技术领域
本发明涉及基因技术领域，更具体地，本发明涉及蛹虫草代谢产物——虫草素的合成基因簇的鉴定和应用。
背景技术
虫草素(cordycepin)，又称作蛹虫草菌素、虫草菌素，化学名3′-脱氧腺苷(3′-deoxyadenosine)，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。能够产生虫草素的真菌仅包括蛹虫草、九州虫草等为数不多的虫草属以及构巢曲霉中，虫草素具有良好的抑菌效果，在氧化应激(oxidative stress)引起的衰老改善、机体免疫功能的增强调节、抑制脂肪细胞分化预防肥胖发生、炎症抑制、人体外周血单核细胞生产白细胞介素-10的作用、抗白血病等方面均发挥着重要的作用，是虫草菌质量的重要评价指标之一。虫草素的化学结构在许多年前就已经被解析如下：
虫草素：
目前获取虫草素一般通过三条途径：从天然蛹虫草中提取、人工合成和通过生物工程的方法从北虫草培养液中提取。
有报道虫草素能够人工化学合成，但过程复杂、投入巨大且产量极低。天然虫草资源稀缺，价格昂贵，含量甚微，很难成为提取虫草素的主要原料。因此如何提高蛹虫草中虫草素的含量并实现虫草素的工业化生产，是目前研究的主要方向。
目前国内虽然有较多的企业能生产蛹虫草子实体，由于天然子实体中的虫草素含量低，大规模提取纯化的效率很低，难以为依据虫草素进行的新药开发及实现产业化提供原料药的保障。
因此，通过生物工程的方法，实现虫草素的高效合成具有重要经济及应用价值。但是，虫草素在真菌中的合成机理一直不清楚，这成为虫草素的生物工程产业化制备的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于提供蛹虫草代谢产物——虫草素的合成基因簇的鉴定和应用。
在本发明的第一方面，提供一种生产虫草素的方法，所述方法包括：
(1)将虫草素生物合成相关基因转化宿主细胞；其中，所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1和Cm2基因，或包括构巢曲霉的An1和An2基因；
(2)培养(1)的宿主细胞，使之生产虫草素。
在一个优选例中，所述方法的(1)中，所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的An1、An2基因和An3基因。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是包含或能自体生成3’-AMP的宿主细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是真菌；较佳地所述的真菌包括(但不限于)：虫草属真菌(如蛹虫草(Cordyceps militaris))，曲霉属真菌(如构巢曲霉(Aspergillus nidulans))，绿僵菌属真菌(如罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii))，酵母属真菌(如酿酒酵母、毕赤酵母)。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定的虫草素生物合成基因簇，所述的虫草素生物合成基因簇包括蛹虫草的Cm1和Cm2基因，或包括构巢曲霉的An1和An2基因。
在一个优选例中，所述的虫草素生物合成基因簇包括蛹虫草的Cm1、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的An1、An2基因和An3基因。
在另一优选例中，所述的虫草素生物合成基因簇不包括由全基因组构成的基因簇，也不包括包含Cm1和Cm2和/或Cm3基因的整条染色体，也不包括包含An1和An2和/或An3基因的整条染色体。
在本发明的另一方面，提供重组载体(包括载体组合)，所述的重组载体包括虫草素生物合成相关基因；所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1和Cm2和/或Cm3基因，或包括构巢曲霉的An1和An2和/或An3基因；附加条件是：所述的Cm1和Cm2和/或Cm3基因位于同一重组载体或位于不同的重组载体上；或所述的An1和An2和/或An3基因位于同一重组载体或位于不同的重组载体上。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞中包括所述的虫草素生物合成相关基因；所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1和Cm2和/或Cm3基因；或所述的虫草素生物合成相关基因包括构巢曲霉的An1和An2和/或An3基因；或包括所述的虫草素生物合成基因簇。
在一个优选例中，所述的宿主细胞是包含或能自体生成3’-AMP的宿主细胞；较佳地，所述的宿主细胞是真菌；更佳地，所述的真菌包括(但不限于)：虫草属真菌(如蛹虫草(Cordyceps militaris))，绿僵菌属真菌(如罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii))，曲霉属真菌(如构巢曲霉(Aspergillus nidulans))，酵母属真菌(如酿酒酵母、毕赤酵母)。
在本发明的另一方面，提供所述的虫草素生物合成基因簇或所述的表达载体或所述的宿主细胞的用途，用于生产虫草素。
在本发明的另一方面，提供一种用于生产虫草素的试剂盒，所述的试剂盒中包括：所述的表达载体或所述的宿主细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、蛹虫草和构巢曲霉中潜在虫草素生物合成基因的比较。
(A)虫草素生物合成基因簇在蛹虫草和构巢曲霉基因组上的组织排列对应关系。
(B)虫草素生物合成基因簇在蛹虫草和构巢曲霉中的共线性分析。
