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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610134610.X (22)申请日 2016.03.09 (71)申请人 成都康景生物科技有限公司 地址 611130 四川省成都市温江区永宁镇 芙蓉大道二段33号 (72)发明人 申重阳陈洁王仲陈勇军 (74)专利代理机构 成都正华专利代理事务所 (普通合伙) 51229 代理人 李蕊 (51)Int.Cl. C12N 5/073(2010.01) (54)发明名称 一种维持人羊膜上皮干细胞多能性的培养 液 (57)摘要 本发明公开了一种维持人羊膜上皮干细胞 多能性的。
2、培养液， 包括： 基础培养液； 血清替代品 15%25%； 非必需氨基酸0.1%2%； 必需氨基酸 1mmol/L5mmol/L； 二硫苏糖醇0.01mmol/L 1mmol/L； 生长因子30ng/ml120ng/ml； 体系稳定 因子0.1%2%。 本发明的培养液可以模拟干细胞 在体内的生存环境， 进而使得干细胞在体外培养 时可以维持干细胞多能性， 经过较多次数的传代 培养后， 依然可以获得具有高多能性的干细胞。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 105734011 A 2016.07.06 CN 105734011 A 1.一种维持人羊膜上皮干细胞多能性的培养液， 包括： 基础。
3、培养液； 血清替代品15%25%； 非必需氨基酸0.1%2%； 必需氨基酸1mmol/L5mmol/L； 二硫苏糖醇0.01mmol/L1mmol/L； 生长因子30ng/ml120ng/ml； 体系稳定因子0.1%2%。 2.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于， 包括： 基础培养液； 血清替代品20%； 非必需氨基酸1%； 必需氨基酸2mmol/L； 二硫苏糖醇0.05mmol/L； 生长因子48ng/ml； 体系稳定因子1%。 3.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于： 所述必需氨基酸为L-谷氨酰胺。 4.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于： 所述生长因子包含： 碱性成纤维细胞生。
4、长因子4ng/ml10ng/ml； 表皮细胞生长因子10ng/ml20ng/ml； 肝细胞生长因子20ng/ml40ng/ml； 角化细胞生长因子-210ng/ml20ng/ml。 5.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于： 所述生长因子包含： 碱性成纤维细胞生长因子8ng/ml； 表皮细胞生长因子10ng/ml； 肝细胞生长因子20ng/ml； 角化细胞生长因子-210ng/ml。 6.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于： 所述体系稳定因子中包含： -氨基乙磺酸1份10份； 精氨酸1份10份； 转化生长因子- 1份10份； 类胰岛素一号增长因子1份10份； 粒细胞集落刺激因子1份10份。
5、。 7.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于： 所述基础培养液为DMEM/F12。 8.如权利要求1所述的培养液， 其特征在于： 所述培养液的pH值为7.27.4。 9.制备权利要求18中任一所述培养液的方法， 该方法的步骤为： 取基础培养液， 先在其中加入血清替代品和非必需氨基酸， 混合均匀并待溶液稳定后， 再依次加入必需氨基酸、 二硫苏糖醇、 生长因子和体系稳定因子混合均匀。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105734011 A 2 一种维持人羊膜上皮干细胞多能性的培养液 技术领域 0001 本发明涉及细胞培养技术领域， 具体涉及到一种维持人羊膜上皮干细胞多能性的 培养液。 背景技术。
