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一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物及其制备方法和应用.pdf

  • 上传人：没水****6
  • 文档编号：8896348
  • 上传时间：2021-01-10
  • 格式：PDF
  • 页数：15
  • 大小：630KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201510787718.4

    		 申请日：

    20151117
    公开号：

    CN105330703B

    		 公开日：

    20171201
    当前法律状态：

    		有效性：

    有效
    法律详情：

    IPC分类号：

    C07F19/00,A61P35/00

    		 主分类号：

    C07F19/00,A61P35/00
    申请人：

    河南大学
    发明人：

    陈利娟,罗婕,马鹏涛,赵俊伟,谢志刚,马杏,李海楼
    地址：

    475001 河南省开封市明伦街85号
    优先权：

    CN201510787718A
    专利代理机构：

    郑州联科专利事务所(普通合伙)

    		 代理人：

    刘建芳;杨海霞
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    内容摘要

    本发明涉及一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物，该簇合物的化学式为[H2N(CH3)2]6Na24H16{[Tb10W16(H2O)30O50](B‑α‑AsW9O33)8}·97H2O，属于三斜晶系，P–1空间群，晶胞参数为a=18.940(4)Å，b=24.333(5)Å，c=29.920(6)Å，α=104.699(4)°，ß=101.781(4)°，γ=95.444(4)°，V=12900(4)Å3，Z=1，R1=0.1515，wR2=0.3596。研究发现该簇合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF‑7有明显的生长抑制作用，可用于制备抗宫颈癌和抗乳腺癌药物。

    权利要求书

    1.十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物，其化学式为：[HN(CH)]NaH{[TbW(HO)O](B-α-AsWO)}·97HO。 2.权利要求1所述十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在搅拌条件下，将NaWO·2HO和(CH)NH·HCl溶解到蒸馏水中，然后滴加NaAsO溶液，将pH调至4.0－4.5后加入Tb(NO)·6HO，再将pH调至4.0－4.5，室温搅拌30min以上，然后过滤，滤液静置至析出无色棱柱状晶体，再次过滤，晶体室温晾干即为目标化合物十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物；所述NaWO·2HO、(CH)NH·HCl、NaAsO、Tb(NO)·6HO和蒸馏水的摩尔比为8.5–10︰12.3–35.5︰1.0–2.3︰0.9–4.1︰2222。 3.权利要求1所述的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物在制备抗癌药物中的应用。 4.如权利要求3所述十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述抗癌药物为抗宫颈癌药物或抗乳腺癌药物。

    说明书

    技术领域

    本发明属于多钨酸盐化学材料制备技术领域，具体涉及一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物、制备方法及其在抗癌活性方面的应用。