图2、蛹虫草野生菌株与cpABC敲除突变株(ΔcpABC)产虫草素的比较。
(A)SDB发酵液中虫草素的HPLC检测比较。
(B)HPLC比较检测子实体水提样品中的虫草素。红色峰(箭头标示)为虫草素峰。
图3、HPLC检测酿酒酵母及所有knock-in菌株的发酵液中的虫草素。KI表示knock-in。
图4、HPLC检测异源表达cpABC突变株中虫草素的合成。
(A)酿酒酵母表达cpABC突变株与对照菌株SC发酵液中虫草素的检测。
(B)罗伯茨绿僵菌表达cpABC突变株与野生菌株SDB发酵液中虫草素的检测。红色峰(箭头标示)为虫草素峰。
图5、HPLC检测蛹虫草野生株和突变株中的虫草素。
(A)对发酵液中虫草素的检测比较。红色峰(箭头标示)为虫草素峰。
(B)对子实体水提样品中虫草素的检测比较。ko表示knock-out。
图6、HPLC检测构巢曲霉野生菌株与突变株发酵液中的虫草素。红色峰为虫草素峰。
图7、蛹虫草中cpC基因的单敲除对虫草素产量的影响。
图8、虫草素生物合成代谢途径。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次找到了虫草素生物合成的相关基因，包括Cm1和Cm2和/或Cm3，对应构巢曲霉中的同源基因分别是An1、An2和/或An3。基于上述新发现，本发明揭示一种能够实现高效的虫草素生物合成的方法。
如本文所用，所述的“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，获知来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“异源的”。
如本文所用，所述的“虫草素生物合成相关基因”是指用于在真菌中生物合成虫草素所需要的基因的组合，包括“虫草素生物合成基因簇”。所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1和Cm2基因，或包括构巢曲霉的An1和An2基因；更佳地，所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的An1、An2基因和An3基因。
如本文所用，所述的“宿主细胞”包括在转化入本发明的虫草素生物合成相关基因后，能够生物合成虫草素的细胞的总和；可以包括原核细胞和真核细胞。较佳地，所述的宿主细胞是真菌细胞、原核细胞或植物细胞。更佳地，所述的宿主细胞是真菌。更佳地，所述的真菌包括(但不限于)：虫草属真菌(如蛹虫草(Cordyceps militaris))，曲霉属真菌(如构巢曲霉(Aspergillus nidulans))，绿僵菌属真菌(如绿僵菌)，酵母属真菌(如酿酒酵母、毕赤酵母)。
如本文所用，所述的cpA指代Cm1或An1，cpB指代Cm2或An2，cpC指代Cm3或An3，cpD指代Cm4或An4。
虫草素生物合成相关基因
所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1和Cm2基因；较佳地，还包括蛹虫草的Cm3基因。上述的三个基因编码相关的代谢酶类，其中Cm1编码氧化还原酶(oxidordeuctase)、Cm2编码金属离子依赖的磷酸水解酶(Metal dependent phosphohydrolase)以及Cm3编码ATP依赖的磷酸转移酶(ATP phosphoribosyltransferase)。Cm1和Cm2基因是宿主细胞生成虫草素的关键性基因，而Cm3基因则能够更为有效地提供虫草素的产量。所述的Cm1具有GenBank登录号CCM_04436所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码具有CCM_04436所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列、所述的Cm2具有GenBank登录号CCM_04437所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码具有CCM_04437所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列、所述的Cm3具有GenBank登录号CCM_04438所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码具有CCM_04438所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列。
所述的虫草素生物合成相关基因包括构巢曲霉的An1和An2基因；较佳地，还包括构巢曲霉的An3基因。其中An1编码氧化还原酶(oxidordeuctase)、An2编码金属离子依赖的磷酸水解酶(Metal dependent phosphohydrolase)以及An3编码ATP依赖的磷酸转移酶(ATP phosphoribosyltransferase)。An1和An2基因是宿主细胞生成虫草素的关键性基因，而An3基因则能够更为有效地提供虫草素的产量。所述的An1具有GenBank登录号AN3333所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码具有AN3333所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列、所述的An2具有GenBank登录号AN3331所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码具有AN3331所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列、所述的An3具有GenBank登录号AN3330所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码具有AN3330所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列。
