一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811312674.X (22)申请日 2018.11.06 (71)申请人 福建省农业科学院植物保护研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店镇 埔党村100号 (72)发明人 姚锦爱余德亿黄鹏陈南川 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01)。

2、 C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快 速检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种建兰茎腐病菌LAMP检测 引物组及其快速检测方法。 用于检测建兰茎腐病 菌的LAMP引物组由1对外侧引物F3/B3和1对内侧 引物FIP/BIP组成， F3/B3和FIP/BIP引物序列如 SEQID.1-4所示。 包括以下步骤： 1） 提取待测样 品DNA； 2） 进行LAMP扩增； 3） 使用荧光染料SYBR GreenI对扩增结果进行显色或琼脂糖凝胶电泳 对扩增产物进行检测。 本发明能快速、 方便、 高 效、 高特异、 高灵敏地检测到建兰茎腐病菌，。

3、 不需 要复杂昂贵的仪器， 能较好地满足对建兰茎腐病 菌的现场快速检测， 可广泛应用于基层单位田间 病害的早期诊断和病菌的监测、 鉴定， 为防治建 兰茎腐病提供可靠的技术和理论依据。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 109182591 A 2019.01.11 CN 109182591 A 1.一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组， 其特征在于所述引物组由1对外侧引物F3/B3和 1对内侧引物FIP/BIP组成， F3/B3和FIP/BIP引物序列包括如下： F3: 5 -GCCTGTTCGAGCGTCATT-3 ； B3: 5 -ACCTGATCCGAGGTCAACAT。

4、-3 ； FIP: 5 -GCCAATCAATTTGGGGAACGCGTCAACCCTCAAGCACAGC-3 ； BIP: 5 -GGTCACGTCGAGCTTCCATAGCAGTTGGGGTTTAACGGCG-3 。 2.如权利要求1所述的引物组在建兰茎腐病菌LAMP快速检测中的应用。 3.根据权利要求2所述引物组在建兰茎腐病菌LAMP快速检测中的应用， 其特征在于， 其 检测方法包括以下步骤： （1） 提取待测样品基因组DNA； （2） LAMP反应体系的建立： 以步骤 （1） 提取的DNA为模板， 利用权利要求1所述的外侧引 物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增， LA。

5、MP检测反应体系为25 L， 其中包括以下终浓 度成分： 20 mMTris-HCl、 10 mM (NH4)2SO4、 6.0 mM MgSO4、 50 mM KCl、 0.8 mM 甜菜碱、 1.4 mmolL-1dNTPs、 8U Bst DNA聚合酶、 1.6 molL-1的FIP和BIP、 0.2 molL-1的F3和B3， 50-100 ng的模板DNA， 无菌双蒸水补充至25L， 在PCR管盖上加入2 L的1000SYBR Green ； （3） LAMP反应条件： 65温育60 min， 85灭活10 min， 冰上终止反应； （4） 反应结果的测定： 采用荧光染料目测观察法或。

6、琼脂糖凝胶电泳法进行测定； 所述荧 光染料目测观察法具体方法为， 待LAMP反应结束后， 瞬时离心， 将SYBR Green 离心到PCR管 的底部， 观察颜色变化， 显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 橙色 或橘黄色判断为阴性， 不存在建兰茎腐病菌； 所述琼脂糖凝胶电泳法具体方法为， 取2.0 L LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 出现梯形条带判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 没 有出现条带则判断为阴性， 不存在建兰茎腐病菌。 4.如权利要求1-3任一所述的引物组在建兰茎腐病菌的早期诊断、 监测和鉴定上的应 用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109182。

7、591 A 2 一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法 技术领域 0001 本发明属于园艺作物病害检测、 鉴定及防治技术领域， 具体涉及一种建兰茎腐病 菌LAMP检测引物组及其快速检测方法， 可用于建兰茎腐病菌快速、 灵敏和特异的分子检测， 以及建兰茎腐病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。 背景技术 0002 茎腐病是建兰生产上最严重的一种世界性土传病害， 有 “兰花癌症” 和 “兰花杀手” 之称， 其致病菌为尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum） 。 自2010年马来西亚槟城首次报道之 后， 世界各地的兰花种植区普遍发生。 该病是一种由土壤传染， 从根或根茎部或伤口侵入。

