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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610053213.X (22)申请日 2016.01.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105506034 A (43)申请公布日 2016.04.20 (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人 沐万孟江波郁书怀朱莺莺 张涛 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 耿晓岳 (51)Int.Cl. C12P 19/18(2006.01) C12P 19/14。
2、(2006.01) C12P 19/12(2006.01) (56)对比文件 CN 101090906 A,2007.12.19, CN 101906405 A,2010.12.08, CN 101974584 A,2011.02.16, CN 104087537 A,2014.10.08, Xiao Wang等.From fructans to difructose dianhydrides. Appl Microbiol Biotechnol .2014, (第99期), Genbank.fructotransferase Arthrobacter sp. 161MFSha2.1. Gen。
3、bank Database .2013,AccesionNO.WP_018778058.1. 审查员 康雨欢 (54)发明名称 一种合成双果糖酐III的方法 (57)摘要 本发明公开了一种高效合成双果糖酐III的 方法， 先使用菊糖蔗糖酶将蔗糖转化为菊糖， 不 分离聚糖， 再使用菊糖果糖转移酶转化菊糖合成 功能性双糖双果糖酐III。 本发明的工艺简单， 效 率高， 菊糖合成双果糖酐III的转化率能够达到 40-54。 为了获得较为纯的双果糖酐III， 用 酵母除去反应液中的小分子单糖， 最终所获得的 较为纯的双果糖酐III容易分离纯化， 具有广阔 的市场应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 。
4、序列表10页 附图2页 CN 105506034 B 2019.01.11 CN 105506034 B 1.一种合成双果糖酐III的方法， 其特征在于， 先使用菊糖蔗糖酶将蔗糖转化为菊糖， 不分离菊糖， 再使用菊糖果糖转移酶转化菊糖合成双糖双果糖酐III， 其中， 所述菊糖蔗糖 酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.权利要求1所述的方法， 其特征在于转化蔗糖合成菊糖的工艺为： 将蔗糖完全溶解于 水中， 其浓度控制为300-500 g/l， 调节pH值为5.0-6.0， 温度控制在20-30， 加入菊糖蔗糖 酶， 加入量为1-15 U/g， 恒温反应25-60 min。 3.权利要求。
5、1或2所述的方法， 其特征在于转化蔗糖合成菊糖的工艺： 菊糖蔗糖酶加入 量控制在5-15 U/g， pH控制在5.0-6.0， 温度控制在20-30， 恒温反应30-60 min。 4.权利要求1或2所述的方法， 其特征在于所述转化菊糖合成双果糖酐III的工艺为： 将 蔗糖转化液升温至50-60， 再将向其中加入菊糖果糖转移酶， 菊糖果糖转移酶浓度为1-20 U/g， pH值控制在5.0-6.0， 恒温反应2-20小时。 5.权利要求4所述的方法， 其特征在于所述转化菊糖合成双果糖酐III的工艺： 菊糖果 糖转移酶浓度为5-10 U/g； pH值控制在5.0-6.0； 温度控制在55-60， 。
6、恒温反应6-12小时。 6.权利要求1所述的方法， 其特征在于还包括残糖消除步骤， 清除反应液中的蔗糖、 葡 萄糖、 果糖以及部分低聚果糖。 7.权利要求6所述的方法， 其特征在于通过添加酵母菌清除残糖。 8.权利要求1或4所述的方法， 其特征在于所述菊糖果糖转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 9.权利要求6所述的方法， 其特征在于残糖消除步骤为： 冷却反应液， 再向其中加入酵 母菌体吸收除掉反应液中的蔗糖， 葡萄糖， 果糖以及部分低聚果糖， 控制pH5.0 - 6.0， 温度 控制在28， 200 rpm摇床反应24-36小时。 权利要求书 1/1 页 2 CN 10550603。
