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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811180685.7 (22)申请日 2018.10.09 (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92号 (72)发明人 崔晋龙 (74)专利代理机构 太原市科瑞达专利代理有限 公司 14101 代理人 刘宝贤 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种植物内生真菌菌种的保藏方法 (57)摘要 本发明提供了一种植物内生真。
2、菌菌种的保 藏方法， 步骤如下： (1)将普通白纸剪成若干小 块， 并自制信封， 制作土豆培养基； (2)将纸片、 信 封、 土豆培养基、 培养皿、 镊子于121高压灭菌 20min； 将灭菌好的土豆培养基倒入灭菌的培养 皿制成培养基平板； (3)将待保藏的内生真菌菌 株， 接种于平板， 长满后， 打取直径0.5-1cm的菌 饼； (4)无菌条件下， 将菌饼接种于新的培养基平 板中央， 将灭菌的纸块摆放于菌饼周围， 加盖， 25 条件下培养； (5)待菌丝生长布满纸片后， 无菌 镊子将布满菌丝的纸片放置于无菌的信封中封 口； 将信封干燥一周后置于-20条件下， 保藏。 该方法具有操作简单、 成。
3、本低、 设备要求低、 取用 方便、 成活率高、 占用空间小等特点。 权利要求书1页 说明书4页 CN 109207375 A 2019.01.15 CN 109207375 A 1.一种植物内生真菌菌种的保藏方法， 其特征在于包括如下步骤： (1)将普通白纸剪成1cm13cm大小若干块， 放入干净培养皿， 用报纸包裹； 自制10cm 1020cm尺寸的信封， 折叠口部； 制作1L土豆培养基： 取土豆块200g煮熟， 粉碎， 过滤， 在 滤汁中， 加入20g葡萄糖， 18g琼脂， 加去离子水至1L； (2)将上述装有纸片的培养皿、 信封、 土豆培养基， 培养皿、 镊子置于121高压灭菌 20mi。
4、n； 将灭菌好的土豆培养基倒入灭菌的培养皿制成培养基平板， 备用； (3)将待保藏的植物内生真菌菌株， 接种于培养基平板， 长满后， 打取直径0.5-1cm的菌 饼， 备用； (4)无菌条件下， 将直径0.5-1cm的菌饼接种于新的培养基平板中央， 将灭菌的纸块摆 放于菌饼周围， 盖好培养皿， 放在25条件下培养； (5)待菌丝生长布满纸片后， 用无菌镊子将布满菌丝的纸片放置于无菌的信封中， 封 口， 记录菌名， 日期； 将信封放置于通风橱或者干燥器中干燥一周； 之后， 将信封置于-20 条件下， 保藏。 2.如权利要求1所述的一种植物内生真菌菌种的保藏方法， 其特征在于所述植物内生 真菌是保。
5、藏编号为CGMCC No.9347或编号为CGMCC No.11417的真菌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109207375 A 2 一种植物内生真菌菌种的保藏方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物保藏， 具体属于一种植物内生真菌菌种的保藏方法。 背景技术 0002 植物内生真菌是一类生长于植物组织间隙或者细胞内部， 但不引起植物过敏反应 的真菌。 一般呈无性型生长， 大多属于半知菌属真菌。 截至目前， 在所有被研究过的植物中， 都发现了内生真菌的存在， 这大大的拓展了人们对真菌的种类和数量的预估， 也加深了人 们对自然界生命形式的认识。 由于生物功能和代谢的多样性， 内生真菌为药。
6、物的新药发现、 生物防控病害、 促进植物生长发育、 调控药用植物代谢产物积累等方面提供了越来越多的 选择机会和途径。 0003 菌种保藏是内生真菌资源开发和研究的重要环节， 是促进内生真菌可持续应用和 研究的保证。 保藏方法都是通过某种途径降低真菌新陈代谢的速度， 最大限度的延长保藏 时间。 一个良好的保藏方法是在保证菌种的纯度、 成活率和稳定性基础上， 具有成本低、 操 作简单等优点。 目前， 内生真菌的保藏多采用传统的真菌保藏法， 主要包括： (1)试管斜面 法， 此法是将试管菌保藏于4， 3个月一次的菌种转接。 此方法适用于常用菌种的日常工 作， 但容易污染、 费工时、 占空间大； (2。