6、 0002 羊膜位于胚胎绒毛膜内侧， 是一层无血管、 神经、 淋巴、 肌肉的透明薄膜， 与发育中 的胎儿联系紧密。 人羊膜来源的细胞主要由两类细胞构成： 人羊膜上皮细胞(humanamnion epithelialcells， hAECs)和人羊膜间充质细胞(humanamnionmesenchymecells， hAMCs)。 0003 人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcell， hAEC)具有表达多种胚胎干 细胞标记物的特点和较全面的多向分化潜能， Miki等研究证实了hAECs向三胚层分化的潜 能。 除表达胚胎干细胞表面抗原： SSEA-3和SSEA-4， 。
7、肿瘤抗性基因TRA1-60和TRA1-81之 外， 近来发现hAECs还表达多潜能干细胞的转录因子， 例如Oct-4、 Sox-2、 Nanog和REX-1等及 其他抗原， 例如ATP流出泵的ATP结合暗盒超级家族成员之一的ABCG2/BCRP、 CD9、 CD24、 上 皮钙黏蛋白、 整合素 6和 、 肝细胞生长因子结合受体(c-met)等。 不表达CD34(造血干细胞 及内表干细胞表面标记)、 SSEA-1、 CD133(造血干细胞、 内皮细胞及恶性胶质瘤细胞表面标 记)， 弱表达c-kit(CD117)和CC趋化因子受体(CRR4)。 0004 hAECs是一种可自我增殖和具有多项分化潜。
8、能的成体干细胞， 在不同生长因子的 调节下， 可分化为肝样细胞、 心肌样细胞、 神经胶质细胞、 神经元细胞和胰岛样细胞等， 并且 它可以分泌BDNF、 NGF等神经营养因子， 这些神经营养因子对神经元具有修复、 营养支持的 作用， 其次， hAECs免疫源性低， 细胞移植后不易引起排斥反应， 能减少炎症因子IFN和 TNF的释放， 通过抑制T淋巴细胞增殖， 减少促炎症细胞因子IL-1 和IL-1 的表达， 具有免疫 调节的作用。 再次， 从hAECs对中枢神经系统损伤模型的治疗中发现， hAECs能分化为神经元 细胞、 星形胶质细胞取代受损伤或死亡的细胞， 恢复受损伤区域的功能， 改善模型动物。
9、的行 为学和病理学改变。 hAECs不仅对神经修复有着重要的意义， 在肝脏等组织的修复中都起到 非常重要的作用， 并具有低免疫源性及免疫协同抑制作用， 同时可避免胎盘干细胞实验及 临床应用中的伦理问题， 在细胞替代治疗及组织再生医学上有广阔的应用前景。 0005 人羊膜上皮细胞源于胎盘羊膜组织， 虽然表达干细胞标志分子及相关基因， 但不 表达端粒酶基因， 在体外扩增受到了限制， 在体外只能培养4至5代， 培养十几天后细胞开始 萎缩， 细胞的多能性也受到极大的影响， 已报道相关培养体系， 都是对生长因子EGF的浓度 做出调整， 但是对hAECs多能性的维持也没有明显的改观， 细胞同样不能长时期维。
10、持培养。 虽然我们能够从人羊膜中获得较多的hAECs， 但是对于体外的研究以及移植治疗都会出现 较大限制， 因此一个稳定维持hAECs多能性培养体系具有重大的意义， 能够在长时间体外培 养中维持多能性的稳定， 同时也解决了急性治疗细胞需求量的问题。 发明内容 说明书 1/6 页 3 CN 105734011 A 3 0006 本发明的目的是提供一种干细胞培养液， 可以为人羊膜上皮干细胞提供模拟体内 的培养环境， 维持培养后的干细胞多能性。 0007 为达上述目的， 本发明的一个实施例中提供了一种维持人羊膜上皮干细胞多能性 的培养液， 包括： 0008 基础培养液； 0009 血清替代品1525。
11、； 0010 非必需氨基酸0.12； 0011 必需氨基酸1mmol/L5mmol/L； 0012 二硫苏糖醇0.01mmol/L1mmol/L； 0013 生长因子30ng/ml120ng/ml； 0014 体系稳定因子0.12。 0015 作为本发明的优化实施方案， 该培养液包含： 0016 基础培养液； 0017 血清替代品20； 0018 非必需氨基酸1； 0019 必需氨基酸2mmol/L； 0020 二硫苏糖醇0.05mmol/L； 0021 生长因子48ng/ml； 0022 体系稳定因子1。 0023 本发明的优化方案中， 必需氨基酸为L-谷氨酰胺。 0024 其中， 生长因子。