7、4 B 2 一种合成双果糖酐III的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种高效合成双果糖酐III的方法， 特别是两种酶两步法实现双果糖 酐III (Difructose anhydride,DFAIII)的高效生产， 属于功能性食品生物加工技术领域。 背景技术 0002 近年来由于生活水平的提高,糖尿病、 肥胖以及心血管疾病逐年增加并且出现了 低龄化。 因此， 开发出能量较低、 具有多功能的营养特性的甜味剂成为了消费者关注的热 点。 0003 双果糖酐III就是一种新型的功能性甜味剂， 其结构主要是由两个果糖分子脱去 两个水分子形成。 由于异头碳上的羟基都成糖苷键， 因此双果糖酐III是一种。
8、新型的非还原 性双糖。 由于存在着这样特殊的双糖苷键形式， 因此， 双果糖酐III的性质十分的稳定。 对热 和酸相当稳定， 耐高温， 在一般食品的高温加工过程中不会出现双果糖酐III的褐变或者是 分解现象。 双果糖酐III甜度只有蔗糖的1/2,但是热量相对蔗糖很低， 只有蔗糖的1/15 (0.263kcal/g)， 对于糖尿病和肥胖病患者具有良好的功能， 因此， 双果糖酐III可以作为一 种理想的蔗糖替代糖而应用到低能量食品及糖尿病人食品中， 防治糖尿病。 同时， 双果糖酐 III比蔗糖难吸湿， 能够在74的相对湿度下不吸湿， 这便于糖的存储。 在体内， 双果糖酐 III不会被肠道吸收， 从而。
9、不会产生能量， 因此可以作为一种甜味剂用于减肥辅助治疗。 尽 管不被人体的肠道直接消化吸收， 但是双果糖酐III可以被肠道内的益生菌利用代谢， 产生 大量的益生元， 从而促进人体内的益生菌生长以及身体健康。 双果糖酐III能促进人体对 钙、 镁、 锌和铜等矿物质元素以及黄酮类物质的吸收， 从而有增进骨骼生长等作用。 龋齿主 要是由于空腔中的突变链球菌代谢蔗糖等糖产酸， 从而腐蚀牙齿所致。 但是双果糖酐不能 被突变链球菌代谢， 因此具有抗龋齿作用。 另外， 双果糖酐III有降低胆固醇,、 高血压等多 种生理功能。 鉴于双果糖酐III的这些优良性质， 可以将其作为食品添加剂应用到焙烤食 品、 饮料。
10、、 糖果等中。 因此， 双果糖酐 III在食品行业中具有广阔的前景。 0004 自然界中就存在双果糖酐， 主要在包括菊苣、 菊芋等菊科植物中， 但是含量较少。 另外， 双果糖酐III也会少量的存在于蜂蜜、 咖啡等的加工过程中。 由于在自然界中的含量 较少， 因此提取分离双果糖酐III的成本会很高。 虽然化学方法也能够生产双果糖酐III， 但 是化学合成法有诸多的不利因素， 如环境的污染等。 也可以用生物催化法获得双果糖酐， 1 973年 Uchiyama T首次从 产脲节杆菌中发现了菊糖果糖转移酶 (inulin fructotransferase,EC4.2.2.18)， 此后发现了十余种微。
11、生物可以产生菊糖果糖转移酶。 生 物转化法具有原料来源广泛且价格低廉， 转化率高,适于工业化生产的优点。 但是目前的方 法都是直接转换植物菊糖来获得双果糖酐III， 首先还需要植物菊糖， 菊糖相对蔗糖价格较 高， 因此不具有经济性。 0005 本发明人提出以更为廉价的蔗糖为底物， 首先通过菊糖蔗糖酶将蔗糖转化为菊 糖， 再将合成的生物菊糖直接用菊糖果糖转移酶转化为双果糖酐III， 此步骤中不需要菊糖 的分离纯化， 节省了能源消耗， 降低生产成本。 最后用酵母出去除去反应液中存在的其它 说明书 1/4 页 3 CN 105506034 B 3 糖， 获得较为纯的双果糖酐III便于后续的分离纯化。。
12、 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是提供一种廉价的双果糖酐III的高效合成方法， 所制 备的双果糖酐III具有较高的纯度。 整个合成过程工艺简单， 效率高， 成本低。 0007 本发明的技术方案： 0008 一种双果糖酐III的高效合成步骤为： 0009 1)先使用菊糖蔗糖酶将蔗糖转化为菊糖， 不分离聚糖； 0010 2)再使用菊糖果糖转移酶转化菊糖合成功能性双糖双果糖酐III。 0011 转化蔗糖合成菊糖的工艺为： 将蔗糖完全溶解于水中， 其浓度控制为300500g/ l， 调节 pH值为5.0-6.0， 温度控制在20-30， 加入菊糖蔗糖酶， 加入量为1-15U/g， 恒温反 。
