利用银耳菌体作为催化剂制备银杏内酯B的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310393204.1 (22)申请日 2013.09.02 C12P 17/18(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 北京绿科天成生物科技有限公司 地址 100041 北京市石景山区八大处高科技 园区西井路 3 号 3 号楼 6529 房 (72)发明人 张志才 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 11419 代理人 王玉松 CN 102286324 A,2011.12.21,说明书第3页 第 17 段至第 4 页第 27 段、 以及第 4 页第 32 。

2、段 . CN 1944626 A,2007.04.11, 全文 . 张健等 . 银杏叶内酯的提取工艺 . 资源开发 与市场 .1998, 第 14 卷 ( 第 3 期 ), 第 100-101 页 . (54) 发明名称 利用银耳菌体作为催化剂制备银杏内酯 B 的 方法 (57) 摘要 本发明公开了利用银耳(Stereum hirsutum) 菌体作为催化剂转化银杏内酯混合物合成银杏内 酯B的方法， 属于生物技术领域。 本发明通过对银 耳菌种进行扩大培养， 从试管斜面、 液体摇瓶、 种 子培养和菌体分离， 利用菌体作为催化剂， 转化银 杏内酯合成银杏内酯 B， 转化液经过离心、 乙酸乙 酯萃取。

3、、 无水酒精结晶把银杏内酯 B 从发酵液分 离出来。利用该方法所得到的银杏内酯 B 的纯度 99， 银杏内酯转化率 90。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐荣 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 CN 103468760 B 2016.07.06 CN 103468760 B 1.利用银耳菌体作为催化剂制备银杏内酯B的方法， 其特征在于以银耳为出发菌株， 通 过试管斜面菌种、 液体摇瓶菌种、 种子罐菌种、 离心获得菌体， 菌体催化银杏内酯合成含有 银杏内酯B的反应液， 含有银杏内酯B的反应液经过离心、 乙酸乙酯萃取、 浓缩、 。

4、酒精复溶， - 20结晶、 过滤、 烘干等提取工艺得到银杏内酯B晶体； 银耳菌种通过液体摇瓶、 种子罐和菌 体转化银杏内酯， 分离提取得到银杏内酯B； 其中所述的液体摇瓶种子培养基组成为： 葡萄 糖540， 玉米粉525， 蛋白胨120， KH2PO416， MgSO414， 单位为克/升， 加水至适当体 积， 起始pH值为5.08.0， 100140灭菌2060分钟； 其中所述的种子罐培养基组成为： 葡萄糖540， 玉米粉525， 蛋白胨110， KH2PO416， MgSO414， 消泡剂0.10.8， 单位为 克/升， 加水至适当体积， 起始pH值为5.08.0， 100140灭菌206。

5、0分钟； 其中所述转化 银杏内酯反应液组成为银杏内酯10克/升50克/升， 所述银杏内酯包括银杏内酯A、 B、 C和 M， 起始pH值为5.08.0； 其中所述的摇瓶培养的培养条件是： 250mL三角瓶装液量为60 150mL， 接种34块44mm小块菌种， 置于温度2230， 转速120160转/分钟， 培养时间 2448小时； 其中所述种子罐的培养条件是： 接种量510， 所述的接种量为种子液体 积与接种后体积的体积百分比， 培养温度2230， 搅拌速率90150转/分钟， 通风量1： 0.31v/v/m， 培养时间8090小时； 其中所述的转化工艺条件是： 种子液40006000转/分 。

6、钟， 离心520分钟， 收集菌体， 菌体与反应液按1重量： 550体积， 混匀， 在温度2230， 搅拌速率90150转/分钟， 通风量1： 0.31v/v/m， 转化618小时； 按照该转化工艺， 其中 在进行摇瓶培养之前， 首先将银耳菌体的斜面菌种接入新配制的马铃薯葡萄糖培养基中进 行传代培养， 培养温度2230， 培养时间24248小时； 其中， 所述的银耳菌体菌种为从云 南、 山西和西藏的任意一种金耳子实体中分离出的金耳伴生菌菌种。 2.根据权利要求1所述的制备银杏内酯B的方法， 转化液40006000转/分钟离心， 滤液 用盐酸或硫酸调节pH1.04.0， 连续用0.33倍发酵液体积。

