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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811181116.4 (22)申请日 2018.10.10 (71)申请人 北京奶牛中心 地址 100192 北京市朝阳区德胜门外清河 南镇 申请人 北京市畜牧总站 (72)发明人 赵凤刘林杨宇泽路永强 常卓赵春颖吕小青赵凤茹 (74)专利代理机构 北京汇智英财专利代理事务 所(普通合伙) 11301 代理人 郑玉洁 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 基于KASP技术检测-酪蛋白基因型的方法 (57)摘要 本发明涉及一种基。
2、于KASP技术检测-酪蛋 白基因型的方法， 包括如下步骤： 制备DNA样品； 制备好PCR扩增体系； 进行PCR扩增； PCR扩增体系 中的混合引物包括三种KASP引物： 上游突变基因 引物、 上游未突变基因引物以及下游引物， 并且， 上游突变基因引物及上游未突变基因引物中， 一 条设计有HEX荧光标签序列， 另一条设计有FAM荧 光标签序列； 根据PCR扩增后DNA样品的荧光强 度， 进行基因分型。 本发明实现了对奶牛中CSN3 三种常见变异体的全面筛选， 可充分利用基因检 测等领域的资源与技术优势培育优质种牛， 发掘 奶牛特色种质资源， 为牧场选择合适的奶牛， 提 高乳蛋白率， 从种源解决。
3、相关领域的技术瓶颈， 对奶牛良种产业健康发展具有重要意义。 权利要求书3页 说明书6页 附图1页 CN 109321639 A 2019.02.12 CN 109321639 A 1.一种基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 步骤S1： 制备DNA样品； 步骤S2： 制备好PCR扩增体系， 其中， 该扩增体系内包括50体积分数的DNA样品、 1.2- 1.6体积分数的混合引物， 以及余量的KASP混合液； 步骤S3： 进行PCR扩增； 其中， 步骤S2中添加的混合引物包括三种KASP引物， 分别为上游突变基因引物、 上游未 突变基因引物以及下游引物， 并且。
4、， 上游突变基因引物及上游未突变基因引物中中， 一条设 计有HEX荧光标签序列， 另一条设计有FAM荧光标签序列,以通过根据PCR扩增后DNA样品的 荧光强度， 进行基因分型。 2.如权利要求1所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 所述步 骤S2中， 所添加的混合引物包括四组， 其用于分别检测四处突变位点的碱基类型， 并且， 针 对不同的突变位点， 设计的引物如下： (1)所欲检测CSN3_136位点上的碱基类型时， 引物包括： 上游未突变基因引物 GAGCCTACAAGTACACCTACCAC、 上游突变基因引物GAGCCTACAAGTACACCTACCAT以及下。
5、游引物 GTAGCTACAGTGCTCTCTACTGCTT； (2)所欲检测CSN3_148位点上的碱基类型时， 引物包括： 上游未突变基因引物 AGAGCACTGTAGCTACTCTAGAAGA、 上游突变基因引物AGCACTGTAGCTACTCTAGAAGC以及下游引物 GTTGATCTCAGGTGGGCTCTCAATA； (3)所欲检测CSN3_155位点上的碱基类型时， 引物包括： 上游未突变基因引物 GTGTTGATCTCAGGTGGGCT、 上游突变基因引物GTGTTGATCTCAGGTGGGCC以及下游引物 GAGCACTGTAGCTACTCTAGAAGCTT； (4)所欲检测C。
6、SN3_168位点上的碱基类型时 ， 引物包括 ： 上游突变基因引物 TGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC、 上游未突变基因引物CTTTGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACT以 及下游引物TGAGATCAACACAGTCCAAGTTACTTCAA。 3.如权利要求2所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， (1)所欲检测CSN3_136位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度， 则 该位点上两条链均未突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两条链均突 变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该位点。