在所检测的其他不同真菌中，任何基因组中不含有Cm1、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的An1、An2基因和An3基因的类似基因，均不会产生虫草素。
本发明的虫草素生物合成相关基因包括的各基因可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述基因的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。但是，所述的变异体不会从实质上改变其编码的多肽的功能，仍然能够实现本发明的技术效果。
本发明中的虫草素生物合成相关基因优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明中揭示的虫草素生物合成相关基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自微生物。此外，所述的虫草素生物合成相关基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程技术来扩增所述的虫草素生物合成相关基因，或通过人工合成的手段来制备所述的虫草素生物合成相关基因。优选的，可应用基因工程技术来获得所述的虫草素生物合成相关基因。
本发明的虫草素生物合成相关基因或其包括的各基因通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
作为本发明的优选方式，可对虫草素生物合成相关基因或其包括的各基因进行密码子优化，以提高表达效率。例如，为了促进其在酵母宿主中的重组表达，可以对其进行酵母细胞偏好的密码子优化。
在获得了草素生物合成相关基因之后，将其连入合适的表达构建物(如表达载体)中，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，获得宿主细胞的代谢产物虫草素。
所述的表达构建物可包括虫草素生物合成相关基因或其包括的各基因，还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的表达调控序列的设计是本领域公知的。表达调控序列中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的表达以及代谢产物生产，有利于工业化应用。针对原核细胞或真核细胞，本领域已知适合的表达载体是哪些，因此人们能够选择到合适的表达载体作为克隆编码基因的骨架载体。
生产虫草素的方法
本发明公开一种利用宿主细胞异源生产虫草素的方法。利用生物工程技术，表达与合成虫草素相关的基因，生成虫草素。
虫草素的生物合成途径包括：腺苷在包括cpC等特异的磷酸转移酶或蛋白激酶作用下被磷酸化生成3’-AMP，当然，3’-AMP也可由2’,3’-cAMP-adenosine代谢通路中的3’-磷酸二酯酶对2’,3’-cAMP作用产生。所得3’-AMP在cpB的作用下去磷酸化，得到一个不稳定的烯醇化合物，该化合物自发异构形成羰基，在cpA还原酶的作用下负责将羰基还原成羟基，生成虫草素。
因此，本发明提供了一种生产虫草素的方法，所述方法包括：(1)将虫草素生物合成相关基因转化宿主细胞；其中，所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cm1和Cm2和/或Cm3基因，或包括构巢曲霉的An1和An2和/或An3基因；(2)培养(1)的宿主细胞，使之生产虫草素。所述的宿主细胞是包含或能够生成3’-AMP的宿主细胞，其中3’-AMP作为cpB的作用底物。
根据所采用的宿主细胞的不同，培养宿主细胞的方式可以进行变化，这是本领域技术人员基于现有知识可以进行的。
从宿主细胞的培养产物中分离虫草素的方法也是本领域技术人员基于现有知识可以进行的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，百分比以重量百分比计算。
材料和方法
1、蛹虫草试验相关操作
1.1无性营养繁殖和子实体的诱导
蛹虫草无性营养菌丝的生长可在固体丰富培养基PDA以及液体丰富培养基SDB中诱导进行，25℃培养。除无性菌丝生长外，蛹虫草可在PDA平板上形成疏水性的圆形分生孢子。与固体平板上形成的分生孢子不同，SDB液体培养中产生的无性孢子为短棒状，具亲水性，称为芽生孢子。
实验条件下蛹虫草子实体的诱导在米饭培养基上或体蚕蛹中进行，一般选取新鲜分生孢子孢悬液进行接种。米饭培养基上子实体的诱导，在接种后先进行为期1周的25℃黑暗培养，待无性菌丝充分生长后，再转至22℃条件下进行子实体的光照循环诱导(12h光照/12h黑暗)。由于昆虫体壁对外界光照具有屏蔽作用，蚕蛹中子实体诱导无需进行前期的黑暗处理，可直接于光照循环条件下进行培养。子实体诱导过程中，严格控制环境湿度，保证湿度不低于80％。从接种至子实体成熟，约50～60天。
1.2蛹虫草基因组提取
(1)蛹虫草CM01菌株接种于PDA平板上，25℃正置培养一周。
(2)从培养一周的平板上刮取适量菌丝，接种于SDB液体培养基(Sabouraud Dextrose Broth，Difco)，黑暗条件下25℃，200rpm，培养48h。
(3)50ml BD管离心收集菌体后，再以真空泵抽滤收集菌丝体，并用清水洗涤一次。
(4)收集抽滤后的干燥菌丝，液氮研磨至细腻粉末后，加入DNA提取液(0.1M Tris-HCl(pH 8.0)，1.0％SDS，2％Triton X-100，10mM EDTA，0.1MNaCl)及石英砂继续破碎至镜检时几乎看不到完整的孢子。