7、的乙酸乙酯萃取24次， 合并 乙酸乙酯萃取液， 真空浓缩至干， 残渣用无水乙醇溶解， 过滤， 滤液置于-20结晶24120 小时， 过滤， 滤渣水洗， 80干燥得到银杏内酯B纯品。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103468760 B 2 利用银耳菌体作为催化剂制备银杏内酯B的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术领域， 通过银耳菌体菌种液体培养， 同时转化银杏叶提 取物制备银杏内酯B的一种新工艺。 背景技术 0002 研究证明银杏内酯是银杏叶中主要的活性成分之一， 是一类特异有效的血小板活 化因子(PlateletactivatingfactorPAF)受体拮抗剂。 血小板活化。

8、因子是由血小板和多 种炎症组织分泌产生的一种内源性磷酯， 是目前发现的最有效的血小板聚集诱导剂， 与许 多疾病的产生、 发展密切相关。 银杏内酯作为PAF受体特异性拮抗剂， 具有广泛的药理作用。 研究发现银杏内酯B对中枢神经系统与缺血损伤有保护作用， 抗休克、 抗过敏、 抗菌抗炎作 用， 以及抗器官移植中的排斥反应。 同时还发现银杏内酯B可降低肝门静脉压提高全身血管 耐受性， 说明它对肝硬化有一定的疗效。 银杏内酯对于肾损伤有治疗作用。 这些作用都与银 杏内酯B作为PAF受体拮抗剂有关， 并且它目前被认为是作用最强的、 最有临床应用前景的 天然血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂。 0003 目。

9、前国内外生产银杏内酯B的方法主要是从银杏叶提取物， 已见报导的银杏内酯B 的专利共有51篇， 其中一部分是关于银杏内酯B的制剂的制备(如： 一种银杏内酯B固体分散 体及其制备方法， 申请号： CN200910204198.4)， 三篇关于银杏内酯B及其衍生物的生理学功 能(银杏内酯B的一种新用途； 申请号： CN200910092750.5； 银杏内酯B衍生物在制药中的新 用途 ， 申请号 ： CN200910234319 .X ； 银杏内酯B水解衍生物及其用途 ， 申请号 ： CN201010122039.2)。 而关于银杏内酯B的制备只有九篇(一种从银杏叶或银杏叶提取物中 提取银杏内酯B的。

10、新方法， 申请号200510063407.X； 一种从银杏内酯混合物中分离银杏内酯 B的方法， 申请号： CN201010608847.X， 等等)， 银杏内酯中含有银杏内酯A、 B、 C、 M等同系物， 这些专利是采用分离技术从银杏内酯混合物中分离银杏内酯B， 难以在工业上大批量生产 银杏内酯B。 0004 本发明所使用的银耳菌种， 可选任意一种银耳子实体， 例如云南、 西藏或山西的银 耳， 通过组织分离即可得到。 该菌不形成或很难形成子实体， 分枝， 有锁状联合， 近无色。 发明内容 0005 本发明提供的是一种银杏内酯B的生产技术， 该技术不是单纯的利用分离提纯方 法获得大量的银杏内酯B。

11、， 而是以银耳(Tremellafuciformis)为菌种通过液体培养技术得 到菌体， 菌体作为催化剂， 转化银杏内酯混合物中银杏内酯A、 C和M生成银杏内酯B， 以及通 过提取步骤获得银杏内酯B制品。 0006 本发明以银耳为出发菌株， 进行试管菌种传代、 液体摇瓶菌种、 种子罐菌种、 催化 转化等步骤制得含有银杏内酯B的反应液， 含有银杏内酯B的反应液经过离心、 乙酸乙酯萃 取、 浓缩、 酒精复溶， -20结晶、 过滤、 烘干等提取工艺得到银杏内酯B晶体。 其中所述的试 管菌种的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(葛健， 王正祥， 工业微生物实验技术手册， 说明书 1/4 页 3 CN 10。