7、上两条链一条突变， 一条未突变； (2)所欲检测CSN3_148位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度， 则 该位点上两条链均未突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两条链均突 变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该位点上两条链一条突变， 一条未突变； (3)所欲检测CSN3_155位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度， 则 该位点上两条链均未突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两条链均突 变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该位点上两条链一条突变， 一条未突变； (4)所欲检测CS。
8、N3_168位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度， 则 该位点上两条链均突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两条链均未突 变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该位点上两条链一条突变， 一条未突变。 4.如权利要求1所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 所述步 骤S3中， PCR扩增的步骤包括： 权利要求书 1/3 页 2 CN 109321639 A 2 步骤S31： 在温度为90-95摄氏度时热激活14-16分钟， 90-95摄氏度时变性18-22秒， 65- 50摄氏度时退火和延伸55-65秒， 进行10。
9、个循环； 步骤S32： 在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒， 60-50摄氏度时退火和延伸55-65秒， 进行24-28个循环； 步骤S33： 在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒， 60-50摄氏度时退火和延伸55-65秒， 进行3个循环。 5.如权利要求4所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 所述步 骤S3中， PCR扩增的步骤包括： 步骤S31： 在温度为94摄氏度时热激活15分钟， 94摄氏度时变性20秒， 61-55摄氏度时退 火和延伸60秒， 进行10个循环； 步骤S32： 在温度为94摄氏度时变性20秒， 55摄氏度时退火和延伸60秒， 。
10、进行26个循环； 步骤S33： 在温度为94摄氏度时变性20秒， 57摄氏度时退火和延伸60秒， 进行3个循环。 6.如权利要求1所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 所述步 骤S1中， DNA样品的提取方法包括： 步骤S11： 对血液材料进行预处理； 步骤S12： 先后通过Porteinase K溶液以及缓冲液GB消化血液材料， 使溶液体系澄清； 步骤S13： 添加缓冲液BD， 充分混匀； 步骤S14： 将溶液置于吸附柱CG2中， 常温离心， 弃废液； 步骤S15： 加入缓冲液GDB， 常温离心， 弃废液； 步骤S16： 加入缓冲液PWB， 常温离心， 弃废液， 。
11、重复至少一次； 步骤S17： 将最终获得的吸附柱CG2置于收集管中， 常温离心， 弃废液； 步骤S18： 洗脱吸附柱CG2， 进行DNA定量； 步骤S19： 通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性。 7.如权利要求6所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 所述步 骤S11中， 对血液材料进行预处理的步骤包括： 向血液样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解 液CL， 使用匀浆仪进行处理， 之后离心， 弃上清液， 留下细胞核沉淀， 向细胞核沉淀中添加缓 冲液GS， 振荡至彻底混匀； 其中， 若血液材料中无血凝块， 则血液材料的体积与加入的缓冲液GS的体积比为5： 1， 若。