8、， 在维管束内寄生的系统性病害， 是建兰生产上较难防治的病害之一， 该病由于具有发病快、 病害重、 传播迅速等特点， 一旦发生常造成经济巨大损失。 此病的初侵染源主要是带病菌的 土壤、 病株残体、 种子和粪肥等， 病菌从腐烂的寄主组织里散布到土中可营腐生活， 存活时 间长达56年或更长的时间。 茎腐病菌可借助雨水、 灌溉水等进行远距离传播， 整个生长期 均能发生。 随着农业结构的调整和设施栽培技术的不断发展， 建兰种植的面积也越来越大， 近年来茎腐病有进一步加重的趋势， 一般可导致产量减少20%40%， 甚至全株枯死， 导致绝 收， 严重影响产量和品质。 由于茎腐病是一种土传病害， 防治上主要。

9、以预防为主， 防治是否 及时， 直接影响了对土传病害的防治效果。 因此生产上迫切需要建立一种快速、 准确的检测 建兰茎腐病的方法， 为病害的早期诊断与防治、 监测、 预测预报提供支持和服务， 对发展建 兰甚至兰花生产、 增加花农收入、 减少环境污染和维持农业可持续发展， 都具有重大的生产 意义。 0003 当前， 病原菌的检测方法较多， 传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据， 将菌 种鉴定到纲、 目、 科、 属、 种。 真菌的形态特征复杂， 且有些菌类形态特征和生理生化特征随 着环境的变化而不稳定， 因此， 在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。 同时传统分 类鉴定方法耗时长、 灵敏度低。

10、、 易受人为及环境等诸多因素的干扰， 不能直观的在病害潜伏 期和初发期做出诊断， 很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。 0004 随着生物化学、 遗传学以及分子生物学的发展， 为病原菌的分类鉴定提供了技术 条件。 如血清学免疫学技术、 常规PCR、 巢式PCR和实时荧光定量PCR等技术为病原菌的分类 鉴定提供了灵敏度高、 快速的检测技术。 但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一 些不足之处， 如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力， 常常受到抗血清质量的 影响， 且可能存在交叉反应， 特异性较差， 容易造成假阳性， PCR快速检测技术主要包括常规 PCR、 巢式PCR （Nest。

11、-PCR） 和实时荧光定量PCR 等， PCR技术检测时间较长， 需要依赖贵重、 精 密的PCR仪、 凝胶成像系统等贵重仪器设备及相应的高新技术人员， 因而提高了检测成本， 并限制了其应用范围， 不利于基层生产上推广应用， 限制了这些先进方法的推广应用。 0005 环介导等温扩增 （LAMP） 技术是由日本荣研公司开发的一种简便、 快速、 准确及廉 价的核酸高效扩增技术， 该技术可在6065恒温条件下， 利用高活性的链置换DNA聚合 酶(Bst DNA polymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。 在1小时内， 能够将少量拷贝数 说明书 1/7 页 3 CN 109182591 A 。

12、3 的目的基因扩增至1091010个拷贝数。 由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域， 所 以反应特异性很强， 并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行， 普通水浴锅或者有稳定热源 的设备就能满足反应要求， 检测成本大大降低， LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、 real- time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测， 而且还可以通过SYBR Green 、 钙黄绿素、 羟基萘酚蓝 染色后， 肉眼识别， 大大降低了对实验人员的伤害， 并且增加了在田间的应用价值。 目前 LAMP检测主要应用于人畜病原物、 食品安全和环境卫生的检测， 在植物病原菌检测中报道 近年逐渐增多， 而关于建兰茎腐病菌的L。

13、AMP快速检测方法及应用国内外均未见报道。 发明内容 0006 本发明的目的是针对现有技术中对建兰茎腐病菌检测和鉴定主要基于形态学特 征， 方法耗时长、 程序繁琐、 经验性强、 准确度低， 难以做到对病害发生的及时监测和控制病 原菌的传播、 流行的问题， 而PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器， 且检测时间较长等 问题， 提供了建兰茎腐病菌新的快速分子检测方法， 对建兰茎腐病菌进行LAMP快速检测， 检 测周期短、 准确性高、 灵敏性高、 肉眼观察检测结果。 0007 为实现上述目的， 采用以下技术方案： 一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组， 由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/B。