12、3468760 B 3 1994： P367)； 其中所述的试管斜面菌种培养工艺为斜面菌种切成44mm小块菌种， 挑取一 小块转接含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中， 2032培养520天， 制得试管斜面菌 种， 该试管斜面4保存备用； 其中所述的液体摇瓶培养基组成为(单位为克 升)： 葡萄糖5 40， 玉米粉525， 蛋白胨120， KH2PO416， MgSO414， 加水至适当体积， 起始pH值为5.0 8.0， 100140灭菌2060分钟； 其中所述的摇瓶培养的培养条件是： 250mL三角瓶装液 量为60150mL， 接种34块44mm小块菌种， 置于温度2230， 转速120160。

13、转 分钟， 培养时间2448小时； 其中所述的种子罐培养的培养基组成为(单位为克 升)： 葡萄糖5 40， 玉米粉525， 蛋白胨110， KH2PO416， MgSO414， 消泡剂0.10.8， 加水至适当体积， 起始pH值为5.08.0， 100140灭菌2060分钟； 其中所述种子罐的培养条件是： 接种量 510(种子液体积 接种后体积)， 培养温度2230， 搅拌速率90150转 分钟， 通风量 1： 0.31v v m， 培养时间8090小时； 其中所述转化反应液为(单位为克 升)： 银杏内酯10 50， 起始pH值为5.08.0； 其中所述转化工艺条件是： 种子液40006000。

14、转 分钟， 离心5 20分钟， 收集菌体， 菌体与反应液按1： 550(重量： 体积)混匀， 在温度温度2230， 搅 拌速率90150转 分钟， 通风量1： 0.31v v m， 反应618小时； 其中所述的银杏内酯B提 取工艺为， 转化液40006000转 分钟离心1020分钟去除菌体， 滤液用盐酸或硫酸调节 pH1.04.0， 连续用0.33倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取24次， 合并乙酸乙酯萃取液， 真 空浓缩至干， 残渣用无水乙醇溶解， 过滤， 滤液至于-20结晶24120小时， 过滤， 滤渣水 洗， 80干燥得到银杏内酯B纯品。 0007 本发明所使用的银耳菌种， 可选任意一种银耳子实。

15、体， 例如云南、 西藏或山西的银 耳， 通过组织分离即可得到。 该菌不形成或很难形成子实体， 分枝， 有锁状联合， 近无色。 0008 本发明所述的工艺银杏内酯B白色， 纯度 99， 银杏内酯转化率90。 0009 根据此工艺采用的银杏内酯测定方法为： 精密称取银杏内酯B对照品10mg， 溶于 1mL色谱级甲醇中， 配制成10mg mL的标准液。 0.2 m微孔滤膜过滤， 控制进样量为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7和8 l， 利用高效液相色谱仪(HIMADZU(岛津)LC-20AT)测定银杏内酯B含量。 色谱柱为 硅胶柱(4.6mm250mm， 10 m)。 测定条件为流动相： 甲醇：。

16、 0.1磷酸溶液=10： 90； 柱温： 30 ， 流速： 0.8mL min， 检测波长： 270nm。 以进样量为横坐标(X)， 以相应的峰面积为纵坐标 (Y)进行线性回归， 求得银杏内酯浓度与峰面积的线性回归方程。 吸取样品液(发酵过程中 和发酵后)的上清液少量， 用0.45 m微孔滤膜过滤， 按上述色谱条件分别测定峰面积， 采用 外标峰面积根据上述求得的银杏内酯B浓度与峰面积的回归方程计算银杏内酯B含量。 0010 银杏内酯B转化率按下列公式(1)计算： 0011 0012 式中， Rt为t时间银杏内酯B的转化率； C0(mg/L)， V0(mL)为0小时加入的银杏内酯浓 度和培养基体。