12、血液材料中有血凝块， 则血液材料的体积与加入的缓冲液GS的体积比为5： 2。 8.如权利要求6所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 所述步 骤S12中， 若血液材料无血块， 则Porteinase K溶液与血液材料的体积比为1： 50， 缓冲液GB 与血液材料的体积比为1： 5； 若血液材料有血块， 则Porteinase K溶液与血液材料的体积比 为1： 25， 缓冲液GB与血液材料的体积比为2： 5。 9.如权利要求6所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于， 所述步骤S13中， 所添加的缓冲液BD与步骤S12中所添加的缓冲液GB的体积比介。
13、于1： 1- 2： 1； 所述步骤S15中， 所添加的缓冲液GDB与步骤S12中所添加的缓冲液GB的体积比介于2： 1-3： 1； 所述步骤S16中， 所添加的缓冲液PWB与步骤S12中所添加的缓冲液GB的体积比介于2： 权利要求书 2/3 页 3 CN 109321639 A 3 1-4： 1； 并且， 所述步骤S14至步骤S16中， 离心的速度均介于10000-14000rpm， 离心时间均介于 20-40秒； 所述步骤S17中， 离心的速度介于10000-14000rpm， 离心时间介于1.5-2.5分。 10.如权利要求6所述的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 其特征在于，。
14、 所述 步骤S18中， 吸附柱CG2的洗脱方法包括： 步骤S18a： 向吸附柱CG2悬空滴加洗脱缓冲液TB， 洗脱缓冲液TB加入的体积， 与步骤S12 中所添加的缓冲液GB的体积比介于1： 4-1： 1； 步骤S18b： 室温放置两分钟， 常温离心， 弃废液， 离心速度介于10000-14000rpm， 离心时 间介于1.5-2.5分。 权利要求书 3/3 页 4 CN 109321639 A 4 基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域， 具体涉及一种基于KASP技术检测 - 酪蛋白基因型的方法。 背景技术 0002 -酪蛋白(k。
15、appa-casein， k-CN)是牛乳腺分泌的一种含有少量磷酸基的磷蛋白之 一。 -酪蛋白在牛乳中的含量约占总酪蛋白的12， 是凝乳酶的天然底物。 并且 -CN是最重 要的酪蛋白之一， 它不仅在酪蛋白微团的稳定性方面起至关重要的作用， 而且对奶牛泌乳 性能、 乳成分组成和奶酪品质均有一定程度的影响。 0003 编码 -酪蛋白的基因被命名为CSN基因， 目前研究发现， 牛中有多种类型的CSN基 因。 牛属动物的 -酪蛋白基因CSN3对蛋白质合成和酪蛋白微胶粒的稳定起重要作用， 在奶 酪制作中具有重要意义， 是凝乳酶的天然底物。 牛 -CN中有15种变异体， 均由核苷酸非同义 替换造成。 最常。
16、见的三个遗传变异体是A、 B和E， 它们在136、 148、 155、 168位氨基酸有差别， A 的四位点分别为Thr、 Asp、 Ser、 Ala， 而B为Ile、 Ala、 Ser、 Ala， E为Thr、 Asp、 Gly、 Ala。 相应的 核苷酸替换分别为ACCATC、 GATGCT、 AGCGGC、 GCAGCG。 0004 许多研究表明， -CN基因可能会影响乳牛的产奶量、 乳脂量、 乳蛋白量、 乳脂率(F) 和乳蛋白率(P)， 而且对牛乳的凝固特性和奶酪产量有显著影响。 研究表明， -CN对乳脂率 有显著影响。 含 -CNB变异体的牛奶具有较高的乳脂率、 较快的凝乳速度及较高。
17、的凝块硬 度。 -CN蛋白遗传多态性对经济性状如干酪制作特性等有着明显的影响。 尤其是乳的流变 学特性， -CNB等位基因对酪蛋白数目显示了正向影响。 酪蛋白含量是牛奶作为干酪生产的 原料的一个重要指标。 因此， 对 -CN基因进行筛选从而提高牛乳制品的质量很有必要。 0005 随着分子生物技术的发展， DNA分析给牛乳蛋白多态性研究带来了新的活力。 陆续 建立了DNA水平分析乳蛋白遗传变异体的方法， 主要方法有PCR-SSCP、 PCR-RFLP、 直接测序、 等位基因特异PCR和基因芯片等,由于前两种方法更易操作且对设备要求不高,应用更为普 遍， 后三种方法检测准确， 但成本较高， 不适宜。