12、包含： 0025 碱性成纤维细胞生长因子4ng/ml10ng/ml； 0026 表皮细胞生长因子10ng/ml20ng/ml； 0027 肝细胞生长因子20ng/ml40ng/ml； 0028 角化细胞生长因子-210ng/ml20ng/ml。 0029 其中， 体系稳定因子中包含： 0030 -氨基乙磺酸1份10份； 0031 精氨酸1份10份； 0032 转化生长因子- 1份10份； 0033 类胰岛素一号增长因子1份10份； 0034 粒细胞集落刺激因子1份10份。 0035 其中， 基础培养液为DMEM/F12； 培养液的pH值为7.27.4。 0036 为此， 本发明还公开了该培养液。
13、的制备方法： 0037 取基础培养液， 先在其中加入血清替代品和非必需氨基酸， 混合均匀并待溶液稳 定后， 再依次加入必需氨基酸、 二硫苏糖醇、 生长因子和体系稳定因子混合均匀。 0038 综上所述， 本发明具有以下优点： 0039 本发明选择DMEM/F12为基础培养基， 其营养丰富， 适合多种干细胞培养的要求； 0040 本发明采用血清替代品代替血清， 例如美国Pall公司生产的产品。 血清替代了可 以降低细胞移植治疗中免疫排斥反应的风险； 说明书 2/6 页 4 CN 105734011 A 4 0041 本发明中非必需氨基酸NEAA是常见的非必需氨基酸培养试剂， 可以替代在生长过 程中。
14、被耗尽的成分， 补充非必需氨基酸能够刺激生长， 延长细胞的生存； 0042 本发明的L-谷氨酰胺是细胞生长的必需氨基酸， 为培养的细胞提供重要的能量来 源。 脱掉氨基后， L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、 参与蛋白质的合成和核酸代谢； 0043 本发明的二硫苏糖醇活性部分是硫氢基， 使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘 肽， 能诱导细胞的增殖， 同时避免过氧化物对培养细胞的损害； 0044 碱性成纤维细胞生长因子bFGF能有效维持人干细胞的未分化增殖， 促进干细胞的 自我更新； 表皮细胞生长因子EGF能够有效促进干细胞的增值并维持干细胞的分化潜能； 肝 细胞生长因子HGF能够促进细胞DNA的。
15、合成， 细胞分裂以及细胞运动； 角化细胞生长因子- 2KGF-2能够促进细胞增殖以及细胞激活。 0045 体系稳定因子包括 -氨基乙磺酸、 精氨酸、 转化生长因子- TGF- 、 类胰岛素一号 增长因子IGF-1、 粒细胞集落刺激因子G-CSF， 可以完善体外培养体系模拟体内环境， 促进干 细胞增殖。 0046 本发明的培养体系配制时必需严格按照顺序加入， 先加入血清替代品和非必需氨 基酸， 待混合溶液稳定(依照培养基颜色变化指示)， 再依次加入必需氨基酸、 二硫苏糖醇， 最后加入生长因子与体系稳定因子。 0047 因此， 本发明的培养液可以模拟干细胞在体内的生存环境， 进而使得干细胞在体 外。
16、培养时可以维持干细胞多能性， 经过较多次数的传代培养后， 依然可以获得具有高多能 性的干细胞。 附图说明 0048 图1为干细胞进行传代培养至第5代、 第15代、 第20代时细胞生长状态。 0049 图2为第5代细胞进行细胞多能性流式分析的结果； 0050 图3为第15代细胞进行细胞多能性流式分析的结果； 0051 图4为第20代细胞进行细胞多能性流式分析的结果。 具体实施方式 0052 实施例1 0053 取基础培养液DMEM/F12， 先在其中加入血清替代品和非必需氨基酸， 混合均匀并 待溶液稳定后再依次加入必需氨基酸L-谷氨酰胺、 二硫苏糖醇、 生长因子和体系稳定因子 混合均匀； 以体积。