17、积； Ct(mg/L)和Vt(mL)为反应t小时银杏内酯B的浓度和反应液体积。 具体实施方式 0013 为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺， 给出了以下实施例。 这 些实施例不以任何方式限制本发明的范围。 0014 实施例1试管菌种的制备 说明书 2/4 页 4 CN 103468760 B 4 0015 马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备： 称取马铃薯200g， 切成片状、 加入1000mL水， 煮 沸30分钟， 过滤， 滤液定容至1000mL， 加入琼脂20g， 加热待琼脂完全融化后， 分装18200mm 的试管， 每管15mL培养基， 120灭菌30分钟， 冷却到50， 摆成斜面。

18、， 斜面长度为试管长度 的一半； 将保藏的从银耳子实体中分离的银耳菌种切成44mm小块菌种， 挑取一小块转接 含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中， 20培养20天， 制得试管斜面菌种， 该试管斜面4 保存备用： 0016 实施例2含有银杏内酯B的发酵液的制备 0017 1、 液体摇瓶菌种的制备 0018 液体摇瓶菌种培养基配方为(单位为克 升)葡萄糖5， 玉米粉5， 蛋白胨1， KH2PO41， MgSO41， 起始pH值为5.0。 共配制5500mL， 分装250mL三角瓶， 每瓶60mL， 共84瓶， 100灭菌60 分钟。 共配制5500mL， 分装250mL三角瓶， 每瓶60mL， 共。

19、84瓶， 将保存的从云南银耳子实体中 分离的银耳试管斜面菌种切成44mm大小的小块， 挑取3块转接入装有摇瓶培养基的250mL 三角瓶中， 置于22、 90转 分钟摇床培养24小时。 0019 2、 种子罐菌种的制备 0020 75L种子罐装有45L种子培养基， 其中种子培养基的配方为(单位为克 升)： 葡萄糖 5， 玉米粉5， 蛋白胨1， KH2PO41， MgSO41， 消泡剂0.5， 起始pH值为5.0， 100灭菌60分钟， 冷却 后， 将上述培养的菌种5000mL接入种子罐中， 即接种量10(种子液体积 接种后体积)， 维 持罐温22， 罐压0.05MPa， 搅拌速度90转 分钟， 。

20、通风量1： 0.3v v m， 发酵时间90小时。 0021 3、 银杏内酯B转化 0022 种子液4000转 分钟离心20分钟收集菌体， 得到鲜菌体2kg。 准确称取银杏内酯100 克， 加蒸馏水10L， 用盐酸调节pH5.0， 配成10克 升的反应液， 2kg与10L反应液(1： 5， 重量 体 积)混合， 在温度22， 搅拌速率90转 分钟， 通风量1： 0.3v v m， 反应18小时。 0023 4、 银杏内酯B的提取 0024 上述反应液4000转 分钟离心20分钟去除菌体， 滤液用盐酸或硫酸调节pH4.0， 连 续用3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取2次， 合并乙酸乙酯萃取液， 真空浓。

21、缩至干， 残渣用无水 乙醇溶解， 过滤， 滤液至于-20结晶24小时， 过滤， 滤渣水洗， 80干燥得到银杏内酯B纯 品。 经分析银杏内酯B含量99.1， 转化率90.8。 0025 实施例3含有银杏内酯B的发酵液的制备 0026 1、 摇瓶菌种的制作 0027 摇瓶培养基的配方为(单位为克 升)： 葡萄糖20， 玉米粉15， 蛋白胨6， KH2PO43， MgSO42， 起始pH值为6.5， 共配制4500mL， 分装250mL三角瓶(共50瓶)， 每瓶90mL， 120灭菌 40分钟。 冷却后， 将保存的从山西银耳子实体中分离的银耳试管斜面菌种切成44mm大小 的小块， 试管斜面菌种切成4。