(5)加入β-巯基乙醇(DES：β-巯基乙醇＝110:1)，混匀后65℃温浴30min，每10min颠倒混匀一次。
(6)加入等体积Tris饱和酚，颠倒混匀，5,000rpm，5min离心。
(7)取上清至新离心管，加入等体积CIA(氯仿/异戊醇24:1)混匀，5,000rpm，5min离心。重复一次。
(8)小心吸取上清至新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置沉淀，时间不短于30min。
(9)12,000rpm，15min，离心去上清。
(10)用冰预冷的70-75％(v/v)乙醇清洗两次。
(11)干燥后，根据沉淀量大小加入适量ddH2O溶解。
(12)取(2-4μl)溶液用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量与浓度。将剩余的基因组溶液放-20℃保存。
1.3根癌农杆菌AGL-1介导的转化
1.3.1.根癌农杆菌AGL-1感受态制备
(1)挑取原始菌株AGL-1(Hellen R，Mullineaux P(2000)A guide to Agrobacterium binary Ti vectors an update.Trends Plant Sci 5(10):446-451)，于YEB平板(含50μg/ml Carb)上划线培养进行活化。(2)挑取平板上单菌落，接种至4ml YEB液体培养基(含50μg/ml Carb)中，28℃，200rpm，培养过夜。(3)取2ml上述菌液转接至50ml YEB液体培养基(含50μg/ml Carb)中，28℃，200rpm，培养至菌液OD600为0.5(一般约8h)。(4)取出菌液，冰浴30min，4℃，8000rpm，5min离心收集菌体。(5)弃上清，加入10ml 20mM CaCl2重悬菌体沉淀。(6)4℃，8,000rpm，5min，再次离心收集菌体。(7)上清，以2ml 20mM CaCl2再次重悬菌体，加入无菌甘油至终浓度为15～20％。分装至1.5ml EP管，100μl/管，液氮速冻后保存于-80℃。
1.3.2.质粒转化根癌农杆菌AGL-1感受态
(1)取出-80℃冻存的农杆菌感受态，置于冰上融化约10min。(2)向感受态中加0.5～1μg目的质粒，混匀后冰上静置30min。(3)依次处理如下：液氮5min，37℃水浴5min，处理后立即置于冰上2min。(4)加入1ml无抗YEB液体培养基，28℃，150rpm，复苏3h。(5)8,000rpm，2min离心收集菌体。(6)弃上清，以100μl无抗YEB重悬菌体后均匀涂布于YEB平板(含50μg/ml Carb及50μg/ml Kan)，28℃倒置培养2天。(7)PCR验证转化子，挑取阳性转化子以3ml YEB液体(含50μg/ml Carb和50μg/ml Kan)过夜摇菌，28℃，220rpm。(8)将菌液取部分保存于-80℃，甘油终浓度为15％。
1.3.3.根癌农杆菌介导蛹虫草遗传转化
(1)蛹虫草分生孢子悬液的制备：选取PDA(Potato Dextrose Agar，Difco)平板上光照培养一周的新鲜蛹虫草，刮取适量菌落至1ml无菌0.05％Tween-20水溶液，涡旋振荡分离菌丝与分生孢子；以玻璃丝棉或三层擦镜纸过滤去除菌丝，收集滤液；12,000rpm，1min，离心菌液收集孢子；弃上清，以1ml无菌水重悬孢子，清除残余营养；12,000rpm，1min，再次离心收集孢子；可重复步骤4～5一次，以彻底清除孢子表面残余营养；弃上清，以适量无菌水重悬孢子，血球计数器统计孢子数目后，将孢悬液浓度调至5×105孢子/ml，作为工作液用于后续实验操作。(2)蛹虫草转化：转接已成功转化相应载体的AGL-1冻存菌至3ml液体YEB(含50μg/ml Carb和50μg/ml Kan)，28℃，220rpm，培养过夜；8,000rpm，2min，离心收集菌体；弃上清，以适量的IM液体重悬菌体，调整至OD650为0.15；28℃，150rpm，诱导培养至OD650为0.5～0.8，一般需6h；取诱导好的农杆菌菌液及新鲜制备的蛹虫草孢悬液各100μl，于1.5ml EP管中混和均匀；取上述混合液100μl涂布于IM平板，28℃共培养48h；待灭菌后的M-100固体培养基温度降至60℃，加相应抗生素(噻孢霉素，草胺膦/潮霉素)；每块共培养IM平板以15ml上述M-100培养基覆盖，25℃培养7～10天至单个抗性菌落出现；挑取上述抗性菌落挑取至新的M-100抗性培养基平板上，进行第二次筛选；以SDB液体培养基对二次筛选平板上的抗性菌落摇菌培养，并在M-100平板背面的相应位置做好标记；抽滤SDB培养菌丝，抽提基因组，进行PCR验证。
1.4用于蛹虫草及罗伯茨绿僵菌基因操作的培养基
用于配制IM的2.5×MM盐溶液(1L)：
KH2PO4 3.625g
K2HPO4.3H2O 6.72g MgSO4.7H2O 1.250g NaCl 0.375g CaCl2 0.125g FeSO4.7H2O 0.0062g (NH4)2SO4 1.250g ddH2O 加至终体积1L
M-100微量元素溶液(500ml)：
H3BO3 30mg MnCl2.4H2O 70mg ZnCl2 200mg Na2MoO4.2H2O 20mg FeCl3.6H2O 50mg CuSO4.5H2O 200mg ddH2O 加至终体积500mL
用于配制M-100的M-100盐溶液：
KH2PO4 16g Na2SO4.10H2O 9.064g KCl 8g MgSO4·7H2O 2g CaCl2 1g M-100Trace Element Solution 8ml ddH2O 加至终体积1L
IM(Induction Medium)(液体)(200ml)
1×MM盐 80ml的2.5×MM 10mM葡萄糖 0.36g 0.5％甘油 1ml