    背景技术

    众所周知，癌症是威胁人类健康的重要疾病之一，近年来随着生态环境的恶化和饮食的多元化导致癌症的发病率呈逐年上升趋势，对人类的危害日趋严重。化疗虽然已作为治疗癌症的一种重要医疗手段，但是也因其毒副作用大、费用高等缺点而使其应用受到极大限制。因此寻找高效低毒的广谱型抗癌药物已迫在眉睫。多金属氧酸盐是由高价的前过渡金属离子（通常为 MoV，MoVI，WVI，VV，NbV 或TaV）通过氧原子连接形成的一类多核配合物，其独特的富氧表面、可控的结构以及较好的氧化还原活性赋予了它们在催化、磁性、药物等领域具有重要应用价值。值得指出的是多金属盐阴离子可与一些特殊的生物分子可能发生的氧化还原作用以及相对较强的静电库仑作用使其在药物的合成、分离、鉴定等方面均具优势。自上世纪七十年代起，多金属氧酸盐已被用于抗病毒、抗肿瘤等方面的研究。例如1971年，法国Raynaud等率先报道了[SiW12O40]4–在抗病毒方面的药物活性研究（参见 M. Raynaud，J. C. Chermann，F. Plata，et al. C. R. Acad. Sci. Ser. D. 1971，272，347）。1985 年，法国Domont等研究了(NH4)17Na[NaSb9W21O86]·14H2O (HPA-23)在抑制艾滋病病毒逆转录酶中的作用（参见 D. Domont，B. Spire，F. Barre-Sinoussi，et al. Ann Inst Pastear / Virol. 1985，136E，75)。首例具有抗HIV病毒活性的多钼酸盐(NH4)12H2[Eu4Mo29O100(H2O)16]·13H2O(PM-104)被Inouye等在1991年报道（参见Y. Inouye，Y. Tokutake，T. Yoshida，Chem. Pharm. Bull.1991，39，1638）。1996年，Yamase等发现饱和Keggin、缺位Keggin、Wells–Dawson和Keggin夹心型等结构的多钨酸盐在抗金黄色葡萄球菌方面的具有活性（参见T. Yamase，N. Fukuda，Y. Tajima，Biol. Pharm. Bull.1996，19，459）。本世纪初，对于多金属氧酸盐药物化学方面的研究又进入了一个新阶段。2001 年，Hill等首次使用计算机模拟研究了含铌Wells–Dawson结构与HIV-1蛋白之间的相互作用的情况（参见D. A. Judd，J. H. Nettles，C. L. Hill，et al. J. Am. Chem. Soc.2001，123，886）。2005年，王恩波等首次利用复分解反应和离子交换合成了钒钨酸盐Pr2H[NiV13O38]，该化合物对口腔癌细胞的生长显示出十分高效的抑制作用（参见Y. Liu，S. Tian，S. Liu，E. Wang. Transition Met. Chem.2005，30，113）。2010年，Dolbecq等研究了含有双磷酸盐配体的多金属氧酸盐在抑制肿瘤细胞方面的药物活性（参见J.-D. Compain，P. Mialane，A. Dolbecq，et al. Chem. Eur. J. 2010，16，13741）。目前关于多金属氧酸盐的抗癌活性研究主要集中在小分子量以及小尺寸的多钨氧酸盐过渡金属衍生物和钼氧酸盐有机衍生物上，但是对具有纳米尺度的高核稀土取代多金属氧酸盐抗癌活性研究几乎是一片空白。

    发明内容

    本发明目的在于提供一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物及其制备方法和应用。

    为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

    十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物，其化学式为：[H2N(CH3)2]6Na24H16{[Tb10W16 (H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}·97H2O。

    上述十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的制备方法，其包括如下步骤：

    在搅拌条件下，将Na2WO4·2H2O和(CH3)2NH·HCl溶解到蒸馏水中，逐滴滴加NaAsO2溶液，将pH调至4.0－4.5后加入Tb(NO3)3·6H2O，再用盐酸将pH调至4.0－4.5，室温搅拌30 min以上，然后过滤，滤液静置至析出无色棱柱状晶体，再次过滤，晶体室温晾干即为目标化合物；

    所述Na2WO4·2H2O、(CH3)2NH·HCl、NaAsO2、Tb(NO3)3·6H2O和蒸馏水的摩尔比为8.5–10︰12.3–35.5︰1.0–2.3︰0.9–4.1︰2222。

    上述的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物在制备抗癌药物中的应用，尤其是在制备抗宫颈癌或抗乳腺癌药物中的应用。

    本发明利用简单的常温水溶液法的优点，在有机增溶剂盐酸二甲胺存在的条件下，将钨酸钠、硝酸铽与亚砷酸钠按一定的摩尔配比进行反应得到一种新颖的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物。在该反应中，亚砷酸根的AsIII元素具有孤对电子化学空间立体效应，一方面可阻止经典的饱和Keggin结构的形成，另一方面亚砷酸根基团引入钨酸钠反应体系后不但可以形成结构多变的砷钨氧酸盐片段，而且可有效地增加砷钨氧酸盐片段携带的负电荷，这有利于砷钨氧酸盐片段键合更多的稀土离子，进而组装高核稀土取代砷钨氧酸盐纳米簇。具有较大离子半径和高配位数的稀土离子对砷钨氧酸盐构筑块进一步组装成纳米簇起着结构诱导和稳定作用。缓慢蒸发、静置结晶过程为高核稀土取代砷钨氧酸盐纳米簇的形成提供了有利条件。

    本发明使用X-射线单晶衍射技术（参见Sheldrick G. M. SHELXTL−97, Program for Crystal Structure Solution. University of Göttingen, Germany，1997）对目标化合物的晶体结构进行了测定和表征，其晶胞参数如下：