17、分数和物质摩尔体积比表示， 配置的培养液中各种成分的含量为： 0054 血清替代品15； pH值7.4 0055 非必需氨基酸试剂1； 0056 必需氨基酸2mmol/L； 0057 二硫苏糖醇0.05mmol/L； 0058 碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml； 0059 表皮细胞生长因子15ng/ml； 0060 肝细胞生长因子30ng/ml； 0061 角化细胞生长因子-210ng/ml； 说明书 3/6 页 5 CN 105734011 A 5 0062 体系稳定因子1。 0063 其中， 该体系稳定因子的各组分配比为： 0064 -氨基乙磺酸10； 0065 精氨酸20； 0066 。
18、转化生长因子- 15； 0067 类胰岛素一号增长因子25； 0068 粒细胞集落刺激因子30。 0069 实施例2 0070 取基础培养液DMEM/F12， 先在其中加入血清替代品和非必需氨基酸， 混合均匀并 待溶液稳定后再依次加入必需氨基酸L-谷氨酰胺、 二硫苏糖醇、 生长因子和体系稳定因子 混合均匀； 以体积分数和物质摩尔体积比表示， 配置的培养液中各种成分的含量为： 0071 血清替代品20 0072 非必需氨基酸试剂0.8； 0073 必需氨基酸3mmol/L； 0074 二硫苏糖醇0.08mmol/L； 0075 碱性成纤维细胞生长因子8ng/ml； 0076 表皮细胞生长因子18。
19、ng/ml； 0077 肝细胞生长因子30ng/ml； 0078 角化细胞生长因子-215ng/ml； 0079 体系稳定因子1.2。 0080 其中， 该体系稳定因子的各组分配比为： 0081 -氨基乙磺酸15； 0082 精氨酸25； 0083 转化生长因子- 20； 0084 类胰岛素一号增长因子20； 0085 粒细胞集落刺激因子20。 0086 实施例3 0087 取基础培养液DMEM/F12， 先在其中加入血清替代品和非必需氨基酸， 混合均匀并 待溶液稳定后再依次加入必需氨基酸L-谷氨酰胺、 二硫苏糖醇、 生长因子和体系稳定因子 混合均匀； 以体积分数和物质摩尔体积比表示， 配置的。
20、培养液中各种成分的含量为： 0088 血清替代品20 0089 非必需氨基酸试剂1； 0090 必需氨基酸L-谷氨酰胺2mmol/L； 0091 二硫苏糖醇0.05mmol/L； 0092 碱性成纤维细胞生长因子8ng/ml； 0093 表皮细胞生长因子10ng/ml； 0094 肝细胞生长因子20ng/ml； 0095 角化细胞生长因子-210ng/ml； 0096 体系稳定因子1.2。 说明书 4/6 页 6 CN 105734011 A 6 0097 其中， 该体系稳定因子的各组分配比为： 0098 -氨基乙磺酸10； 0099 精氨酸20； 0100 转化生长因子- 15； 0101 。
21、类胰岛素一号增长因子25； 0102 粒细胞集落刺激因子30。 0103 实施例4 0104 1LhAECs培养液的配制 0105 770mLDMEM/F12(Gibco11330)培养基中加入血清替代品200mL、 L-glutamine (Gibco25030)10mL、 0.05mol/L二硫苏糖醇(SigmaD9779)1uL、 缓慢加入NEAA(Gibco 11140)10mL， 待培养基稳定(培养基颜色稳定)则加入bFGF(Gibco13256-029)2.5mL、 100ug/mL的HGF(BioVision4510-10)200uL、 100ug/mL的KGF-II(BioVi。
22、sion4060-25) 100uL、 0.1mg/mL的EGF(BioVision4022-100)100uL、 体系稳定因子10mL， 充分混匀， 4保 存。 0106 实施例5 0107 取基础培养液DMEM/F12， 先在其中加入血清替代品和非必需氨基酸， 混合均匀并 待溶液稳定后再依次加入必需氨基酸L-谷氨酰胺、 二硫苏糖醇、 生长因子和体系稳定因子 混合均匀； 以体积分数和物质摩尔体积比表示， 配置的培养液中各种成分的含量为： 0108 血清替代品15； pH值7.4 0109 非必需氨基酸试剂1； 0110 必需氨基酸2mmol/L； 0111 二硫苏糖醇0.05mmol/L； 。