ddH2O 加至终体积192mL
灭菌后冷却到50℃后添加：
40mM MES 8ml 1M stock 200μM AS 4ml 10mM AS
IM(诱导培养基，Induction Medium)(固体)(400ml)
1×MM盐 160ml 2.5×MM 5mM葡萄糖 0.36g 0.5％甘油 2ml ddH2O 加至终体积376mL 1.5％Agar 6g
灭菌后冷却到50℃后添加：
40mM MES 16ml 1M stock 200μM AS 8ml 10mM AS
M-100(1L)
M-100盐溶液 62.5ml 葡萄糖 10g KNO3 3g ddH2O 加至终体积1L 1.5％Agar 15g
MES和AS母液配制：
储存液浓度 pH(用5M KOH调) MES 1M 5.3 AS 10mM 8
2、构巢曲霉试验相关操作
2.1构巢曲霉生活史诱导
(1)无性营养繁殖：构巢曲霉无性营养繁殖过程在固体丰富培养基PDA以及液体丰富培养基SDB(营养缺陷型菌株可加入尿苷和尿嘧啶)中诱导进行，28℃或37℃光照培养；或在YGUUTE培养基中进行培养。固体平板上主要诱导产生无性孢子，液体培养基中主要诱导形成由菌丝体构成的菌丝球。液体培养基中的菌液过0.22μm水相针式滤器后可直接用于HPLC检测分泌到培养基(细胞外)中的代谢物；而菌丝球经无菌水清洗后50℃烘干，液氮研磨成粉末后用相应溶剂提取，可用于检测构巢曲霉细胞内的代谢物。
(2)有性生殖过程的诱导：实验条件下构巢曲霉有性生殖过程的诱导主要是在固体平板上进行。与构巢曲霉无性营养繁殖过程不同，有性生殖过程的诱导需要在低氧黑暗条件下进行。37℃培养14h的菌丝球转接到固体平板上，用封口膜(黑胶布更好)将平板密封以减少或避免气体交换，用锡箔纸或其它可避光的薄膜将整个平板包严实，将平板置于37℃培养20-24h，诱导有性结构的形成。
2.2培养基或试剂
曲霉用营养丰富培养基(YGUUTE)(1L)
0.5％酵母提取物，2％葡萄糖，5mM尿苷(1.221g)，10mM尿嘧啶(1.121g)，1×维生素混合物(2ml 500×)，1×基本盐离子(1ml 1000×)。倒固体平板时加1.5％的琼脂。
原生质体制备和转化中需要的试剂配方：
溶液I(100ml)
溶液II(100ml)
溶液III(100ml)
溶液IV(100ml)
溶液V(100ml)
原生质化溶液(摇50ml菌液用20ml酶解体系)
2.3原生质体制备和转化
(1)用0.02％(v/v)的Tween-80收集在YGUUTE固体培养基上生长2.5d的受体菌株A.nidulans TN02A7(购自Fungal Genetics Stock Center，http://www.fgsc.net/)孢子。将孢子收集到50ml离心管中，5,500rpm，5min，用无菌水洗两遍，1ml无菌水重悬孢子。
(2)取10μl孢子悬液稀释100倍，血球计数板计数，最终按照2×108-1×109的孢子总量加入到50ml YGUUTE液体培养基中，37℃，220rpm，6-7h。
(3)镜检，待50％以上的孢子萌发且芽管在一个孢子长度以内时收菌，6,000rpm，5min。
(4)直接将孢子重悬于20ml原生质化溶液中，30℃，150rpm，2.5-3h。
(5)镜检，当绝大多数孢子都已经形成原生质体，细胞内出现空泡时，3,000rpm，10min收集。不能提高转速，用粗枪头吸干多余液体，不要倒掉悬浮的原生质体。
(6)用预冷的溶液III洗两遍，将沉淀重悬于1ml溶液V中，冰浴过夜。
(7)预冷枪头，取100μl制备的原生质体悬液(感受态)分装于15ml的离心管中备用。
(8)转化时在100μl原生质体中加入一定量的构建好的融合敲除片段(1-20μl，1-40μg)，轻拨混匀。
(9)加入50μl溶液IV中，冰浴20min。
(10)加入1ml溶液IV，25℃或室温20min。
(11)向转化后的悬液中加入15ml液化的YAGK(0.8％Agar，热激前融化)，颠倒几次，倒入预先制备的含有15ml YAGK(1.5％Agar)底层培养基平板中，30℃正置一夜，37℃倒置2-3d后，由菌丝挑出转化子进行筛选。
YAGK配方：0.5％酵母提取物，20mM葡萄糖(4g)，1M蔗糖(342.29g)，0.6M氯化钾，根据需要添加不同剂量的琼脂(Agar)。
2.4同源重组转化子的鉴定
转化子一般边缘不规整，选择这类菌落，粘取少量孢子进行孢子PCR进行验证。将孢子放入1.5ml EP管中，将EP管于微波炉中高火加热5min以上，炉中放一盏水的三角瓶防爆。接着将EP管于-80℃冷冻30min以上。之后加入30μl无菌水，震荡，静置，14,000rpm，5min离心，取1μl上清作为模板。使用验证引物An12-F/An12-R进行PCR验证，根据电泳结果判断转化子是否为同源重组转化子。挑选发生同源重组的转化子。
3、酵母试验相关操作
3.1培养基和试剂
YPD培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)(1L)：
121℃湿热灭菌20分钟，固体培养基加入20g琼脂粉。
SC基本培养基：
组分 含量(w/v) 酵母氮源 0.67％ 碳源(i.e.葡萄糖或棉子糖) 2％ 氨基酸混合物1 0.01％ 氨基酸混合物2 0.005％ Agar(用于平板) 2％
上述成分除碳源外溶解于900ml去离子水中(碳源是葡萄糖。如果碳源是棉子糖，则溶解于800ml去离子水中)，固体培养基加入2％的琼脂粉，121℃湿热灭菌20分钟。冷却到50℃左右，加100ml经过滤除菌的浓度为20％(w/v)的葡萄糖或200ml经过滤除菌的浓度为10％(w/v)的棉子糖。液体或倒好的板倒置于4℃储存。
氨基酸100×粉末，充分研磨混匀(1L)
亮氨酸(Leucine)、色氨酸(Tryptophan)和尿嘧啶(Uracil)分别配成100×的母液放4℃备用。