    化合物[H2N(CH3)2]6Na24H16{[Tb10W16(H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}·97H2O属于三斜晶系，P-1空间群，单胞参数a = 18.940(4) Å，b = 24.333(5) Å，c = 29.920(6) Å，α = 104.699(4)°，ß = 101.781(4)°，γ= 95.444(4)°，V = 12900(4) Å3，Z = 1，R1 = 0.1515，wR2 = 0.3596。其对称分子单元由1个矩形的十核铽包含的钨氧簇片段[Tb10W16(H2O)30O50]26+连接八个三缺位[B-α-AsW9O33]9–构筑块构成的八聚亚单元{[Tb10W16(H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}46–（见图1a，图1b）、6个[H2N(CH3)2]+、24个Na+离子、16个H+离子和97个结晶水分子构成。八聚的十核铽砷钨氧酸盐簇阴离子{[Tb10W16(H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}46–是由8个三缺位[B-α-AsW9O33]9–构筑块在50个外来氧原子的帮助下通过10个铽离子和16个钨原子连接而成的。在{[Tb10W16(H2O)30O50] (B-α-AsW9O33)8}46–的骨架中，八个三缺位[B-α-AsW9O33]9–构筑块对称的分布在矩形的十核铽包含的钨氧簇片段[Tb10W16(H2O)30O50]26+周围。据我们所知，这种矩形的十核铽包含的钨氧簇片段[Tb10W16(H2O)30O50]26+是首次被观察到。在该簇合物中，所有的钨原子采用六配位八面体配位模式。在矩形金属中心中[Tb10W16(H2O)30O50]26+铽原子采用两种配位模式：一种是畸变的八配位四方反棱柱几何构型，另一种是七配位单帽三棱柱几何构型。值得一提的是从{[Tb10W16(H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}46–的骨架中将所有的铽原子移除后能够得到一种与该骨架结构类似的八十八核钨簇（见图1c），这种现象进一步证明了铽原子对于该十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的结构稳定作用。

    本发明对十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的红外光谱（见图2）和热分析行为（见图3）进行了表征及分析。其红外光谱在1100−600cm−1范围内出现了多酸特征峰950、867、786和711 cm−1，它们分别归属于ν(W–Ot)、ν(As–Oa)、ν(W–Ob)和ν(W–Oc)键的不对称伸缩振动。簇合物中有机抗衡离子[H2N(CH3)2]+中的N–H和C–H键的弯曲振动峰分别出现在1633和1467 cm−1处，而N–H和C–H键的伸缩振动分别出现在3163和2810 cm–1处。此外，在3438 cm–1处出现强的吸收谱带证明该簇合物中含有结晶或配位水分子；十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的热稳定性分析如下：在热重曲线上，25到200℃之间的第一步缓慢失重为6.47%（理论值：6.59%），主要是对应于97个结晶水分子的失去；200到650℃之间的第二步失重为4.08%（理论值：3.80%），主要对应于30个配位水分子，6个二甲胺，22个氢质子的失去；650到900℃之间的第三步失重为3.21%（理论值：2.99%），主要是由于失去 4个As2O3分子引起的。

    在本发明中，借助紫外光谱对十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物在溶液中的稳定性进行了研究。在其紫外光谱中，出现在194 nm处的强吸收峰，归属为Ot→W的pπ–dπ电荷转移跃迁，而出在248 nm处的弱吸收峰，归属为Ob(c)→W的pπ–dπ电荷转移跃迁（见图4）。另外，研究了十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物在水溶液中的稳定性随时间和酸碱度变化的情况（如图5所示），结果表明目标化合物在水溶液中可稳定8天左右，在水溶液中稳定的pH范围为3.90–7.50（涵盖人体血液pH值范围：7.30–7.50）。这些研究结果为该簇合物的抗癌活性研究奠定了基础。