14、IP组 成， F3/B3和FIP/BIP引物序列包括如下： F3: 5 -GCCTGTTCGAGCGTCATT-3 ； B3: 5 -ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3 ； FIP: 5 -GCCAATCAATTTGGGGAACGCGTCAACCCTCAAGCACAGC-3 ； BIP: 5 -GGTCACGTCGAGCTTCCATAGCAGTTGGGGTTTAACGGCG-3 。 0008 将上述的引物组应用于建兰茎腐病菌LAMP快速检测中。 0009 引物组在建兰茎腐病菌LAMP快速检测中的应用， 具体包括以下步骤： （1） 提取待测样品基因组DNA； （2） LAMP反应体系的。

15、建立： 以步骤 （1） 提取的DNA为模板， 利用权利要求1所述的外侧引 物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增， LAMP检测反应体系为25 L， 其中包括以下终浓 度成分： 20 mMTris-HCl、 10 mM (NH4)2SO4、 6.0 mM MgSO4、 50 mM KCl、 0.8 mM 甜菜碱、 1.4 mmolL-1dNTPs、 8U Bst DNA聚合酶、 1.6 molL-1的FIP和BIP、 0.2 molL-1的F3和B3， 50-100 ng的模板DNA， 无菌双蒸水补充至25L， 在PCR管盖上加入2 L的1000SYBR Green ； （3） 。

16、LAMP反应条件： 65温育60 min， 85灭活10 min， 冰上终止反应； （4） 反应结果的测定： 采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定； 所述荧 光染料目测观察法具体方法为， 待LAMP反应结束后， 瞬时离心， 将SYBR Green 离心到PCR管 的底部， 观察颜色变化， 显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 橙色 或橘黄色判断为阴性， 不存在建兰茎腐病菌； 所述琼脂糖凝胶电泳法具体方法为， 取2.0 L LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 出现梯形条带判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 没 有出现条带则判断为阴性， 不存在建兰茎腐病菌。 。

17、0010 将上述引物组应用于建兰茎腐病菌的早期诊断、 监测和鉴定上。 0011 本发明的显著优点 说明书 2/7 页 4 CN 109182591 A 4 本发明的有益效果： 本发明建立了建兰茎腐病菌的快速、 简便、 特异性强、 灵敏度高的 LAMP检测方法， 可用于带菌植株组织中建兰茎腐病菌的检测， 或用于建兰茎腐病的发病前 期、 初期检测， 对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。 本发明与现有技术相 比， 具有以下的技术优势和积极效果： 1、 特异性强、 结果可靠： 靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。 普通PCR常用的 靶标基因有核糖体基因转录间隔区 （Internal 。

18、transcribed space, ITS） ， 然而许多学者 认为该靶标不能够很明确的区分镰刀属真菌及尖孢镰孢菌不同专化型。 发明人发现EF- 1alpha基因序列在Fusarium种内及尖孢镰孢菌不同专化型不同菌株间具有一定的保守性， 种间存在丰富的变化， 是相比rDNA-ITS、 -tubulin序列更好的分子检测靶标。 本发明分析 了建兰茎腐病菌EF-1alpha基因和其他镰孢菌在序列上的差异， 选取6个特定区域， 设计了4 条特异性的LAMP引物， 6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增， 具有很强的 特异性。 本发明在所设计的LAMP引物组基础上建立了建兰茎腐病菌LAM。

19、P快速检测方法， 只 有建兰茎腐病菌能检测出来， 其它病原菌均未检测出， 多次试验结果均一致， 说明本发明 LAMP检测方法特异性强， 结果可靠。 0012 2、 灵敏度高： 本发明对建兰茎腐病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到1 pg/ L， 具有很高的灵敏性。 0013 3、 实用性好： 在保持 PCR 技术优点的基础上， LAMP方法不需要热循环设备， 节省 了升降温环节所用的时间， 更加省时， 可以在60 min内完成扩增反应。 同时， 由于LAMP技术 使用46条引物， 与PCR技术相比具有相当或更高的灵敏度， 进一步增强了反应的特异性。 同时在恒温扩增过程中加入了SYBR Gree。