诱导培养基：
配制成份和步骤与SC培养基基本一致，仅仅在灭菌冷却到50℃左右时，加入的碳源换成100ml经过滤除菌的浓度为20％(w/v)的半乳糖。
10×TE：溶解1.21g Tris base和0.37g EDTA(钠盐形式)到90ml去离子水中；用浓盐酸将pH值调到7.5并使总体积达到100ml；过滤除菌并储存于室温。将其稀释10倍及得1×TE。
10×LiAc：溶解10.2g lithium acetate于90ml去离子水中；用冰醋酸将pH值调到7.5并将溶液总体积调到100ml；过滤除菌并储存于室温。将其稀释10倍及得1×LiAc。
1×LiAc/0.5×TE：混合5ml 10×TE和10ml 10×LiAc；用去离子水将其调至100ml；过滤除菌并储存到室温。
1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE：混合10ml 10×LiAc、10ml 10×TE和40g PEG-3350；加去离子水至100ml充分溶解PEG(可以适当加热溶液以便充分溶解PEG)；121℃湿热灭菌20min，室温保存。注：该溶液最好使用前现配现用。
3.2酵母的转化
(1)从30℃培养的YPD平板上挑取酵母单菌落接种于10ml YPD培养基中，30℃，220rpm振荡过夜培养。
(2)测定过夜菌液的OD600值，用50mlYPD培养基将其OD600值稀释到0.4，30℃，220rpm继续振荡培养2-4h。
(3)3000-8000rpm离心5分钟收集酵母细胞，去上清。再用40ml 1×TE重悬细胞沉淀。
(4)3000-8000rpm离心5分钟收集酵母细胞，去上清。再用2ml 1×LiAc/0.5×TE重悬细胞沉淀。
(5)室温孵育细胞10分钟。
(6)将1μg需转化的质粒DNA和100μg鲑精DNA(预先沸水煮5min后立即置于冰上)与100μl步骤5所得的酵母悬液混合。
(7)加入700μl 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，并迅速充分振荡混匀。
(8)30℃孵育30分钟。
(9)加88μl DMSO，充分混匀，42℃热激7分钟。
(10)5,000-8,000rpm离心2-3分钟，去掉上清。
(11)用1×TE重悬细胞沉淀，并用1ml 1×TE重悬细胞。
(12)重悬细胞沉淀于50-100μl 1×TE中，并均匀涂布在相应的筛选平板上。
3.3诱导重组蛋白表达
(1)挑取生长于30℃选择平板上含有表达质粒的单克隆，转接到15ml碳源为棉子糖或葡萄糖的SC选择培养基中，30℃，220rpm过夜培养。
(2)测定过夜菌液的OD600值，计算取样量使其加入50ml诱导培养基中的OD600为0.4。
(3)按步骤2中计算吸取相应的菌液，4℃，3,000g离心5分钟。
(4)用1-2ml诱导培养基重悬细胞沉淀，并转接至50ml诱导培养基中，30℃，220rpm震荡培养。
(5)分别在0、2、4、6、8和10h(根据试验要求，也可延长时间或在其它时间点)从诱导培养基取样。在每一个时间点可分别取5ml菌液并测定OD600值。
(6)4℃，3,000g离心菌液5分钟(如要检测分泌到培养基中的代谢物，可将此步中的上清保留，以备以后检测用)。
(7)倒掉上清，并用500μl无菌水重悬细胞沉淀。
(8)将细胞悬液转移到1.5ml无菌EP管中，4℃，13,000rpm离心30秒。
(9)去掉上清，将细胞沉淀储存到-80℃冰箱备用。也可立即裂解细胞检测重组蛋白的表达情况。
4、高效液相色谱法(HPLC)相关操作
高效液相色谱仪为岛津LC-20AD型高效液相色谱仪。检测用色谱柱为岛津公司的Inertsil ODS-SP液相色谱柱(4.6×250mm，5μm)，具体洗脱用条件参数为：
检测波长 260nm 柱温 36℃ 流速 1ml/min 流动相 水(A)：甲醇(B)＝85:15恒定比例洗脱 进样量 20μl
当有多个样品要进行批处理时，尽量让每个样品的洗脱时间长一点，以避免上一个样品的残留峰对下一个样品整体峰型的影响。
5、引物
后续实施例中涉及的引物列于表2中。
表2
实施例
实施例1、虫草素生物合成的潜在基因簇的获得
通过将蛹虫草(CM01菌株)与模式真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans，A4菌株)的比较基因组分析，本发明人找到了虫草素生物合成的潜在基因簇(gene cluster)，它们分别是Cm1(GenBank登录号：CCM_04436)、Cm2(CCM_04437)、Cm3(CCM_04438)和Cm4(CCM_04439)(图1A上)，对应构巢曲霉中的同源基因分别是An1(AN3333)、An2(AN3331)、An3(AN3330)和An4(AN3329)(图1A下)。
用点阵法(dotplot)对这两个物种的虫草素合成基因簇进行序列比对分析，发现各基因的编码区显示了很好的共线性(图1B)。结构功能域分析显示，该基因簇中的三个基因编码相关的代谢酶类，分别是Cm1编码氧化还原酶(oxidordeuctase)、Cm2编码金属离子依赖的磷酸水解酶(Metal dependent phosphohydrolase)以及Cm3编码ATP依赖的磷酸转移酶(ATP phosphoribosyltransferase)，剩下的基因Cm4编码一个ABC型的转运蛋白(ABC-type transporter)(表1)。
表1
为便于描述，以下将Cm1/An1统称为cpA，Cm2/An2称为cpB，Cm3/An3称为cpC，Cm4/An4称为cpD。实验证明cpD基因并非虫草素的转运蛋白。
实施例2、蛹虫草野生菌株CM01与cpABC敲除突变株产虫草素的比较
针对上述分析获得的潜在基因簇，本发明人首先在蛹虫草野生菌株CM01菌株基因组中同时敲除了三个酶基因cpA、cpB和cpC。