    为探讨十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用，采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法对目标化合物的细胞毒性进行分析。活细胞的线粒体中的活性琥珀酸脱氢酶能够还原MTT，形成不溶性的蓝紫色甲瓒（Formazan）结晶物沉积在活细胞中。相反，死细胞则无法还原MTT，细胞内无蓝紫色物质产生。经二甲亚砜（DMSO）裂解后，活细胞中的甲瓒被溶出，用酶标仪在490 nm波长处测定其光吸收值可间接反映出样品中活细胞数量的多少。目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7具有明显的生长抑制作用同时呈剂量依赖性（见图6），其半数抑制浓度(即IC50值)见表1。研究结果表明，十核铽取代砷钨酸盐纳米簇合物的形成使得目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa（IC50 = 1.51 µM）和人乳腺癌细胞MCF-7（IC50 = 1.52 µM）的生长具有较好抑制作用，显著地超越了砷钨酸盐前驱体K14[As2W19O67(H2O)]（对人宫颈癌细胞HeLa：IC50 = 5.22 µM；对人乳腺癌细胞MCF-7：IC50 = 6.06 µM）。

    为了研究目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7凋亡过程，采用 Calcein-AM / PI活死细胞双染色试验结合Annexin V-FITC / PI双荧光标记试验来评估目标化合物诱导人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡程度，采用光学显微镜来追踪人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7凋亡过程中的形貌变化。

    Calcein-AM / PI活死细胞双染色试验：Calcein-AM（calcein acetoxymethy）酯是一种细胞质的荧光标记物，其本身并无荧光，但当其渗入到细胞中，被活细胞中的内酯酶催化后，会生成的水溶性的绿色荧光物质困于细胞内。所以，Calcein-AM通常用来标记活细胞。而碘化丙啶（PI）作为荧光染料可以进入细胞膜已经被破坏的死细胞中，与其细胞核中的染色体结合，死细胞将被标记成红色。所以，用Calcein-AM和PI共同标记细胞，可在荧光显微镜下同时观察到活细胞和死细胞。从图7可以清晰地看出用目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7处理6 h后部分癌细胞已死亡。

    Annexin V-FITC / PI荧光标记试验：通常情况下，正常细胞中的磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl serine, PS）分布于细胞膜的脂质双层内侧。但在细胞出现凋亡时，细胞膜脂质双层内侧的PS将会翻向细胞膜的外侧。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到细胞膜外的PS以较高的亲和力特异性结合。因此，可通过Annexin V用荧光素FITC （硫氰酸荧光素）标记后的Annexin V-FITC通过与PS的结合，标记出处于凋亡阶段的细胞。而PI是一种DNA染料，能够透过在凋亡中期、晚期或者死细胞的细胞膜，进而使其细胞核呈现红色。从图8可以清晰地看出用目标化合物可诱导人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞 MCF-7处理6 h后部分癌细胞凋亡。

    细胞在凋亡过程中会伴随着形态变圆、体积减小、核固缩、染色质凝聚、核破裂等一系列变化。利用光学显微镜可以看到细胞在凋亡过程中的形貌变化。图9中显示用目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7处理后癌细胞在凋亡过程中由原始形貌逐渐变圆、缩小，至11 h后全部凋亡。

    本发明提供了一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的制备方法及其抗癌活性研究，其优点主要集中在以下四个方面：

    1）本发明提供的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的晶体结构特征可通过X-射线单晶衍射技术准确确定；

    2）本发明提供的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物采用常规水溶液方法合成，制备工艺简单，成本较低，产率较高，应用前景较好；

    3）本发明提供的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物对人宫颈癌细胞HeLa（IC50 = 1.51 µM）和人乳腺癌细胞MCF-7（IC50 = 1.52 µM）的生长具有较好抑制作用，显著地超过了砷钨酸盐前驱体K14[As2W19O67(H2O)]（对人宫颈癌细胞 HeLa：IC50 = 5.22 µM；对人乳腺癌细胞MCF-7：IC50 = 6.06 µM）；

    4）本发明提供的研究结果是首例十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物药物活性的研究，对高核稀土取代多金属氧酸盐作为新的抗癌药物的可行性提供了研究基础。

    附图说明

    图1中，a)为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的分子单元结构图，b)为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的简化图，c)为将铽原子从十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物去除后的八十八核钨氧簇合物图；

    图2为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的红外光谱图，显示出该簇合物中W–O、As–O、N–H、C–H及水分子的特征振动吸收带；

    图3为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的热重曲线，表明失重过程主要归属于结晶配位水、配位水、二甲胺、质子以及三氧化二砷的失去；