20、n 或钙黄绿素 （Calcein） ， 在反应结束后不用打开 盖子就能直接观测结果， 使检测过程更加快捷方便， 因此该方法特别适合在基层单位、 花卉 公司或者花农等的应用。 0014 4、 操作简便快速： 本发明提供的快速检测建兰茎腐病菌的LAMP方法克服了现有技 术中建兰茎腐病菌的生物学检测方法所需周期长、 费时费力、 繁琐、 特异性差， 而PCR检测技 术需要热循环仪等贵重设备， 无法快速检测建兰茎腐病菌的问题。 本发明检测方法在65 等温条件下， 能快速、 方便、 高效、 高特异、 高灵敏地检测到建兰茎腐病菌， 不需要复杂仪器， 只需一个恒温设备即可， 能较好满足对建兰茎腐病菌的现场检测。

21、， 有较高的应用价值， 在基 层和现场检测中有很好的应用前景。 附图说明 0015 图1为本发明建兰茎腐病菌的LAMP特异性检测结果； 图1-a为LAMP扩增后的琼脂糖 凝胶电泳检测结果， 图1-b为LAMP扩增后的荧光染料可视化显色结果， 其中： M为DL 2000 DNA marker， 1为建兰茎腐病菌， 显示绿色荧光； 2为阴性对照。 0016 图2为本发明建兰茎腐病菌的LAMP特异性验证结果； 图2-a为LAMP扩增后的琼脂糖 凝胶电泳检测结果， 图2-b为LAMP扩增后的荧光染料可视化显色结果， 其中： M为DL 2000 DNA marker， 1-8泳道分别为： 建兰茎腐病菌，。

22、 多肉炭疽病菌， 菠萝黑斑病菌， 建兰炭疽病菌， 建兰黑斑病菌， 豇豆疫霉菌， 番茄叶霉菌和无菌双蒸水， 其中1显示绿色荧光。 0017 图3为本发明建兰茎腐病菌LAMP检测灵敏性测定结果； 图3-a为LAMP扩增后的琼脂 糖凝胶电泳检测结果， 图3-b为LAMP扩增后的荧光染料显色结果， 其中： M为2000 DNA 说明书 3/7 页 5 CN 109182591 A 5 marker， 1-8模板DNA浓度分别为10 ng L-1、 1 ng L-1、 100 pg L-1、 10 pg L-1、 1 pg L-1、 100 fg L-1、 10 fg L-1、 1 fg L-1， 1-。

23、5显示绿色荧光。 0018 图4为发病组织中建兰茎腐病菌的LAMP检测结果； 图4-a为LAMP扩增后的琼脂糖凝 胶电泳检测结果， 其中： M为2000 DNA marker， 1-6泳道分别为： 建兰根部发病组织1、 建兰茎 部发病组织1、 建兰根部发病组织2、 建兰茎部发病组织2、 建兰花瓣发病组织、 建兰植株健康 组织； 图4-b为LAMP扩增后的荧光染料显色结果， 其中1-6分别为： 建兰根部发病组织1、 建兰 茎部发病组织1、 建兰根部发病组织2、 建兰茎部发病组织2、 建兰花瓣发病组织、 建兰植株健 康组织， 1-5 显示绿色荧光。 具体实施方式 0019 以下结合具体实施例对本发。

24、明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。 以下 实施例均按照常规实验条件， 或已发表相关文献中所述的操作技术规程， 或按照厂商所建 议的实验条件。 0020 实施例 1： 建兰茎腐病菌LAMP检测特异性引物组的设计及引物特异性检测和验证 1.提取待测样品基因组DNA 用于检测病原菌纯培养物时， 采用CTAB 法进行提取基因组DNA， 具体方法如下： 取少量 菌丝粉于1.5 mL离心管中 （菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜） ， 加入900 L 2% CTAB （十六烷 基三甲基溴化铵） 提取液 （其包含： 质量分数2%CTAB； 终浓度100 mmolL-1Tris-HCl, pH 8.0； 终。