13、应2560 min。 0012 为了获得较好的效果， 优选工艺为： 转化蔗糖合成菊糖的工艺优选： 菊糖蔗糖酶加 入量控制在5-15U/g， pH控制在5.0-6.0， 温度控制在20-30， 恒温反应3060min。 0013 转化菊糖合成双果糖酐III的工艺为： 将蔗糖转化液升温至50-60， 再将向其中 加入菊糖果糖转移酶， 添加的菊糖果糖转移酶浓度为1-20U/g， pH值仍然控制在5.0-6.0， 恒 温反应2-20小时。 0014 为了获得较好的效果， 优选工艺为： 转化菊糖合成双果糖酐III的工艺优选： 菊糖 果糖转移酶浓度为5-10U/g； pH值控制在5.0-6.0； 温度控制。
14、在55-60， 恒温反应6-12小时。 0015 为了进一步降低成本， 还可以对转化液添加残糖消除步骤， 清除其中的蔗糖， 葡萄 糖， 果糖以及部分低聚果糖， 通过添加酵母菌等其他方式清除残糖。 0016 当使用酵母菌清除残糖时， 具体方案为： 冷却反应液， 再向其中加入酵母菌体吸收 除掉反应液中的蔗糖， 葡萄糖， 果糖以及部分低聚果糖， 控制pH5.0-6.0， 温度控制在28， 200 rpm摇床反应24-36小时。 0017 所述菊糖蔗糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0018 所述菊糖果糖转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0019 SEQ ID NO.1: 0。
15、020 MAVKQDEKAATAVKANTEVKANETSTKSASKDNKAELKGQIKDIVKESGVDTSKLTDDQI NELNKISFSKEAKSGTQLTYSDFKKIAKTLIEQDARYAVPFFNASKIKNMPAAKTLDAQTG KVEDLEIWDSWPVQDAKTGYVSNWNGYQLVIGMMGVPNTNDNHIYLLYNKYGDNNFNN WKNAGPIFGLGTPVIQQWSGSATLNKDGSIQLYYTKVDTSDNNTNHQKIASATVYLNLEK NQDKISIAHVDNDHIVFEGDGYHYQTYNQWKKTNKGADNIAMRDAHVIDDKDG。
16、NRYLVF EASTGTENYQGADQIYQWLNYGGTNKDNLGDFLQILSNSDIKDRAKWSNAAIGIIKLNNDT KNPGVEKVYTPLISAPMVSDEIERPDVVRLGNKYYLFAATRLNRGSNDDAWMAANKAVG DNVAMIGYVSDNLTHGYVPLNESGVVLTASVPANWRTATYSYYAVPVEGRDDQLLITSYI TNRGEVAGKGMHATWAPSFLLQINPDNTTTVLAKMTNQGDWIWDDSSENADMMGVLEK DAPNSAALPGEWGKPVDWDLIGGYNLKPHQ 0021 SEQ ID NO.2: 00。
17、22 MEIDETLDVKNTSRRMLVGAGAVGSLAAALSLGMSPKAEAAKDAKAGPFNSPNTYDVTA 说明书 2/4 页 4 CN 105506034 B 4 WRIKGQPKVTAESDIGAVINDIIADIKKRQTTPDTRPGAVVIIPPGDYDLRTQVVVDVDYLTI AGFGHGFFSRSIKDNVDPTGWLNLQPGGSHIRVLTPPSAPQAFLVRRSGSPRLSGIVFRDFCL DGVNFTPDGNSYRNGKTGIEVASDNDSTHVTGMGFVYLEHALIVRGADALRVHDNMIAE CGNCVELTGAGQATIVSGNL。
18、MGAGPEGVTLLAENHEGLLVTGNNFFPRGRSLIEFNGCNRC SVSSNRFQGFYPGMMRLLNGCKENLITSNHFRRGTEGFPPFINRTNGLDDLYGVLHTLGDN NLISNNLFAYDVPPNKGVPAGAQPTIILIAGGDGNVVATNHVVSNVATQHVVLDGSTTHSK VLDSGSATTITSYSPDTAIRPTP 0023 检测双果糖酐III的方法： 0024 反应后的上清液用微孔滤膜(0.22)过滤， 滤液用配备有示差折光显示器的HPLC分 析。 HPLC条件为： Sugarpak1， 6.5mm id300mm钙型阳离子交换柱。
19、， 纯水作流动相， 柱温为 85， 流速为0.4ml/min， 进样量为10ul。 双果糖酐III标样的浓度为0.5。 利用检测(3) 反 应后溶液中双果糖酐III的峰面积与0.5的双果糖酐III标样的峰面积的比值， 计算得到 反应液中的合成的双果糖酐III的浓度。 0025 本发明利用菊糖蔗糖酶先将廉价底物蔗糖转化为菊糖， 再用菊糖果糖转移酶将合 成的生物菊糖转化为双果糖酐III， 从避免了菊糖的分离纯化过程。 由于植物菊糖的市场价 格较蔗糖高， 因此， 本发明直接转化蔗糖为菊糖降低了成本。 本发明中用菊糖果糖转移酶催 化菊糖为双果糖酐III的转化率能够高达54。 最后利用酵母出去反应体系中。