7、)以石蜡或矿物油封存斜面、 蒸馏水悬浮孢子、 沙土， 硅胶等为基质的保藏。 这些方法适合十年左右的菌种保藏， 主要存在操作复杂、 占空间大等 问题； (3)液氮保藏、 冷冻干燥保藏、 超低温冰箱保藏等优点是能对菌种进行50年以上的长 期保藏， 但是存在耗能大、 设备要求高， 连续使用过程中容易出现设备故障， 从而导致菌种 因反复冻融而死亡的情况。 0004 目前的保藏方法， 都存在着一定的缺点， 并不适合对所有内生真菌的保藏。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种占用空间小、 操作简单、 对设备要求低、 取用方便、 保 藏时间可长可短的植物内生真菌菌种的保藏方法。 0006 为实现上述。
8、目的， 本发明提供如下技术方案： 0007 一种植物内生真菌菌种的保藏方法， 步骤如下： 0008 (1)将普通白纸(如A4打印纸)剪成1cm13cm大小若干块， 放入干净培养皿， 报 纸包裹； 自制10cm1020cm尺寸的信封， 折叠口部； 制作1L土豆培养基： 取土豆块200g煮 熟， 粉碎， 过滤， 在滤汁中， 加入20g葡萄糖， 18g琼脂， 加去离子水至1L； 0009 (2)将上述装有纸片的培养皿、 信封、 土豆培养基， 培养皿、 镊子等用具于121高 压灭菌20min； 将灭菌好的土豆培养基倒入灭菌的培养皿制成培养基平板， 备用； 0010 (3)将待保藏的植物内生真菌菌株， 。
9、接种于培养基平板， 长满后， 打取直径0.5-1cm 的菌饼， 备用； 0011 (4)无菌条件下， 将直径0.5-1cm的菌饼接种于新的培养基平板中央， 将灭菌的纸 块摆放于菌饼周围， 盖好培养皿， 放在25条件下培养； 说明书 1/4 页 3 CN 109207375 A 3 0012 (5)待菌丝生长布满纸片后， 无菌镊子将布满菌丝的纸片放置于无菌的信封中， 封 口， 记录菌名， 日期等； 将信封放置于通风橱或者干燥器中干燥一周； 之后， 将信封置于-20 条件下， 保藏。 0013 所述植物内生真菌为保藏编号为CGMCC No.9347的红松头霉菌(Phialocephala fort。
10、inii)或编号为CGMCC No.11417的桦粉粒座孢真菌(Trimmatostroma botulinum)。 0014 保藏号CGMCC No.9347菌种的保藏单位： 中国微生物菌种管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)， 保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保藏 时间： 2014年7月10日。 该菌种已在中国专利201410468041.3中公开。 0015 保藏号CGMCC No.11417菌种的保藏单位： 中国微生物菌种管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)， 保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保藏 时间： 。
11、2015年11月6日。 该菌种已在中国专利201610011872.7中公开。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果： 0017 本发明通过将植物内生真菌附着生长在普通白纸上、 干燥后保藏于-20， 14天、 1 个月、 6个月、 1年、 2年时， 成活率均可达100， 生理生化及基因检测无异常。 该方法既适于 长期也适于短期保藏。 该方法具有操作简单、 成本低、 设备要求低、 取用方便、 成活率高、 占 用空间小等优势。 具体实施方式 0018 实施例1： 编号为CGMCC No.9347内生真菌鉴定为红松头霉菌(Phialocephala fortinii)的保藏： 0019 (1。
12、)将A4打印纸剪成1cm1cm大小若干块， 放入干净的培养皿， 报纸包好； 自制 10cm10cm尺寸的信封， 折叠口部； 制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方： 200g土豆块， 在煮 熟的滤汁中， 加入20g葡萄糖， 18g琼脂， 加去离子水至1L)； 0020 (2)将上述装有纸片的培养皿、 信封、 土豆培养基、 培养皿、 镊子等用具于121高 压灭菌20min； 将灭菌好的PDA培养基倒入灭菌的培养皿， 备用； 0021 (3)将纯化的红松头霉菌菌株接种于新的培养基平板， 长满后， 打取直径0.5cm的 菌饼， 备用； 0022 (4)无菌条件下， 将0.5cm的菌饼接种于新的P。