1、基因敲除载体的构建
蛹虫草基因缺失突变体构建依赖于基于同源重组的基因替换方法，以及根癌农杆菌AGL-1介导的真菌转化技术。以双元载体pDHt-Bar(Duan Z,Chen Y,Huang W,Shang Y,Chen P,Wang C.(2013)Linkage of autophagy to fungal development,lipid storage and virulence in Metarhizium robertsii.Autophagy9(4):538-549)(包含草胺磷抗性基因(Bar)，用于构成上游同源臂-Bar-下游同源臂结构，通过同源重组敲除基因组中相应区段基因)出发，进行基因敲除用质粒的构建。使用引物cpABC-Uf/cpABC-Ur通过PCR方法扩增出目标基因簇ORF上游同源臂片段，通过EcoRI单酶切后顺序连接于pDHt-Bar载体的上游EcoRI位点，得到已连接有上游同源臂的pDHt-Bar载体；以cpABC-Df/cpABC-Dr通过PCR方法扩增出目标基因簇ORF下游同源臂片段，通过SpeI单酶切后顺序插入到已连接有上游同源臂的pDHt-Bar载体下游SpeI位点以构建出最终用于农杆菌转化的敲除载体质粒。
2、质粒转化
敲除质粒用于根癌农杆菌AGL-1介导的真菌转化技术进行蛹虫草转化(见前述1.3)。获得阳性转化子为发生基因敲除的菌株。
对蛹虫草野生型菌株CM01和三个酶基因被敲除突变株的SDB发酵液的HPLC检测结果的比较分析，发现在虫草素标准品的出峰位置，以及相比于野生菌株(图2A上)，突变株的虫草素峰消失(图2A下)。野生型和突变株子实体的水提样品检测结果也显示，相对于野生菌株(图2B上)，突变株的虫草素产物峰不能被检测到(图2B下)。
上述结果说明，酶基因cpA、cpB和cpC是蛹虫草菌株CM01生产虫草素的关键基因，本发明人将之称为虫草素生物合成基因簇(cpABC)。
实施例3、cpA、cpB和cpC在绿僵菌和酿酒酵母中异源表达
1、虫草素生物合成基因簇(cpABC)转入罗伯茨绿僵菌中表达
本发明人将蛹虫草及构巢曲霉与已经完成测序的罗伯茨绿僵菌基因组进行对比，发现罗伯茨绿僵菌基因组中并没有与虫草素合成基因簇中的三个基因高度同源的序列，而且对罗伯茨绿僵菌进行培养提取检测结果表明，罗伯茨绿僵菌无法产生虫草素。因此，本发明人将虫草素生物合成基因簇(cpABC)转入罗伯茨绿僵菌中表达。
本发明人设计了一对引物cpABC-MrF/cpABC-MrR(表2)从蛹虫草(Cordyceps militaris)(CM01菌株)的基因组序列上将这三个酶基因连同它们的启动子序列一并扩增出来(9321bp)，同样经酶切连接的方法构建于pDHt-Ben质粒(通过将上述pDHt-Bar载体的草胺磷抗性基因Bar换为苯菌灵抗性基因Ben改造而来)的EcoRI/EcoRI位点中，经农杆菌介导后转入罗伯茨绿僵菌菌株Ma23(USDA-ARS Collection of Entompathogenic Fungi，http://www.ars.usda.gov/News/docs.htm？docid＝12125)中，经抗性筛选获得三个基因共表达的knock-in表达菌株。具体的农杆菌转化、抗性筛选系统以及整个转化过程均与蛹虫草转化一样。
HPLC比较分析Ma23野生株和knock-in表达菌株于SDB培养基的发酵液，发现在虫草素峰的位置，knock-in表达菌株明显多出了一个峰(图4B)，LC-MS结果证实该峰的分子量大小与虫草素标准样品的分子量大小一致，该峰即是虫草素的峰。
通过上述实验，证明基因簇中的三个基因cpA、cpB和cpC负责虫草素的生物合成。
2、虫草素生物合成基因簇(cpABC)转入酿酒酵母中异源表达
为了进一步验证，以及便于后续生化分析以及阐明虫草素的生物合成途径，本发明人将虫草素生物合成基因簇(cpABC)于酿酒酵母中异源表达。
为了异源表达虫草素合成基因，本发明人选择了Invitrogen公司的INVSc1-pYES2表达系统。INVSc1是组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型菌株。因为pYES2仅能恢复INVSc1菌株在尿嘧啶营养缺陷的选择性培养基上生长，为了阐明基因簇中三个酶基因单个基因的具体作用，本发明人还需要构建可恢复在另外两种氨基酸缺陷的培养基上生长的质粒。为此，综合考虑三个酶基因序列以及pYES2质粒上的可用多克隆酶切位点，本发明人选择从pRS315和pRS314质粒(获自上海植物生理生态研究所)上分别扩增了Leu2和Trp1序列，分别插入到pYES2(购自Invitrogen)的HheI和NcoI位点，构建pYES2-Leu2、pYES2-Trp1质粒。
以蛹虫草(Cordyceps militaris)(CM01菌株)的基因组为模板，分别使用引物cpA-ScF/cpA-ScR、cpB-ScF/cpB-ScR、cpC-ScF/cpC-ScR(表2)经PCR扩增出三个酶基因的cDNA序列，并分别连接构建于表达质粒pYES2-Trp1的KpnI/EcoRI位点、pYES2-Leu2的HindIII/XbaI位点和pYES2的KpnI/XbaI位点，分别获得pYES2-Trp1-cpA、pYES2-Leu2-cpB和pYES2-cpC诱导表达质粒。同时为便于后续的表达验证，本发明人在每个基因的C端连接了6×His标签。
分别或同时转入酵母酵母INVSc1菌株(Genotype：MATa his3Δ1leu2trp1-289ura3-52/MATαhis3Δ1leu2trp1-289ura3-52；Phenotype：His-，Leu-，Trp-，Ura-)(购自Invitrogen)，经营养缺陷筛选后，本发明人分别得到了同时表达了三个酶的转化子KI cpABC，同时表达了cpA和cpB的转化子KI cpAB，同时表达了cpB和cpC的转化子KI cpBC以及分别单独表达cpA，cpB，cpC的转化子KI cpA，KI cpB，KI cpC。
