技术领域
本发明涉及干细胞分化技术领域，尤其涉及一种培养基及其在诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化中的应用。
背景技术
中枢神经系统损伤后神经功能的恢复非常困难，主要原因是脑内神经元的再生能力极差。目前研究证明脑内虽然有神经干细胞存在，且能分化成神经元和神经胶质细胞，但是由于神经干细胞存在的部位很局限，数量也非常少，故将其用于神经元损伤修复还是非常困难的。随着干细胞领域的研究不断深入，发现其他部位的干细胞也可以分化成神经细胞。将胚胎神经细胞或脐血干细胞移植到受损伤的鼠脑内，可以适度改善其神经功能，但是由于伦理道德、免疫排斥等因素限制了这些干细胞在临床上的广泛应用。骨髓间充质干细胞可在自体获得且能在体外稳定扩增，并在体外能诱导分化成神经细胞，有望成为神经系统疾病移植治疗的种子细胞。但是目前诱导分化而来的神经样细胞还不能有效稳定地表达神经细胞特性，此类神经样细胞是否具备真正神经元的功能，仍然存在争议，且从正常人体内抽取骨髓，也会给供者造成一定程度的身体伤害。
人胎盘来源的羊膜组织作为孕妇分娩后的废弃物，来源广、增殖快且不受伦理道德限制，是近几年的研究热点。羊膜是胎盘包裹胎儿面的一层半透明膜，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织，可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。早在50多年前，科学家和临床医生们就已经认识到羊膜拥有一定的生物学作用。早期羊膜曾被用作覆盖皮肤伤口的敷料，可以抗感染、减轻炎症的发生，并且抑制细胞的免疫反应，还可以刺激血管的生成。这些特点使它在多种疾病的辅助治疗中得到了较为广泛的应用，例如治疗烧伤，覆盖手术伤口，更重要的是用于眼表重建术。其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞(human amnion mesenchymal cells，hAMSCs)来自于原条期的胚外中胚层，具有在一定条件下向多个细胞系分化潜能，向内胚层分化，如肝细胞、胰岛样细胞；向中胚层分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞；向外胚层分化，如神经细胞等。
hAMSCs不仅具有干细胞的特征，且不排斥性及免疫效果，是细胞移植和组织工程的理想种子细胞。hAMSCs在体外使用合适的诱导剂同样具有分化为神经样细胞的能力。hAMSCs这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，hAMSCs所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。但是目前诱导hAMSCs向神经样细胞分化的方法效率仍较低，不能满足临床应用的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基及其在诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化中的应用。该培养基能够高效诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化。
本发明提供的培养基，由基础培养液、FBS、B27、EGF、BDNF和NGF组成。
本发明提供的培养基中，所述EGF、BDNF和NGF的质量比为(5～15)：(15～25)：(10～20)。
在一些实施例中，所述EGF、BDNF和NGF的质量比为5:15:10。
在一些实施例中，所述EGF、BDNF和NGF的质量比为10:20:15。
在一些实施例中，所述EGF、BDNF和NGF的质量比为15:25:20。
B27是一种细胞培养添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。
脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF)是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。
表皮细胞生长因子(cottony-stimulating factor,EGF)能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)可以调节周围和中枢神经元的生长发育，维持神经元的存活。
本发明提供的培养基中，所述FBS的体积分数为10％；所述B27的体积分数为2％。
本发明提供的培养基中，所述EGF的浓度为5ng/mL～15ng/mL；所述BDNF的浓度为15ng/mL～25ng/mL；所述NGF的浓度为10ng/mL～20ng/mL。
在一些实施例中，所述EGF的浓度为5ng/mL；所述BDNF的浓度为15ng/mL；所述NGF的浓度为10ng/mL。
在一些实施例中，所述EGF的浓度为10ng/mL；所述BDNF的浓度为20ng/mL；所述NGF的浓度为15ng/mL。
在一些实施例中，所述EGF的浓度为15ng/mL；所述BDNF的浓度为25ng/mL；所述NGF的浓度为20ng/mL。
本发明提供的培养基中，基础培养液为DMEM/F12无血清培养液。
本发明利用B27、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)诱导羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志物神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilamentacidic protein，GFAP)。说明本发明提供的培养基能够使羊膜间充质干细胞跨胚层分化为非间充质细胞(神经样细胞)，且分化效率较高。
本发明提供的培养基在诱导诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化中的应用。
实验表明，以含有FBS、B27、EGF、BDNF和NGF的培养基诱导，hAMSCs在8小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，2天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状。
本发明还提供了一种诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化的方法，羊膜间充质干细胞以含10％FBS的DMEM/F12培养基培养24h后，以本发明的培养基诱导1周，每隔2～3天更换新鲜的本发明培养基。
本发明实施例中，羊膜间充质干细胞为第3～5代的羊膜间充质干细胞。
所述第3～5代的羊膜间充质干细胞的制备方法为：依次以胰蛋白酶和I型胶原酶消化羊膜后，细胞以PBS缓冲液重悬，以10vol％FBS的DMEM/F12完全培养基培养至融合度达到80％～90％，传代。
本发明实施例中，所述羊膜间充质干细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养容器。
本发明实施例中，所述接种的密度为1×104cells/mL。
本发明的培养基中包括B27、BDNF、EGF和NGF；利用本发明提供的培养基能够诱导羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞，且分化效率较高。8小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，2天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状；分化率可达60％以上。
附图说明
图1示实施例1制得的hAMSCs细胞形态图，包括：图1-a示40倍放大、图1-b示100倍放大；
图2示hAMSCs的表面抗原表达检测结果，包括：图2-a示CD105的表达、图2-b示CD90的表达、图2-c示CD73的表达、图2-d示HLA-DR的表达、图2-e示CD34的表达、图2-f示CD45的表达。
具体实施方式