18、大样本检测。 0006 目前国内尚未有将 -酪蛋白基因多态性与牛乳加工特性关联， 以便筛选出更适合 乳酪生产或蛋白产量更高的牛只的报导。 发明内容 0007 有解决现有技术存在的不足， 本发明提供了一种基于KASP技术检测 -酪蛋白基因 型的方法， 包括如下步骤： 0008 步骤S1： 制备DNA样品； 0009 步骤S2： 制备好PCR扩增体系， 其中， 该扩增体系内包括50体积分数的DNA样品、 1.2-1.6体积分数的混合引物， 以及余量的KASP混合液； 0010 步骤S3： 进行PCR扩增； 0011 其中， 步骤S2中添加的混合引物包括三种KASP引物， 分别为上游突变基因引物、 。
19、上 说明书 1/6 页 5 CN 109321639 A 5 游未突变基因引物以及下游引物， 并且， 上游突变基因引物及上游未突变基因引物中， 一条 设计有HEX荧光标签序列， 另一条设计有FAM荧光标签序列， 以通过根据PCR扩增后DNA样品 的荧光强度， 进行基因分型。 0012 其中， 所述步骤S2中， 所添加的混合引物包括四组， 其用于分别检测四处突变位点 的碱基类型， 并且， 针对不同的突变位点， 设计的引物如下： 0013 (1)所欲检测CSN3_136位点上的碱基类型时， 引物包括： 上游未突变基因引物 GAGCCTACAAGTACACCTACCAC、 上游突变基因引物GAGCC。
20、TACAAGTACACCTACCAT以及下游引物 GTAGCTACAGTGCTCTCTACTGCTT； 0014 (2)所欲检测CSN3_148位点上的碱基类型时， 引物包括： 上游未突变基因引物 AGAGCACTGTAGCTACTCTAGAAGA、 上游突变基因引物AGCACTGTAGCTACTCTAGAAGC以及下游引物 GTTGATCTCAGGTGGGCTCTCAATA； 0015 (3)所欲检测CSN3_155位点上的碱基类型时， 引物包括： 上游未突变基因引物 GTGTTGATCTCAGGTGGGCT、 上游突变基因引物GTGTTGATCTCAGGTGGGCC以及下游引物 GAGCA。
21、CTGTAGCTACTCTAGAAGCTT； 0016 (4)所欲检测CSN3_168位点上的碱基类型时， 引物包括： 上游突变基因引物 TGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC、 上游未突变基因引物CTTTGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACT以 及下游引物TGAGATCAACACAGTCCAAGTTACTTCAA。 0017 其中， (1)所欲检测CSN3_136位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧 光强度， 则该位点上两条链均未突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两 条链均突变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该。
22、位点上两条链一条突变， 一条未突 变； 0018 (2)所欲检测CSN3_148位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强 度， 则该位点上两条链均未突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两条链 均突变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该位点上两条链一条突变， 一条未突变； 0019 (3)所欲检测CSN3_155位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强 度， 则该位点上两条链均未突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两条链 均突变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该位点上两条链一条突变， 一条未。