22、4mm大小的小块， 挑取4块转接入装有摇瓶培养基的三角瓶 中， 置于25、 120转 分钟摇床上， 培养36小时。 0028 2、 种子罐菌种的制备 0029 100L种子罐装有50L种子培养基， 其中种子罐培养基的配方为(单位为克 升)： 葡 萄糖20， 玉米粉15， 蛋白胨6， KH2PO43， MgSO42， 消泡剂0.1， 起始pH值为6.5， 120灭菌40分 钟。 冷却后， 将上述培养的菌种4000mL接入100L种子罐中， 即接种量7.4(种子液体积 接 种后体积)， 种子罐中发酵液的总体为54L； 维持罐温25， 罐压0.05MPa， 搅拌速度120转每 说明书 3/4 页 5。

23、 CN 103468760 B 5 分钟， 通风量1： 0.5v v m， 培养时间90小时。 0030 3、 银杏内酯B转化 0031 种子液5000转 分钟离心12分钟收集菌体， 得到鲜菌体3.5kg。 准确称取银杏内酯 1250克， 加蒸馏水50L， 用盐酸调节pH6.5， 配成25克 升的反应液， 2kg与50L反应液(1： 25， 重 量 体积)混合， 在温度25， 搅拌速率120转 分钟， 通风量1： 0.8v v m， 反应12小时。 0032 4、 银杏内酯B的提取 0033 上述反应液5000转 分钟离心15分钟去除菌体， 滤液用盐酸或硫酸调节pH2.5， 连 续用2倍发酵液。

24、体积的乙酸乙酯萃取3次， 合并乙酸乙酯萃取液， 真空浓缩至干， 残渣用无水 乙醇溶解， 过滤， 滤液至于-20结晶72小时， 过滤， 滤渣水洗， 80干燥得到银杏内酯B纯 品， 经分析银杏内酯B含量99.5， 转化率95.8。 0034 实施例4含有银杏内酯B的发酵液的制备 0035 1、 摇瓶菌种的制作 0036 摇瓶培养基的配方为(单位为克 升)： 葡萄糖40， 玉米粉25， 蛋白胨10， KH2PO46， MgSO44， 起始pH值为8.0。 共配制2000mL， 分装250mL三角瓶(共10瓶)， 每瓶150mL， 140灭菌 20分钟。 冷却后， 将保存的从西藏银耳子实体中分离的银耳。

25、试管斜面菌种切成44mm大小 的小块， 挑取4块转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中， 置于30、 150转 每分钟摇床上培养 46小时。 0037 2、 种子罐菌种的制备 0038 50L种子罐装有30L种子培养基， 其中种子罐培养基的配方为(单位为克 升)： 葡萄 糖40， 玉米粉25， 蛋白胨10， KH2PO46， MgSO44， 消泡剂0.8， 起始pH值为8.0， 140灭菌20分钟。 冷却后， 将上述液体摇瓶培养的菌种1600mL接入50L种子罐中， 即接种量5.1(种子液体 积 接种后体积)； 维持罐温30， 罐压0.05MPa， 搅拌速度150转 分钟， 通风量1： 1v v m，。

26、 发 酵时间90小时。 0039 3、 银杏内酯B转化 0040 种子液6000转 分钟离心5分钟收集菌体， 得到鲜菌体1.2kg。 准确称取银杏内酯 3000克， 加蒸馏水60L， 用氢氧化钠调节pH8.0， 配成50克 升的反应液， 1.2kg鲜菌体与60L反 应液(1： 50， 重量 体积)混合， 在温度30， 搅拌速率150转 分钟， 通风量1： 1v v m， 反应6小 时。 0041 4、 银杏内酯B的提取 0042 上述反应液6000转 分钟离心10分钟去除菌体， 滤液用盐酸或硫酸调节pH1.0， 连 续用0.3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取4次， 合并乙酸乙酯萃取液， 真空浓缩至干， 残渣用无 水乙醇溶解， 过滤， 滤液至于-20结晶120小时， 过滤， 滤渣水洗， 80干燥得到银杏内酯B 纯品。 经分析银杏内酯B含量99.9， 转化率98.5。 0043 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的 保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 说明书 4/4 页 6 CN 103468760 B 6 。