本发明提供了一种培养基及其在诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 hAMSCs原代分离培养、鉴定及传代
用将羊膜制成30～50cm2大小的组织，分装到50mL离心管中(体积10ml～15ml)。
胰酶消化：加入三倍体积的0.25％胰蛋白酶，置37℃、200R恒温振荡器中消化30min，每10min取出用手剧烈摇晃。
二次漂洗：消化结束后，用镊子将消化好的组织块转移至装有PBS缓冲液的250mL储液瓶中，盖紧盖子用手剧烈摇晃，PBS缓冲液漂洗2-3次。再将羊膜制成10～30cm2大小的组织。
Ⅰ型胶原酶消化：加入20mL的0.5％Ⅰ型胶原酶，补加DMEM/F12培养基至终体积为100mL。置37℃、200R恒温振荡器中消化，每10min取出用手剧烈摇晃，直到组织块完全消化。
过筛：消化完成后，消化好的组织液分装至50mL离心管，每管20～25mL，加入等体积的PBS缓冲液，2000rpm离心5min。弃上清后加入10mLPBS缓冲液重悬细胞沉淀，200μm细胞筛网过滤。2000rpm离心5min。弃上清，加入5～10mL含10wt％FBS的DMEM/F12完全培养基重悬细胞。
细胞计数与接种：对细胞悬液进行细胞计数，根据计数结果调整细胞悬液密度到1.0×105cell/mL～1.5×105cell/mL接种于培养皿中，5％CO2培养箱37℃培养。
原代培养：细胞接种48h后，对原代细胞进行换液，更换新鲜的含10wt％FBS的DMEM/F12完全培养基，放置5％CO2培养箱37℃培养。
传代：待细胞长满80％～90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2～3mL0.25wt％胰蛋白酶，消化1～3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min，弃上清。加入适量含10％FBS的DMEM/F12完全培养基，进行细胞计数，按1×105cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔3-4天传代一次。
hAMSCs鉴定：取第2代对数生长期细胞(形态如图1)，流式细胞术检测表面抗原CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析8000～10000个细胞。
流式细胞术检测结果显示，细胞表面抗原CD105、CD90、CD73表达阳性，而CD45、CD34、HLA-DR表达阴性，说明本发明中得到的hAMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞(表1，图2)。
表1 hAMSCs表面抗原阳性表达率
细胞表型 CD105 CD90 CD73 HLA-DR CD34 CD45 阳性表达率(％) 99.60 99.50 100.00 0.00 0.00 0.20
实施例2 hAMSCs分化
以不同培养基对实施例1制得的hAMSCs诱导分化，同时设置4组对照组和3组实验组，选取第3～5代hAMSCs，按1×104cells/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2mL含10vol％FBS的DMEM/F12培养基。24h后更换对照组1～对照组6以及实验组1～实验组3中各组对应的培养液，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养，每隔2～3天更换新的培养液。
对照组1为阴性对照组，为常规培养组，使用的培养液为：含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液。
对照组2为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、10ng/mL EGF的DMEM/F12培养液。
对照组3为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、20ng/mL BDNF的DMEM/F12培养液。
对照组4为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、15ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
对照组5为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、5％B27、20ng/mL bFGF、20ng/mL BDNF、20ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
对照组6为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、5％B27、10ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、35ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
实验组1中使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、5ng/mL EGF、15ng/mL BDNF、10ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
实验组2中使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、10ng/mL EGF、20ng/mL BDNF、15ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
实验组3中使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、15ng/mL EGF、25ng/mL BDNF、20ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
hAMSCs分化形态观察：
8小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，2天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状。
免疫组化：
培养7天后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行Nestin、NSE、GFAP的免疫组化染色，DAB显色。
将放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加适量一抗(Nestin、NSE、GFAP)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
对各组所得细胞经免疫组化检测后，对Nestin、NSE、GFAP染色的细胞按公式：
诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％
进行计数，计算出各组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。统计结果如表2。
表2各组细胞分化率
表2结果显示，对照组1细胞Nestin、NSE、GFAP均未见着色，分化率为0，对照组2～6细胞Nestin、NSE、GFAP均显示有着色，但着色率较低；而实验组1～3的着色则都很深。统计诱导分化率，结果表明，对照组1细胞未分化，分化率为0；对照组1～6细胞皆发生一定程度的分化，其中，对照组4～6的效果显著优于对照组1～3；而实验组1～3的分化率则显著高于对照组1～6。经统计学分析，实验组1～3任一者的分化率皆显著优于对照组1～6(p<0.05)。其中实验组2的分化效果最佳，分化率与对照组存在极显著差异(p<0.01)，与实施例1或3存在显著性差异(p<0.05)。
以上结果说明，说明本发明所用分化培养基能在7天内有效的诱导hAMSCs向神经元样细胞分化，分化时间短，分化率高，因此分化效率较高。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。