23、突变； 0020 (4)所欲检测CSN3_168位点上的碱基类型时， 若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强 度， 则该位点上两条链均突变； 若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度， 则该位点上两条链均 未突变； 若扩增后DNA出现两种混合荧光强度， 则该位点上两条链一条突变， 一条未突变。 0021 其中， 所述步骤S3中， PCR扩增的步骤包括： 0022 步骤S31： 在温度为90-95摄氏度时热激活14-16分钟， 90-95摄氏度时变性18-22 秒， 65-50摄氏度时退火和延伸55-65秒， 进行10个循环； 0023 步骤S32： 在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒， 6。
24、0-50摄氏度时退火和延伸55-65 秒， 进行24-28个循环； 0024 步骤S33： 在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒， 60-50摄氏度时退火和延伸55-65 秒， 进行3个循环。 0025 其中， 所述步骤S3中， PCR扩增的步骤包括： 0026 步骤S31： 在温度为94摄氏度时热激活15分钟， 94摄氏度时变性20秒， 61-55摄氏度 说明书 2/6 页 6 CN 109321639 A 6 时退火和延伸60秒， 进行10个循环； 0027 步骤S32： 在温度为94摄氏度时变性20秒， 55摄氏度时退火和延伸60秒， 进行26个 循环； 0028 步骤S33： 在。
25、温度为94摄氏度时变性20秒， 57摄氏度时退火和延伸60秒， 进行3个循 环。 0029 其中， 所述步骤S1中， DNA样品的提取方法包括： 0030 步骤S11： 对血液材料进行预处理； 0031 步骤S12： 先后通过Porteinase K溶液以及缓冲液GB消化血液材料， 使溶液体系澄 清； 0032 步骤S13： 添加缓冲液BD， 充分混匀； 0033 步骤S14： 将溶液置于吸附柱CG2中， 常温离心， 弃废液； 0034 步骤S15： 加入缓冲液GDB， 常温离心， 弃废液； 0035 步骤S16： 加入缓冲液PWB， 常温离心， 弃废液， 重复至少一次； 0036 步骤S17。
26、： 将最终获得的吸附柱CG2置于收集管中， 常温离心， 弃废液； 0037 步骤S18： 洗脱吸附柱CG2， 进行DNA定量； 0038 步骤S19： 通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性。 0039 其中， 所述步骤S11中， 对血液材料进行预处理的步骤包括： 向血液样品中加入1- 2.5倍体积的细胞裂解液CL， 使用匀浆仪进行处理， 之后离心， 弃上清液， 留下细胞核沉淀， 向细胞核沉淀中添加缓冲液GS， 振荡至彻底混匀； 0040 其中， 若血液材料中无血凝块， 则血液材料的体积与加入的缓冲液GS的体积比为 5： 1， 若血液材料中有血凝块， 则血液材料的体积与加入的缓冲液GS的体积。
27、比为5： 2。 0041 其中， 所述步骤S12中， 若血液材料无血块， 则Porteinase K溶液与血液材料的体 积比为1： 50， 缓冲液GB与血液材料的体积比为1： 5； 若血液材料有血块， 则Porteinase K溶 液与血液材料的体积比为1： 25， 缓冲液GB与血液材料的体积比为2： 5。 0042 其中， 所述步骤S13中， 所添加的缓冲液BD与步骤S12中所添加的缓冲液GB的体积 比介于1： 1-2： 1； 0043 所述步骤S15中， 所添加的缓冲液GDB与步骤S12中所添加的缓冲液GB的体积比介 于2： 1-3： 1； 0044 所述步骤S16中， 所添加的缓冲液PW。
28、B与步骤S12中所添加的缓冲液GB的体积比介 于2： 1-4： 1； 0045 并且， 所述步骤S14至步骤S16中， 离心的速度均介于10000-14000rpm， 离心时间均 介于20-40秒； 0046 所述步骤S17中， 离心的速度介于10000-14000rpm， 离心时间介于1.5-2.5分。 0047 其中， 所述步骤S18中， 吸附柱CG2的洗脱方法包括： 0048 步骤S18a： 向吸附柱CG2悬空滴加洗脱缓冲液TB， 洗脱缓冲液TB加入的体积， 与步 骤S12中所添加的缓冲液GB的体积比介于1： 4-1： 1； 0049 步骤S18b： 室温放置两分钟， 常温离心， 弃废液。
