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一种禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫双重PCR检测方法及应用.pdf

  • 上传人：小***
  • 文档编号：8898606
  • 上传时间：2021-01-10
  • 格式：PDF
  • 页数：14
  • 大小：919.55KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201510789990.6

    		 申请日：

    20151117
    公开号：

    CN105331704B

    		 公开日：

    20190104
    当前法律状态：

    		有效性：

    有效
    法律详情：

    IPC分类号：

    C12Q1/6888,C12Q1/686,C12N15/11

    		 主分类号：

    C12Q1/6888,C12Q1/686,C12N15/11
    申请人：

    南京农业大学
    发明人：

    王暄,李红梅,牛雯雯,陈云芳,李师默
    地址：

    211225 江苏省南京市溧水区白马镇国家农业科技园南京农业大学基地
    优先权：

    CN201510789990A
    专利代理机构：

    南京天华专利代理有限责任公司

    		 代理人：

    傅婷婷;徐冬涛
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    内容摘要

    本发明公开了一种用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测的引物组合物及其应用。所述检测引物包括：HaF8：SEQ ID NO.3，HfF9：SEQ ID NO.4，HafF8：SEQ ID NO.5。本发明利用双重PCR技术，单次反应同步检禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫，降低了对上述两种病原的检测成本和工作量。本发明建立了一种特异性强、灵敏度高、省时省力且易于操作的双重PCR检测体系，所述的引物组合物可在快速检测和/或鉴定禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫中应用。

    权利要求书

    1.一种用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测引物组合物，其特征在于：由以下引物组成：HaF8：SEQIDNO.3，HfF9：SEQIDNO.4，HafR8：SEQIDNO.5。 2.权利要求1所述的引物组合物在检测和/或鉴定禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫中的应用。 3.权利要求1所述的引物组合物在制备禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。 4.一种禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。 5.一种禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取待检样品DNA；(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的双重PCR引物组合物进行双重PCR扩增；(3)双重PCR扩增反应结束后按照以下方式观察结果：取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物为200bp条带时，表明待测样本为禾谷孢囊线虫，而扩增产物为320bp条带时为菲利普孢囊线虫，如同时出现上述两条扩增条带，表明待测样本中同时含有禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫。 6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述双重PCR扩增的反应体系为25μl，由1)引物混合液：HaF8为0.24μmol/L，HfF9为0.16μmol/L,HafR8为0.4μmol/L；2)反应混合液：0.2mmol/LdNTP，2mmol/LMgCl，1×ExTaqBuffer，5UExTaqDNA聚合酶；3)1μlDNA模板；4)灭菌双蒸馏水组成；其中各成分的浓度均表示在反应体系中的终浓度。 7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述双重PCR扩增的反应条件为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

    说明书

    技术领域

    本发明属于生物检测领域，涉及一种用于禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫双重PCR快速检测的引物组合物及其应用。

    背景技术

    禾谷类作物孢囊线虫(cereal cyst nematodes，CCN)是一类世界范围内危害小麦、大麦、燕麦等禾谷作物的重要病原线虫，该类线虫包括异皮线虫属多种植物寄生线虫[1]，其中分布最广、危害最重的主要是禾谷孢囊线虫(Heterodera arenaria)、菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)和麦类孢囊线虫(H.latipons)[2]。

    我国自1989年首次在湖北省天门县发现禾谷孢囊线虫以来[3]，迄今该病原物分布范围已达河南、河北、山东、江苏、安徽等16个省(市)[4]，部分省区重病田可减产50％以上，甚至绝收[5]。继禾谷孢囊线虫之后，2010年我国首次在河南省发现了菲利普孢囊线虫[6]。该线虫在俄罗斯、乌克兰、塔吉克斯坦等国家危害严重，可造成春小麦减产66％[7]，其发生危害同样给我国的小麦生产带来了严重的威胁此外，在我国黄淮麦区荥阳、保定、安阳有可能存在同一地区禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫复合发生的情况[8]。由于上述两种线虫对一些小麦品种会表现出不同的抗感反应[9]，因此快速准确的鉴定禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫的种类，以及明确其在田间单独或混合发生对于抗病品种的推广种植具有重要意义。