    图4为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的紫外光谱，其中194 nm处的强吸收峰，归属为Ot→W的pπ–dπ电荷转移跃迁，而出在248 nm处的弱吸收峰，归属为Ob(c)→W的pπ–dπ电荷转移跃迁；

    图5为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物在水溶液中随时间（a）和pH（b，c）稳定性研究，结果表明该簇合物在溶液中稳定时间约为8天，该簇合物在溶液中稳定的pH范围为3.90–7.50；

    图6为目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率柱状图，此图说明了目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7具有明显的生长抑制作用；

    图7中，上图为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物（1 mg/mL）对人宫颈癌细胞HeLa作用的Calcein-AM / PI双染色6 h试验，下图为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物（1 mg/mL）对人乳腺癌细胞MCF-7作用的Calcein-AM / PI双染色6 h试验；

    图8中，上图为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物（1 mg/mL）对人宫颈癌细胞HeLa作用的Annexin V-FITC / PI双荧光标记6 h试验，下图为十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物（1 mg/mL）对人乳腺癌细胞MCF-7作用的Annexin V-FITC / PI双荧光标记6 h试验；

    图9为目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7生长抑制过程的光学显微镜图。

    具体实施方法

    以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但在此说明本发明的保护范围并不局限于以下内容。

    实施例1：

    一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物，其化学式为：[H2N(CH3)2]6Na24H16{[Tb10W16 (H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}·97H2O。

    上述的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物采用传统的常温水溶液法合成得到，其制备方法具体如下：

    在搅拌条件下将1.400 g (4.240 mmol) Na2WO4·2H2O和0.502 g (6.156 mmol) (CH3)2NH·HCl 溶解到20 mL蒸馏水中，逐滴滴加0.5 mL（1 mol·L–1）NaAsO2溶液。用6 mol·L–1的盐酸将上述溶液pH值调至4.0后加入0.199 g (0.439 mmol) Tb(NO3)3·6H2O，再用0.5 mol·L–1的盐酸将pH调至4.0，室温搅拌30 min，静置过滤，滤液静置数周后析出无色棱柱状晶体，再次过滤，晶体室温晾干得0.35 g目标化合物（按Tb(NO3)3·6H2O计算产率约为30%）。

    实施例2：

    一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物，其化学式为：[H2N(CH3)2]6Na24H16{[Tb10W16 (H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}·97H2O。

    上述的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物采用传统的常温水溶液法合成得到，其制备方法如下：

    在搅拌条件下将1.400 g (4.240 mmol) Na2WO4·2H2O和0.502 g (6.156 mmol) (CH3)2NH·HCl溶解到20 mL蒸馏水中，逐滴滴加0.5 mL（1 mol·L–1 ）NaAsO2溶液。用6 mol·L–1的盐酸将上述溶液pH值调至4.0后加入0.212 g (0.439 mmol) Tb(NO3)3·6H2O，再用0.5 mol·L–1 的盐酸将pH调至4.0，室温搅拌30 min，静置过滤，滤液静置数周后析出无色棱柱状晶体，再次过滤，晶体室温晾干得0.41 g目标化合物（按Tb(NO3)3·6H2O计算产率约为35%）。

    实施例3：

    一种十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物，其化学式为：[H2N(CH3)2]6Na24H16{[Tb10W16 (H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}·97H2O。

    上述的十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物采用传统的常温水溶液法合成得到，其制备方法具体如下：

    在搅拌条件下将1.400 g (4.240 mmol) Na2WO4·2H2O和0.502 g (6.156 mmol) (CH3)2NH·HCl 溶解到20 mL蒸馏水中，逐滴滴加0.5 mL（1 mol·L–1）NaAsO2 溶液。用6 mol·L–1的盐酸将上述溶液pH值调至4.5后加入0.212 g (0.439 mmol) Tb(NO3)3·6H2O，再用0.5 mol·L–1 的盐酸将pH调至4.5，室温搅拌30 min，静置过滤，滤液静置数周后析出无色棱柱状晶体，再次过滤，晶体室温晾干得0.31 g目标化合物（按Tb(NO3)3·6H2O计算产率约为27%）。