25、浓度20 mmolL-1 EDTA， pH8.0； 1.4 molL-1 NaCl） 和90 L pH7.2， 质量分数20% 的SDS （十二烷基苯磺酸钠） 【注： CTAB， SDS需60预热】 ， 使用振荡器振荡混匀， 60水浴1h （DNA释放至缓冲液中） ， 12000 rmin-1离心15 min； 取上清液700 L， 加等体积酚、 氯仿、 异 戊醇混合液 （各成分体积比25:24:1） ， 轻轻振荡混匀， 12000 rmin-1离心9 min； 取上清液 500 L， 加入1/10体积3 molL-1 NaAc和2倍体积无水乙醇， -20沉淀30 min， 12000 r m。

26、in-1离心5 min； 弃去上清液， 加入700 L 冰70%乙醇进行洗涤 （稍离心， 倾掉上清液） ， 在超 净工作台上晾干至无酒精味， 加入60 L无菌双蒸水进行溶解， 得到 DNA 溶液， 用紫外分光 光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ngL-1待用。 0021 用于检测植物组织中建兰茎腐病菌时， 采用NaOH快速裂解法提取DNA， 具体过程如 下： 向每毫克植物组织中加入10 L 0.5 molL-1 NaOH， 在研钵中将组织充分磨碎成糊后 转入1.5 mL离心管中， 12,000 rpm离心6 min， 取上清液5 l加入495 L 0.1 molL-1 Tris-HCl 。

27、（pH=8.0） 混合均匀， 取1.0 L （50-100 ng） 作为PCR模板进行扩增。 0022 2. 建兰茎腐病菌LAMP特异引物组的设计 通过测定建兰茎腐病菌 （Fusarium oxysporum） 和其它镰刀菌 （Fusarium spp） 的 translation elongation factor 1-alpha gene(EF-1alpha)基因序列， 对镰刀属及其它 病原菌不同种间EF-1alpha基因序列进行比对分析， 利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http:/primerexplorer.jp/elamp4.0。

28、.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套建兰茎腐病菌特异性LAMP引物组， 由1对外侧引物F3/B3和 1对内侧引物FIP/BIP组成， F3/B3和FIP/BIP引物序列发下： F3: 5 -GCCTGTTCGAGCGTCATT-3 ， B3: 5 -ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3 ， 说明书 4/7 页 6 CN 109182591 A 6 FIP: 5 -GCCAATCAATTTGGGGAACGCGTCAACCCTCAAGCACAGC-3 ， BIP: 5 -GGTCACGTCGAGCTTCCATAGCAGTTGGGGTTT。

29、AACGGCG-3 。 0023 3. 建兰茎腐病菌LAMP快速检测方法的建立及引物特异性检测 以建兰茎腐病菌株的DNA为模板， 阴性对照无菌双蒸水， 利用外侧引物F3/B3和内侧引 物FIP/BIP进行LAMP扩增， LAMP检测反应体系为25 L， 其中包括以下终浓度成分： 20 mM Tris-HCl、 10 mM (NH4)2SO4、 6.0 mM MgSO4、 50 mM KCl、 0.8 mM 甜菜碱、 1.4 mmolL-1 dNTPs、 8 U Bst DNA聚合酶、 1.6 molL-1的FIP和BIP、 0.2 molL-1的F3和B3， 1 L模板 DNA （50-100。

30、 ng） ， 无菌双蒸水补充至25 L， 在PCR管盖上加入2 L的1000SYBR Green ； LAMP反应条件： 65 温育60 min， 85灭活10 min， 冰上终止反应。 反应结果的测定： 采用 荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。 采用荧光染料目测观察法， 待LAMP反 应结束后， 瞬时离心， 将SYBR Green 离心到PCR管的底部， 观察颜色变化。 显色结果观察到 绿色荧光的判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌； 橙色或橘黄色判断为阴性， 不存在建兰茎腐病 菌。 采用琼脂糖凝胶电泳法， 取2.0 L LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如出现梯 形条带判断。

