测 说 明 书 CN 102031299 A CN 102031302 A7/7 页 9 0107 组织类型 疾病。

35、名称 真菌培养 涂片 测序比对 本发明方法 耳分泌物 耳道感染 - 可见真菌成分 黑曲霉 黑曲霉 耳分泌物 耳道感染 黑曲霉 可见真菌成分 - 黑曲霉 甲 甲癣 黑曲霉 可见真菌成分 - 黑曲霉 0108 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102031299 A CN 102031302 A1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102031299 A CN 102031302 A2/2 页 11 序 列 表 CN 102031299 A CN 102031302 A1/1 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102031299 A 。