    应用试验1

    将人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7分别在辅以10%热灭活胎牛血清液(FBS, GIBCO)的达尔伯克氏改良伊格尔(DMEM，GIBCO)培养基中进行培养（37 ℃、5%CO2的培养箱中培养），培养基每日更换一次。细胞毒性采用MTT法确定。试验以每孔中细胞数为 2 × 103个接种于96孔塑料培养板中，次日，在每个孔中加入100 μL溶解在培养液中的不同浓度的H2N(CH3)2]6Na24H16{[Tb10W16(H2O)30O50](B-α-AsW9O33)8}·97H2O以及K14[As2 W19O67(H2O)]溶液。48 h后，20 μL溶解于磷酸盐缓冲生理盐水中的浓度为5 mg/mL的MTT被加入每个培养孔中。在37℃下继续培养4 h，随后将包含MTT的细胞培养液移除，依次加入150 μL二甲基亚砜于每个培养孔中，以溶解被还原的MTT的蓝紫色结晶甲瓒。用酶标仪检测96孔板振动5 min后在490 nm波长处的吸光度(OD值)，依据公式计算出细胞生长抑制率以及抑制率为50%时的浓度(即半数抑制浓度IC50)，结果见图6和表1。

    细胞生长抑制率＝[(空白对照OD值－给药组的OD值)/空白对照OD值]×100%。

    表1

    表1为目标化合物以及砷钨酸盐前驱体K14[As2W19O67(H2O)]对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7 的半数抑制浓度(即IC50 值)，数据显示该化合物对人宫颈癌细胞Hela（IC50 = 1.51 µM）和人乳腺癌细胞 MCF-7（IC50 = 1.52 µM）的生长具有明显的抑制作用，优于砷钨酸盐前驱体 K14[As2W19O67(H2O)]（对人宫颈癌细胞 HeLa：IC50 = 5.22 µM；对人乳腺癌细胞 MCF-7：IC50 = 6.06 µM）。

    由图6可知：十核铽取代砷钨氧酸盐纳米簇合物的形成使其对人宫颈癌细胞HeLa (IC50 = 1.51 µM)和人乳腺癌细胞MCF-7(IC50 = 1.52 µM)的生长具有较好抑制作用，并且显著地超过了砷钨酸盐前驱体K14[As2W19O67(H2O)]（对人宫颈癌细胞HeLa：IC50 = 5.22 µM；对人乳腺癌细胞MCF-7：IC50 = 6.06 µM）。

    应用试验2

    将对数生长的人宫颈癌细胞HeLa及人乳腺癌细胞 MCF-7以105/孔的浓度分到12孔板中过夜培养，次日换上新鲜培养基并加入终浓度为1 mg/mL的目标化合物，并在细胞培养箱中培养6小时，用PBS缓冲液轻轻润洗3次，加入含有Calcein-AM (2 μM)和PI (8 μM)的PBS室温孵育30分钟。最后，用荧光显微镜对细胞进行荧光成像。结果见图7。从图7中可以清晰地看出：目标化合物对人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7处理6 h后，部分癌细胞已死亡。

    应用试验3

    将对数生长的人宫颈癌细胞HeLa及人乳腺癌细胞MCF-7以105/孔的浓度分到12孔板中过夜培养，次日换上新鲜培养基并加入终浓度为1 mg/mL的目标化合物，并在细胞培养箱中培养6小时，用PBS缓冲液轻轻润洗3次，加入500 μL含有5μL Annexin V-FITC和5μL PI溶液的结合缓冲液。在室温下，避光孵育5分钟后用荧光显微镜对细胞进行荧光成像。结果见图8。由图8可以看出：目标化合物诱导人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞 MCF-7处理6 h后，部分癌细胞凋亡。

    应用试验4

    将对数生长的人宫颈癌细胞HeLa及人乳腺癌细胞MCF-7以2×105/孔的浓度分到6孔板中过夜培养，次日换上新鲜培养基并加入终浓度为1 mg/mL的目标化合物，并在细胞培养箱中培养，用光学显微镜记录不同时间0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和11 h时细胞形貌变化。结果见图9。从图9中可以清晰地看出：随时间的推移，人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7逐渐收缩，形貌逐渐变圆。该现象进一步表明目标化合物可以促使人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7发生凋亡。

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    一种 十核铽 取代 砷钨氧酸盐 纳米 簇合物 及其 制备 方法 应用
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