    目前，除了形态学鉴定方法之外，针对上述两种线虫的分别设计特异性引物的分子生物学鉴定技术也有报道[10-12]，但这些已建立的方法均特异性的只针对于禾谷孢囊线虫或菲利普孢囊线虫其中的一种，因此测定同一个未知样本时往往需要单独开展两次不同的鉴定，增加工作量的同时对样本的量也有一定的要求。李洪连等建立了禾谷孢囊线虫或菲利普孢囊线虫的实时荧光定量PCR检测体系[14]，但该技术的运用需要依赖于专业的定量PCR仪器以及对探针进行荧光标记处理，成本相对较高不利于推广应用，且该专利中引物设计靶点也与本发明不同，前者位于线虫rDNA基因高度保守序列5.8S区域，而本发明选择两种线虫之间遗传变异更为丰富的mtDNA-COI基因，从而确保引物具有更高的特异性。

    双重PCR(duplex PCR)能够在一个PCR反应体系里可同时检测两个不同的靶标片段，在病原物快速鉴定中具有极大的优势。双重PCR要求在同一反应体系中同时对不同的靶位点进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，不同引物之间是否形成二聚体、退火温度差、引物的配比、反应温度等不同参数均具有较高的要求，Toumi等等尝试将分别用于检测禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性引物混合，进行两种线虫的双重PCR检测，无法达到预期的检测效果，所用引物只能单独检测各自对应的孢囊线虫[13]。目前国内外尚未有利用双重PCR 技术检测禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的报道。

    发明内容

    本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种可以同时检测禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的引物组合物。

    本发明的另一目的是提供该引物组合物的应用。

    本发明的又一目的是提供检测禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫快速检测方法。

    本发明的目的可通过如下技术方案实现：

    一种用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR快速检测的引物组合物，由以下引物组成：HaF8：SEQ ID NO.3，HfF9：SEQ ID NO.4，HafR8：SEQ ID NO.5。

    本发明所述的引物组合物在检测和/或鉴定禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫中的应用。

    本发明所述的引物组合物在制备禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。

    一种禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫检测试剂，包含本发明所述的引物组合物。

    一种禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测方法，包括以下步骤：

    (1)提取待检样本DNA；

    (2)以提取的DNA为模板，利用本发明所述的引物组合物进行双重PCR扩增；

    (3)扩增反应结束按照以下方式观察结果：

    取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物为200bp条带时，表明待测样本为禾谷孢囊线虫，而扩增产物为320bp条带时为菲利普孢囊线虫，如同时出现上述两条扩增条带，表明待测样本中同时含有禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫。

    其中，步骤(2)所述双重PCR扩增的反应体系优选为25μl，由

    1)引物混合液：HaF8为0.24μmol/L，HfF9为0.16μmol/L，HafR8为0.4μmol/L；

    2)反应混合液：0.2mmol/L dNTP，2mmol/L MgCl2，1×ExTaq Buffer，5U Ex Taq DNA聚合酶；

    3)1μlDNA模板；

    4)灭菌双蒸馏水组成。其中各成分的浓度均表示在反应体系中的终浓度。

    步骤(2)所述双重PCR扩增的反应条件优选：

    94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

    有益效果：

    双重PCR由于在同一反应体系中添加两条以上的引物，不同引物之间形成多种二聚体从而影响PCR扩增效果，本发明通过扩增并比较不同线虫的mtDNA COI基因序列，设计不同的引物组合，经分析其G+C含量、二级结构、自由能等参数，最终筛选到一套特异性引物组合，并进一步通过优化反应体系及扩增温度，建立了能够同时检测禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR反应体系。

    (1)特异性强，不同于多数线虫特异性检测引物基于ITS、28S、5.8S等rDNA序列设计，本发明以mtDNA COI基因为扩增靶标，由于不同线虫COI基因变异度高于rDNA区序列，从而保证了本发明引物具有足够的特异性，克服了禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫长期以来的因序列相似度高而难以进行双重PCR分子检测的技术难题。

    (2)稳定性强，双重PCR体系中不同引物形成的复杂结构往往导致PCR扩增的不稳定性，本发明采用分别设计禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性上游引物各一条，两种线虫共用同一条下游引物的策略，从而减少了反应体系中不同种类引物的数量，有效的减少了引物二聚体对扩增的影响。

    (3)样本需求量小，本发明由于只需要通过一次PCR即可同时鉴定两种线虫，且引物灵敏度能够达到1/2000000孢囊，1/640条禾谷孢囊线虫幼虫、1/1280菲利普孢囊线虫，因此仅需要及少量的样本即可完成。