31、为阳性， 存在建兰茎腐病菌； 没有出现条带则判断为阴性， 不存在建兰茎腐病 菌。 0024 4. 建兰茎腐病菌LAMP检测引物特异性验证 以建兰茎腐病菌， 多肉炭疽病菌， 菠萝黑斑病菌， 建兰炭疽病菌， 建兰黑斑病菌， 豇豆疫 霉菌和番茄叶霉菌等供试菌株的DNA为模板， 阴性对照无菌双蒸水， 利用外侧引物F3/B3和 内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增， LAMP检测反应体系为25 L， 其中包括以下终浓度成分： 20 mM Tris-HCl、 10 mM (NH4)2SO4、 6.0 mM MgSO4、 50 mM KCl、 0.8 mM 甜菜碱、 1.4 mmolL-1 dNTPs、 。

32、8 U Bst DNA聚合酶、 1.6 molL-1的FIP和BIP、 0.2 molL-1的F3和B3， 1 L模板 DNA （50-100 ng） ， 无菌双蒸水补充至25 L， 在PCR管盖上加入2 L的1000SYBR Green ； LAMP反应条件： 65 温育60 min， 85灭活10 min， 冰上终止反应。 反应结果的测定： 采用 荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。 采用荧光染料目测观察法， 待LAMP反 应结束后， 瞬时离心， 将SYBR Green 离心到PCR管的底部， 观察颜色变化。 显色结果观察到 绿色荧光的判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 橙色或橘黄。

33、色判断为阴性， 不存在建兰茎腐病 菌； 采用琼脂糖凝胶电泳法， 取2.0 L LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如出现梯 形条带判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 没有出现条带则判断为阴性， 不存在建兰茎腐病 菌。 0025 5. 引物特异性检测和特异性验证结果LAMP特异性检测扩增结果表明， 供试的建 兰茎腐病菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带， 阴性对 照无菌双蒸水显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带 （附图1） ， 说明设计的 建兰茎腐病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP所建立的LAMP检测方法具有特异性。 LAMP 特异性验证。

34、结果表明， 供试的建兰茎腐病菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳 出现LAMP特征的梯形带， 其余病原菌和阴性对照无菌双蒸水显色结果为橙色或琼脂糖凝胶 电泳没有出现扩增条带 （附图2） ， 说明设计的建兰茎腐病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/ BIP所建立的LAMP检测方法可以将建兰茎腐病菌与其它病原菌区分开来， 具有种的特异性， 可用于建兰茎腐病菌快速可靠的检测和鉴定。 0026 实施例2： 建兰茎腐病菌LAMP检测灵敏度测定 说明书 5/7 页 7 CN 109182591 A 7 1. 不同浓度基因组DNA的制备 用无菌双蒸水对建兰茎腐病菌基因组DNA进行稀释， 配制成10倍。

35、数量级的系列浓度备 用。 0027 2. LAMP检测灵敏度测定及结果观察 以不同浓度的建兰茎腐病菌基因组DNA为模板， 利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/ BIP进行LAMP扩增， LAMP检测反应体系为25 L， 其中包括以下终浓度成分： 20 mM Tris- HCl、 10 mM (NH4)2SO4、 6.0 mM MgSO4、 50 mM KCl、 0.8 mM 甜菜碱、 1.4 mmolL-1 dNTPs、 8 U Bst DNA聚合酶、 1.6 molL-1的FIP和BIP、 0.2 molL-1的F3和B3， 1 L模板DNA （不同 稀释浓度模板10 ng L-1、 1。

36、 ng L-1、 100 pg L-1、 10 pg L-1、 1 pg L-1、 100 fg L-1、 10 fg L-1 、 1 fg L-1） ， 无菌双蒸水补充至25 L， 在PCR管盖上加入2 L的1000 SYBR Green 。 65温育60 min， 85灭活10 min， 冰上终止反应。 反应结果的测定： 采用荧 光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。 采用荧光染料目测观察法， 待LAMP反应 结束后， 瞬时离心， 将SYBR Green 离心到PCR管的底部， 观察颜色变化。 显色结果观察到绿 色荧光的判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 橙色或橘黄色判断为阴性， 不存。