将转化子菌株与转入空载质粒的INVSc1菌株KI vector在SC液体选择培养基上诱导表达后，对发酵液进行HPLC检测，结果发现只有同时表达cpA和cpB的转化子菌株(KI cpABC和KI cpAB)相对于仅转入了一个空载质粒的酵母突变株或其他转化子菌株，在标准虫草素的位置多出了一个峰(图3)。LC-MS结果证实了该峰的分子量大小与虫草素标准样品的分子量大小一致，该峰即是虫草素的峰。
单独表达基因cpA(图3KI cpA)或cpB(图3KI cpB)的突变株均不能产生虫草素，只有两个基因同时诱导表达才能合成虫草素(图3KI cpAB)。
以上结果说明，cpA和cpB对于虫草素的合成是十分必要的两个基因，而且需要协同作用才能产生虫草素。
HPLC检测比较发现，表达虫草素基因簇的酿酒酵母转化子(图4A下)与罗伯茨绿僵菌转化子(图4B下)在标准虫草素的位置分别多出了一个峰。LC-MS结果证实了该峰的分子量大小与虫草素标准样品的分子量大小一致，该峰即是虫草素的峰，进一步证明了三个基因负责虫草素的生物合成。
实施例4、蛹虫草中针对cpA、cpB和cpC的单敲除或双敲除试验
为进一步明确虫草素合成基因簇各基因在虫草素合成中的作用，本发明人在蛹虫草(CM01菌株)基因组中分别对cpA、cpB、cpC基因进行了单敲除以及双敲除。为了实现敲除，涉及的载体构建以及转化方法与实施例2中“在蛹虫草菌株基因组中同时敲除三个酶基因cpA、cpB和cpC”的方法相同，鉴于需要敲除的区段不同而仅扩增引物不同(表2)：
进行cpA基因单敲除上下游同源臂的扩增引物分别为cpA-Uf/cpA-Ur、cpA-Df/cpA-Dr，以引物cpA-F/cpA-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
进行cpB基因单敲除上下游同源臂的扩增引物分别为cpB-Uf/cpB-Ur、cpB-Df/cpB-Dr，以引物cpB-F/cpB-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
进行cpC基因单敲除上下游同源臂的扩增引物分别为cpC-Uf/cpC-Ur、cpC-Df/cpC-Dr，以引物cpC-F/cpC-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
进行cpA、cpB两个基因共敲除的上下游同源臂的扩增引物分别为cpAB-Uf/cpAB-Ur，cpAB-Df/cpAB-Dr，以引物cpAB-F/cpAB-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
进行cpC、cpB两个基因共敲除的上下游同源臂的扩增引物分别为cpBC-Uf/cpBC-Ur，cpAB-Df/cpAB-Dr，以引物cpBC-F/cpBC-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
针对野生型蛹虫草菌株，利用农杆菌进行转化，获得阳性转化子。
对阳性敲除菌株分别进行HPLC检测。结果表明，只要涉及cpA或cpB基因的敲除突变子均无法产生虫草素(图5)。
cpC基因虽然不直接参与虫草素的合成，但伴随着cpC基因的缺失，虫草素的产量有所降低(图7)，提示cpC通过其他途径来影响虫草素的产生。
实施例5、构巢曲霉中针对cpA、cpB的双敲除试验
本发明人将构巢曲霉中对应cpA和cpB基因的敲除片段(基因An1和An2)同样进行了双敲除。
1、获得融合敲除片段
采用融合PCR的方法，其原理及引物设计参见文献：Szewczyk E等(2006)，Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans.Nat Protoc.1(6):3111-3120)。(1)扩增同源臂和marker基因：以野生菌株真菌构巢曲霉(A.nidulans)A4(Glasgow野生型(veA+)；购自Fungal Genetics Stock Center，http://www.fgsc.net/)基因组DNA(10-100ng)为模板，使用引物An12-Uf/An12-Ur扩增出上游同源臂片段，使用引物An12-Df/An12-Dr扩增出下游同源臂片段；以含有pyrG基因的质粒pXDRFP4(1-10ng)为模板，使用引物An12-Gf/An12-Gr扩增出marker基因片段(具体引物序列见表2)。(2)上下游同源臂与中间的marker基因融合：将上一步的PCR产物切胶回收目标片段(没有杂带时可以直接进行PCR产物纯化回收)，用Nanodrop测定回收产物的浓度。取少量回收片段，按左同源臂：marker：右同源臂摩尔比1:2:1混合作为模板，使用引物An12-Wf/An12-Wr(具体引物序列见表2)进行PCR扩增出融合敲除片段。
2、敲除转化
融合敲除片段用于原生质体转化(见前述2.3和2.4)。获得阳性转化子为发生基因敲除的菌株。
经HPLC检测结果表明，敲除An1和An2的突变子无法产生虫草素(图6)。
总结
基于上述不同基因的功能解析，本发明人得出虫草素的生物合成途径(图8)，即腺苷在特异的蛋白激酶作用下被磷酸化生成3’-AMP，当然3’-AMP也可由2’,3’-cAMP-adenosine代谢通路中的3’-磷酸二酯酶对2’,3’-cAMP作用产生。所得3’-AMP在cpB的作用下去磷酸化，得到一个不稳定的烯醇化合物，该化合物自发异构形成羰基，在cpA还原酶的作用下负责将羰基还原成羟基，生成虫草素。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。