13、DA培养基平板， 将无菌的纸片摆放于 菌饼周围， 盖好。 放在25条件下培养； 0023 (5)当菌丝生长布满纸片后， 用镊子将所有纸片取下， 放置于无菌的信封中， 封口， 写菌名， 日期等； 将信封放置于通风橱或者干燥器中， 一周之后， 放-20冰箱， 保藏。 0024 (6)14天、 1个月、 6个月、 1年、 2年时， 将信封中的纸片取出， 长有真菌菌丝的一面朝 下， 放置于PDA培养基平板上， 放25培养。 同样地操作30个培养基平皿， 计算成活率， 成活 率分别均达100。 0025 实施例2： 编号为CGMCC No .11417的桦粉粒座孢真菌(Trimmatostroma bo。
14、tulinum)的保藏： 0026 (1)将A4打印纸剪成1cm3cm大小的纸块若干块， 放入干净的培养皿， 报纸包好； 自制10cm20cm尺寸的信封， 折叠口部； 制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方： 200g土豆块， 在煮熟的滤汁中， 加入20g葡萄糖， 18g琼脂， 加去离子水至1L)； 说明书 2/4 页 4 CN 109207375 A 4 0027 (2)将上述装有纸片培养皿、 信封、 土豆培养基、 培养皿、 镊子等相关用具于121 高压灭菌20min； 将灭菌好的PDA培养基倒入灭菌培养皿， 备用； 0028 (3)将纯化的真菌菌株， 接种新的培养基平板， 当菌丝长满时。
15、， 打取直径1cm的菌 饼， 备用； 0029 (4)无菌条件下， 将1cm的菌饼接种于新的PDA培养基平板， 将无菌纸片摆放于菌饼 周围， 盖好。 放在25条件下培养； 0030 (5)菌丝生长布满纸片后， 无菌条件下， 将纸片取下， 放置于无菌信封， 封口， 写菌 名， 日期等； 将信封放置于通风橱或者干燥器， 一周之后， 放-20， 保藏。 0031 (6)14天、 1个月、 6个月、 1年、 2年时， 无菌条件下， 将白纸附着菌丝的一面倒置于培 养基平板上， 同样的操作， 培养30个平皿， 计算成活率， 成活率均达到100， 生理生化及基 因检测无异常。 0032 比较例1： 编号为C。
16、GMCC No.9347内生真菌鉴定为红松头霉菌(Phialocephala fortinii)的10甘油的超低温保藏： 0033 (1)制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方： 200g土豆块， 在煮熟的滤汁中， 加入20g 葡萄糖， 18g琼脂， 加去离子水至1L)， 121高压灭菌20min； 将灭菌好的PDA培养基倒入灭菌 的培养皿， 备用； 0034 (2)取1.5mL的10甘油-水溶液至2mL的冻存管， 121高压灭菌20min； 0035 (3)将纯化的真菌菌株接种于PDA培养基上， 25条件下长满时， 用接种铲将菌块 接入上述处理的冻存管中； 0036 (4)将冻存管在4和。
17、-20条件下分别放置一周， 之后放入-80保藏。 分别于14 天、 1个月、 6个月、 1年、 2年的时候， 于室温条件下解冻。 将菌块挑出， 放PDA培养基上培养30 皿。 14天、 1个月、 6个月、 1年、 2年的成活率分别为100， 100， 100， 100， 96.67。 0037 比较例2： 编号为CGMCC No .11417的桦粉粒座孢真菌(Trimmatostroma botulinum)的液体石蜡保藏： 0038 (1)制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方： 200g土豆块， 在煮好后的滤汁中， 加入 20g葡萄糖， 18g琼脂， 加去离子水至1L)， 121高压灭。
18、菌20min； 将灭菌好的PDA培养基倒入 已高温灭菌的试管1/3处， 制作斜面。 0039 (2)将纯化的真菌菌株接种于试管斜面培养基， 25条件下培养。 0040 (3)准备液体石蜡， 在121灭菌20min。 0041 (4)斜面菌长满时， 将灭菌的液体石蜡倒入试管， 完全覆盖斜面菌， 密封， 将试管放 置于试管架上， 放4冰箱保藏。 0042 (5)分别于14天、 1个月、 6个月、 1年、 2年时， 将菌块挑出， 置于PDA培养基平板， 25 条件下， 培养30皿。 14天、 1个月、 6个月、 1年、 2年的成活率均为100。 0043 优缺点比较如表1： 0044 表1.内生真菌四种保藏方法的优缺点比较 说明书 3/4 页 5 CN 109207375 A 5 0045 说明书 4/4 页 6 CN 109207375 A 6 。