37、在建兰茎腐病 菌； 采用琼脂糖凝胶电泳法， 取2.0 L LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如出现梯 形条带判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 没有出现条带则判断为阴性， 不存在建兰茎腐病 菌。 0028 3. LAMP检测灵敏度测定结果 LAMP检测灵敏度测定结果表明， 10 ng L-1、 1 ng L-1、 100 pg L-1、 10 pg L-1、 1 pg L-1、 100 fg L-1、 10 fg L-1浓度的建兰茎腐病菌基因组DNA显色结果可观察到 绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带， 100 fg L-1浓度显色结果为橙色或 琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增。

38、条带， 说明所设计的建兰茎腐病菌外侧引物F3/B3和内侧引 物FIP/BIP通过LAMP扩增， 对建兰茎腐病菌的检测灵敏度可达1 pg L-1（附图3） 。 0029 实施例3： 发病组织中建兰茎腐病菌的LAMP快速检测 1.样品采集 从福建漳州诏安和南靖等地采集建兰茎腐病发病症状典型的植株及健康植株带回实 验室备用。 0030 2.植物组织DNA的提取 采用NaOH快速裂解法提取DNA， 具体过程如下： 向每毫克植物组织中加入10 L 0.5 molL-1 NaOH， 在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中， 12,000 rpm离心6 min， 取上清液5 l加入495 L 。

39、0.1 molL-1 Tris-HCl （pH=8.0） 混合均匀， 取1.0 L （50- 100 ng） 作为PCR模板进行扩增。 0031 3. LAMP快速检测及观察 以上述提取的DNA为模板， 利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增， LAMP 检测反应体系为25 L， 其中包括以下终浓度成分： 20 mM Tris-HCl、 10 mM (NH4)2SO4、 6.0 mM MgSO4、 50 mM KCl、 0.8 mM 甜菜碱、 1.4 mmolL-1 dNTPs、 8 U Bst DNA聚合酶、 1.6 molL-1的FIP和BIP、 0.2 molL-。

40、1的F3和B3， 1 L模板DNA （50-100 ng） ， 无菌双蒸水补充 至25 L， 在PCR管盖上加入2 L的1000SYBR Green 。 65温育60 min， 85灭活10 min， 冰上终止反应。 反应结果的测定： 采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。 说明书 6/7 页 8 CN 109182591 A 8 采用荧光染料目测观察法， 待LAMP反应结束后， 瞬时离心， 将SYBR Green 离心到PCR管的底 部， 观察颜色变化。 显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 橙色或橘 黄色判断为阴性， 不存在建兰茎腐病菌； 采用琼脂糖凝胶电泳。

41、法， 取2 L LAMP扩增产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如出现梯形条带判断为阳性， 存在建兰茎腐病菌， 没有出现条带则 判断为阴性， 不存在建兰茎腐病菌。 0032 4. 发病组织中建兰茎腐病菌的LAMP快速检测结果 检测结果 （附图4） 表明， 建兰茎腐病发病的根、 茎部通过LAMP扩增， 显色结果可观察到 绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带， 说明存在建兰茎腐病菌， 而健康组织 显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带， 说明不存在建兰茎腐病菌， 该套技 术能用于植物组织中建兰茎腐病菌的快速分子检测。 0033 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利。

42、范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 7/7 页 9 CN 109182591 A 9 SEQUENCE LISTING 福建省农业科学院植物保护研究所 一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法 4 4 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 人工序列 1 gcctgttcga gcgtcatt 18 2 20 DNA 人工序列 2 acctgatccg aggtcaacat 20 3 40 DNA 人工序列 3 gccaatcaat ttggggaacg cgtcaaccct caagcacagc 40 4 40 DNA 人工序列 4 ggtcacgtcg agcttccata gcagttgggg tttaacggcg 40 序列表 1/1 页 10 CN 109182591 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 109182591 A 11 图3 图4 说明书附图 2/2 页 12 CN 109182591 A 12 。