29、， 离心速度介于10000-14000rpm， 离 心时间介于1.5-2.5分。 0050 本发明提供的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 实现了对奶牛中CSN3 说明书 3/6 页 7 CN 109321639 A 7 ( -CN基因)三种常见变异体的全面筛选， 可充分利用基因检测等领域的资源与技术优势培 育优质种牛， 发掘奶牛特色种质资源， 为牧场选择合适的奶牛， 提高乳蛋白率， 从种源解决 相关领域的技术瓶颈， 对奶牛良种产业健康发展具有重要意义。 附图说明 0051 图1： 本发明的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法一个分型结果图。 具体实施方式 0052 为了对本发。
30、明的技术方案及有益效果有更进一步的了解， 下面结合附图详细说明 本发明的技术方案及其产生的有益效果。 0053 本发明旨在通过基因分型对CSN3( -CN基因)中的三中常见变异体进行全面筛选， 从而为科学选种选配提供参考资料。 0054 一、 DNA样品的制备 0055 本发明中， 采用奶牛的血液作为提取、 制备DNA样品的材料。 0056 1、 血液材料预处理： 0057 (1)若血液无血凝块， 则采取1000ul血液进行实验， 需用细胞裂解液CL处理， 具体 步骤： 样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL， 颠倒混匀， 10,000rpm(11,500g)离心1min， 吸去上清， 留。
31、下细胞核沉淀(如果裂解不彻底， 可重复以上步骤一次)， 向离心收集到的细胞 核沉淀中加200ul缓冲液GS,振荡至彻底混匀。 0058 (2)若血液有血凝块， 则采取500ul血凝块进行实验， 需用细胞裂解液CL处理， 具体 步骤： 样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL， 使用匀浆仪进行处理， 处理完毕后进行离 心10,000rpm(11,500g)、 1min， 吸去上清， 留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底， 可重复以上步 骤一次)， 向离心收集到的细胞核沉淀中加200ul缓冲液GS， 振荡至彻底混匀。 0059 如果血液为冻存状态， 需在37水浴中解冻， 严禁室温解冻。 0060 如果。
32、为新鲜血液且已分层， 需将采血管轻柔颠倒混匀， 然后进行取血步骤。 0061 因此， 相对于通常的试剂盒， 本发明按照需求将血液(无血凝块)的添加量， 由 200ul提升至1000ul(血液无凝块)， 或500ul(血液有血凝块)进行前处理， 使最终提取的基 因组DNA浓度在100ng/ul以上， 增加了检测精度。 0062 2、 向预处理完的血液样品中， 加入20ul Porteinase K， 充分混匀。 0063 3、 加入200ul缓冲液GB， 充分颠倒混匀， 56水浴10min， 其间颠倒混匀数次， 使溶 液充分消化变清亮。 0064 若溶液未彻底变清亮， 需要延长裂解时间至溶液清亮。
33、为止。 0065 4、 室温放置2-5min后加入350ul缓冲液BD， 充分颠倒混匀。 此步可能出现絮状沉 淀， 但无需吹散。 0066 5、 将上步所得溶液和絮状沉淀加入吸附柱CG2中(吸附柱放入收集管中)， 常温离 心， 12,000rpm(13,400g)， 30sec， 弃废液。 0067 6、 加入500ul缓冲液GDB， 常温离心， 12,000rpm(13,400g)， 30sec， 弃废液。 0068 7、 加入600ul漂洗液PWB， 常温离心， 12,000rpm(13,400g)， 30sec， 弃废液。 0069 8、 加入600ul漂洗液PWB， 常温离心， 12,。
34、000rpm(13,400g)， 30sec， 弃废液。 说明书 4/6 页 8 CN 109321639 A 8 0070 9、 将CG2吸附柱放回收集管中， 常温离心， 12,000rpm(13,400g)， 2min， 弃废液。 0071 10、 打开吸附柱CG2管盖， 室温放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。 0072 11、 将吸附柱CG2放入一干净的1.5ml EP管中， 向吸附膜中央悬空滴加50-200ul洗 脱缓冲液TB， 室温放置2min， 室温离心， 12,000rpm(13,400g)， 2min。 0073 为增加基因组DNA的得率， 可将得到的溶液重新加入。