    (4)操作简单，对设备要求低，只要将全部引物按照比例添加到统一体系中即可，普通的PCR反应即可获得结果，不需要实时荧光定量PCR仪等高值设备。

    综上所述，本发明具有比现有的分别针对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫PCR鉴定技术检测效率高，特异性强，可应用高通量的禾谷类作物孢囊线虫的检测鉴定，具有实际的应用价值。

    附图说明

    图1为禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫双重PCR检测琼脂糖凝胶电泳图，

    M：DL2000DNA标准分子量(Takara)；1：菲利普孢囊线虫样本；2：禾谷孢囊线虫样本；3：禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫混合样本；4：ddH2O空白对照，无扩增产物。

    图2为双重PCR检测方法特异性鉴定琼脂糖凝胶电泳图，

    M：DL2000DNA标准分子量(Takara)；1：禾谷孢囊线虫；2：菲利普线虫；3：大麦孢囊线虫；4：大豆孢囊线虫；5：南方根结线虫；6：北方根结线虫；7：爪哇根结线虫；8：松材线虫；9：马铃薯腐烂茎线虫；10：水稻干尖线虫线虫；11：ddH2O空白对照；

    图3为双重PCR灵敏度检测结果

    A为双重PCR检测禾谷孢囊线虫孢囊电泳图，M：DL2000DNA标准分子量(Takara)，1-7分别为：1/20、1/20×10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6个孢囊；

    B为双重PCR检测菲利普孢囊线虫孢囊电泳图，M：DL2000DNA标准分子量(Takara)，1-7分别为：1/20、1/20×10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6个孢囊；

    C为双重PCR检测禾谷孢囊线虫二龄幼虫电泳图，M：DL2000DNA标准分子量(Takara)，1-7分别为：1/20、1/20×2-1、1/20×2-2、1/20×2-3、1/20×2-4、1/20×2-5、1/20×2-6条二龄幼虫；

    D为双重PCR检测菲利普孢囊线虫二龄幼虫电泳图，M：DL2000DNA标准分子量(Takara)，1-7分别为：1/20、1/20×2-1、1/20×2-2、1/20×2-3、1/20×2-4、1/20×2-5、1/20×2-6条二龄幼虫；

    图4采自我国黄淮麦区线虫发病田根/土样本禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫检测双重PCR检测结果电泳图，M：DL2000DNA标准分子量(Takara)，1-13为江苏、安徽、山东及山东不同麦区田间根/土样本双重PCR扩增结果，1-8号样本可见约200bp特异性条带，表明当地有禾谷孢囊线虫发生；9-11号样本可见约320bp特异性条带，表明当地危害小麦的为菲利普孢囊线虫；12、13号样本同时出现320bp和200bp两条带，表明当地同时发生上述两种线虫。

    具体实施方式

    下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

    所述试剂均为市售，主要试剂：ExTaq DNA聚合酶、DNA marker购自TaKaRa公司；引物由上海英俊生物技术有限公司合成；pGEM-T Easy Vector购于美国promega公司；

    实施例1禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫DNA的提取、mtDNA COI基因扩增及序列分析

    1.1禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫DNA的提取

    分别挑取不同两种线虫的单个成熟饱满孢囊，置于预先滴加20μL裂解缓冲液的载玻片上充分研碎，回收至PCR管中；在液氮中冷冻1min，65℃水浴2min，重复3次；最后65℃温育1.5h，95℃处理10min，14000r/min离心1min，取上清于作为线虫DNA模板直接用于COI基因扩增和双重PCR反应。

    1.2禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫mtDNA COI基因扩增及序列分析

    采用通用引物JB3(5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’，SEQ ID NO.6)和JB5(5’-AGACCTAAACTTAAAACATAATGAAAATG-3’，SEQ ID NO.7)分别扩增禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫COI基因。PCR扩增反应体系为10×Buffer(Mg2+free)2μl，10mmol/LdNTP 2μl，10mmol/LMgCl22μl，引物JB3和JB5(2.5μmol/L)各2μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA 5μl，灭菌ddH2O补足至25μl。PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，40个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观察并拍照，回收、克隆和测序如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，序列测定由上海英俊生物技术有限公司完成。

    实施例2禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测方法的建立

    2.1双重PCR引物设计

    根据禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫COI基因扩增后测序结果，并通过与其它植物寄生线虫已报道COI基因进行序列比对，设计并筛选禾谷孢囊线虫特异性上游引物HaF8、菲利普孢囊线虫特异性上游引物HfF9、两种线虫通用下游引物HafR8，引物交上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列如下：