20、的其它糖， 获 得较为纯的双果糖酐III。 整个工艺较为简单， 生产成本低， 能耗低， 有利于实现工业化生 产。 附图说明 0026 图1菊糖蔗糖酶以蔗糖为底物合成菊糖(稀释后溶液)。 0027 图2菊糖果糖转移酶以转化合成的菊糖为双果糖酐III(稀释后溶液)。 0028 图3酵母处理合成的双果糖酐III溶液。 具体实施方式 0029 以下是用菊糖蔗糖酶和菊糖果糖转移酶实现转化蔗糖为双果糖酐III的实例， 说 明本发明的方法， 但本发明并不限于所列出的几个实例。 0030 实施例1 0031 用去离子水将蔗糖底物完全溶解， 其浓度控制为400g/L,调节pH值为5.5， 温度控 制在 20， 。
21、加入菊糖蔗糖酶， 加入量为10U/g蔗糖， 恒温反应30min； 0032 将反应体系的温度提升至55， 再将向其中加入菊糖果糖转移酶， 添加的菊糖果 糖转移酶的浓度为5U/g， pH值仍然控制在5.5， 恒温反应12h； 0033 取反应后溶液离心， 上清液用微孔滤膜(0.22)过滤， 滤液用配备有示差折光显示 器的 HPLC分析。 HPLC条件为： Sugarpak1， 6.5mm id300mm钙型阳离子交换柱， 纯水作流动 相， 柱温为85， 流苏为0.4ml/min。 进样量为10ul,双果糖酐III标样的浓度为0.5。 利用 反应后溶液中双果糖酐III的峰面积与0.5的双果糖酐II。
22、I标样的峰面积的比值， 计算得 到反应液中的合成的双果糖酐III的浓度。 所获得的双果糖酐III的转化率达到54。 0034 实施例2 说明书 3/4 页 5 CN 105506034 B 5 0035 用去离子水将蔗糖底物完全溶解， 其浓度控制为300g/L,调节pH值为5.0， 温度控 制在 22， 加入菊糖蔗糖酶， 加入量为15U/g蔗糖， 恒温反应60min； 0036 将反应体系的温度提升至60， 再将向其中加入菊糖果糖转移酶， 添加的菊糖果 糖转移酶的浓度为10U/g， pH值仍然控制在5.0， 恒温反应6h； 所获得的双果糖酐III的转化 率达到48。 0037 实施例3 003。
23、8 用去离子水将蔗糖底物完全溶解， 其浓度控制为500g/L,调节pH值为6.0， 温度控 制在 30， 加入菊糖蔗糖酶， 加入量为5U/g蔗糖， 恒温反应60min； 0039 将反应体系的温度提升至50， 再将向其中加入菊糖果糖转移酶， 添加的菊糖果 糖转移酶的浓度为20U/g， pH值仍然控制在6.0， 恒温反应20h； 所获得的双果糖酐III的转化 率达到43。 0040 实施例4 0041 按照实施例1中反应和检测条件生产双果糖酐III， 将反应体系自然冷却至28， 再向其中加入酵母菌体， pH 5.0-6.0， 置于28， 200rpm摇床反应24-36小时。 此实施例子主 要是用。
24、酵母发酵除去反应液中的蔗糖， 葡萄糖， 果糖、 部分低聚果糖， 从而得到较为纯的双 果糖酐III， 以便于工业实施中的后续检测和分离纯化。 最终双果糖酐III的转化率与实施 例1 相近， 但是反应后溶液中不再含有蔗糖， 葡萄糖， 果糖、 部分低聚果糖， 实现双果糖酐纯 度的提高。 0042 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 4/4 页 6 CN 105506034 B 6 0001 序列表 1/10 页 7 CN 10550。
25、6034 B 7 0002 序列表 2/10 页 8 CN 105506034 B 8 0003 序列表 3/10 页 9 CN 105506034 B 9 0004 序列表 4/10 页 10 CN 105506034 B 10 0005 序列表 5/10 页 11 CN 105506034 B 11 0006 序列表 6/10 页 12 CN 105506034 B 12 0007 序列表 7/10 页 13 CN 105506034 B 13 0008 序列表 8/10 页 14 CN 105506034 B 14 0009 序列表 9/10 页 15 CN 105506034 B 15 0010 序列表 10/10 页 16 CN 105506034 B 16 图1 图2 说明书附图 1/2 页 17 CN 105506034 B 17 图3 说明书附图 2/2 页 18 CN 105506034 B 18 。