35、吸附柱CG2中， 室温放置2min， 常温离心， 12,000rpm(13,400g)， 2min。 0074 12、 进行gDNA定量， 如果不马上定量， 将样品冻存。 0075 13、 琼脂糖凝胶电泳检测gDNA完整性。 0076 二、 引物的设计 0077 本发明的 -酪蛋白基因型分型方法， 专注于检测其中的A、 B及E三种基因型， 三种 基因型涉及到六种不同的奶牛基因， 并且， 涉及到CSN3上的四处突变点。 0078 表1为本发明针对不同位置的突变点设计的四组引物序列， 以及各引物扩增带所 对应的碱基类型， 表2为本发明中， 六种不同的奶牛基因， 在四个不同的突变位点上对应的 碱基类。
36、型。 0079 表1： 本发明针对不同突变点设计的引物 0080 0081 0082 表2： 本发明所测定的不同突变位点上对应的碱基类型 0083 基因型CSN3_136CSN3_148CSN3_155CSN3_168 AACAAA ABCTACAGA 说明书 5/6 页 9 CN 109321639 A 9 AECAAGA BBTCAG BECTACAGGA EECAGA 0084 三、 PCR扩增 0085 本发明中， 用于扩增的PCR体系为5 L， 包括2.5 L DNA、 2.5l KASP Master Mix (LGC Genomics， Hoddeston， UK， KASP混合。
37、液)、 0.07 L混合引物。 为避免对试验结果的误判， 设置空白对照， 其DNA模板用ddH2O(双蒸水)代替。 PCR扩增的条件在温度为94时热激活 15min,94时变性20s、 61-55时退火和延伸60s、 进行10个循环； 94时变性20s、 55时 退火和延伸60s、 进行26个循环； 94时变性20s、 57时退火和延伸60s、 进行3个循环。 0086 四、 分型结果 0087 如上文所述， 本发明的表1中， 每组PCR扩增引物包括三种扩增带： 上游突变基因引 物、 上游未突变基因引物以及下游引物， 并且， 上游突变基因引物及上游未突变基因引物 中， 一条设计有HEX荧光标签。
38、序列， 另一条设计有FAM荧光标签序列； PCR扩增后， 不同的DNA 样品会呈现不同的荧光强度。 以CSN3_136突变点为例， 请结合图1所示， 假设某奶牛在此处 未突变(此时奶牛的基因型可能为AA、 AE或EE)， 则该位置处的碱基型为C， DNA扩增后仅会出 现上游未突变基因引物对应的扩增带， 也即， 最终扩增的DNA呈现FAM对应荧光强度， 即图1 右下角的颜色(红色)； 假设某奶牛在此处有一条链突变(此时奶牛的基因型可能为AB或 BE)， 则该位置处一条链的碱基型为C， 另一条为T， DNA扩增后会同时出现上游突变基因引物 及上游未突变基因引物对应的扩增带， 也即， 最终扩增的DN。
39、A呈现HEX对应荧光强度及FAM对 应荧光强度的混合色， 即图1中间的荧光色； 假设某奶牛在此处两条链均突变(此时奶牛的 基因型为BB)， 则该位置处碱基型为T， DNA扩增后仅会出现上游突变基因引物对应的扩增 带， 也即， 最终扩增的DNA呈现HEX对应荧光强度的颜色， 即图1左上角的颜色(深蓝色)。 0088 再结合其它突变点的扩增结果， 即可综合判断奶牛的基因型。 0089 本发明中， 所谓的 “Proteinase K溶液” ， 是指蛋白酶K溶液； 所谓的细胞裂解液CL、 缓冲液GDB、 缓冲液GB、 缓冲液GS、 缓冲液PWB、 缓冲液BD、 吸附柱CG2以及洗脱液TB， 均选自天 。
40、根试剂盒自带试剂。 0090 本发明提供的基于KASP技术检测 -酪蛋白基因型的方法， 实现了对奶牛中CSN3 ( -CN基因)三种常见变异体的全面筛选， 可充分利用基因检测等领域的资源与技术优势培 育优质种牛， 发掘奶牛特色种质资源， 为牧场选择合适的奶牛， 提高乳蛋白率， 从种源解决 相关领域的技术瓶颈， 对奶牛良种产业健康发展具有重要意义。 0091 虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明， 然其并非用以限定本发明的保护范 围， 任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内， 相对上述实施例进行各种变 动与修改仍属本发明所保护的范围， 因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。 说明书 6/6 页 10 CN 109321639 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 109321639 A 11 。