    ①HaF8：5’-GCTCATCATATATTTGTTGTTGGT-3’(SEQ ID NO.3)；

    ②HfR9：5’-ATTTTGCCGGCATTTGGTCTGG-3’(SEQ ID NO.4)；

    ③HafR8：5’-CCCTTAAACCTCCAACAGTA-3’(SEQ ID NO.5)；

    2.2双重PCR反应体系配置：

    1)引物混合液：HaF8为0.24μmol/L，HfF9为0.16μmol/L，HafR8为0.4μmol/L；

    2)反应混合液：

    0.2mmol/L dNTP，2mmol/L MgCl2，1×ExTaq Buffer，5U Ex Taq DNA聚合酶，1μlDNA模板，加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

    2.3双重PCR反应扩增条件：

    94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

    取5μl扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照，禾谷孢囊线虫样本可看到约200bp的特异性条带，菲利普孢囊线虫样本可看到约320bp的特异性条带，两种线虫混合样本可同时看到上述两种条带(图1)。

    实施例3禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR特异性检测

    收集大麦孢囊线虫，大豆孢囊线虫，南方根结线虫，北方根结线虫，爪哇根结线虫，松材线虫，马铃薯腐烂茎线虫，水稻干尖线虫等植物寄生线虫，分别提取其DNA作为模板与禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫DNA模板一起分别进行PCR扩增，以检测双重PCR检测体系的特异性。

    上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按照2.3的反应条件进行，反应结束后取5μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照(如图2所示)，可看到第1泳道(禾谷孢囊线虫)可见约200bp的特异性条带，第2泳道(菲利普孢囊线虫)可见约320bp的特异性条带，其他泳道均未发现有扩增产物，结果表明上述双重PCR引物和反应体系在检测禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫时具有极高的特异性。

    实施例4禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR灵敏度检测

    1)分别将禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单个孢囊囊DNA溶于20μl裂解缓冲液中，取1μl做模板并按10倍梯度稀释成1/20×10-1～1/20×10-7个浓度，各取1μlDNA做模板；

    2)分别将禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单条二龄幼虫DNA溶于20μl裂解缓冲液中，取1μl做模板并按2倍梯度稀释成1/2×2-1～1/20×2-7个浓度，各取1μlDNA做模板；

    将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，按2.3反应条件进行，反应结束后取5μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照，可以看出无论是禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫，样本最大稀释到1/2000 000个孢囊时，均能够看到特异性扩增条(如图3中A、B所示)；而单条二龄幼虫禾谷孢囊线虫最大稀释640倍(如图3中C所示)，菲利普孢囊线虫最大稀释1280倍均能看到特异性扩增条带(如图3中D所示)。

    以上结果说明：上述双重PCR检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的检测灵敏度分别为1/640条和1/1280条二龄幼虫，1/2000000个两种线虫的孢囊，具有极高的灵敏度。

    实施例5从我国黄淮麦区样本检测禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫

    1)土样中线虫孢囊的分离

    采集不同地区田间孢囊线虫侵染的小麦根系及根际土壤(表1)，样本经风干后加水溶解并快速搅拌，将水悬液先后通过25目和400目过滤筛网，收集400目筛网中孢囊线虫。

    表1

    2)线虫DNA的提取

    将收集到的孢囊线移入1.5ml离心管，加入50μl裂解缓冲液，用碾磨棒充分研碎，将孢囊裂解液在液氮中冷冻1min，65℃水浴2min，重复3次；最后65℃温育1.5h，95℃处理10min，14000r/min离心1min，取上清作为线虫DNA模板直接用于双重PCR检测。

    3)禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测

    取上述模板1μLDNA，加入实施例2所述的检测溶液，总体积25μL，反应程序为94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。扩增结束后取5μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照(如图4所示)。根据检测结果可以确定，从我国黄淮麦区随机采集的13个小麦根/土样中，来自江苏、安徽、上东及河南的8个样本为禾谷孢囊线虫，来自河南省商丘夏邑县济阳镇、商丘永城市陈集镇太平庄、焦作市博爱县东马营3个样本为菲利普孢囊线虫，而河南省焦作市博爱县清化镇与商丘永城市子牧镇两个样本中同时检出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫，表明上述地区两种线虫混合发生。

    参考文献

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