23、0112 碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml； 0113 表皮细胞生长因子15ng/ml； 0114 肝细胞生长因子30ng/ml； 0115 角化细胞生长因子-210ng/ml； 0116 体系稳定因子1。 0117 其中， 该体系稳定因子的各组分配比为： 0118 -氨基乙磺酸10； 0119 精氨酸20； 0120 转化生长因子- 15； 0121 类胰岛素一号增长因子25； 0122 粒细胞集落刺激因子2028。 0123 香兰素110， 优选2。 0124 试验例1： hAECs传代培养与细胞形态学检测 0125 原代hAECs采用实施例3中的培养液经24小时培养贴壁， 并快速增值，。
24、 细胞形态正 常， 当细胞汇合度达到90， 利用0.25的胰蛋白酶(sigma110M7362V)/0.02EDTA消化 液消化贴壁hAECs， 离心收集细胞， 按照1： 4传代培养， 可以连续传代培养p20， 细胞生长状态 正常， 不同代数的细胞生长状态如图1。 说明书 5/6 页 7 CN 105734011 A 7 0126 hAECs体外培养第5代， 细胞生长状态正常； 0127 hAECs体外培养第15代， 细胞生长状态正常； 0128 hAECs体外培养第20代， 细胞生长状态正常； 0129 试验例2： hAECs细胞多能性FACS分析 0130 使用AccutaseTM酶(eB。
25、ioscienceCat.No.00-4555)消化贴壁hAECs， 制备成单细 胞悬液， 1000rpm离心5min， 弃去上清， 加入适量的流式染色缓冲液重悬细胞， 调整细胞浓度 为2107/mL， 染色之前添加20uL人FCR结合抑制剂(eBioscienceCat.No.14-9161)孵育 20min， 添加100uL染色液(eBioscienceCat.No.00-6993)按照1： 400分别加入抗体SSEA-4 (SantaCurzsc-21704)、 Tra-1-60(SantaCurzsc-21705)、 SSEA-1(SantaCurzsc- 21702AF488)、 T。
26、ra-1-81(SantaCurzsc-21706)， 轻弹混匀。 向抗体SSEA-4管加入1mL Foxp3Fixation/permeabilization(eBioscienceCat.No.00-5521)工作液， 斡旋固定细 胞， 室温或四度避光孵育30-60min， 加入2mL1permeabilizationbuffer(eBioscience Cat .No .00-8333 )重悬细胞1000rpm室温离心5min ， 弃上清， 再次加入2mL1 permeabilizationbuffer重悬细胞1000rpm室温离心5min， 弃上清， 加入100ul1 permeabi。
27、lizationbuffer重悬细胞后加入二抗goatanti-mouseIgM(SantaCurzsc- 3767)， 室温避光孵育20min， 2mL1permeabilizationbuffer洗一次， 1000rpm室温离心 5min， 弃上清， 加入2mL流式染色液(eBioscienceCat.No.00-4222)， 上机检测； 向抗体Tra- 1-60、 SSEA-1、 Tra-1-81加入1mLFoxp3Fixation/permeabilization(eBioscience Cat.No.00-5521)工作液， 斡旋固定细胞， 室温或四度避光孵育30-60min， 加入。
28、2mL1 permeabilizationbuffer(eBioscienceCat.No.00-8333)重悬细胞1000rpm室温离心 5min， 弃上清， 再次加入2mL1permeabilizationbuffer重悬细胞1000rpm室温离心5min， 弃上清， 加入100ul1permeabilizationbuffer重悬细胞后分别向Tra-1-60、 SSEA-1、 Tra-1-81管中加入二抗goatanti-mouseIgM(SantaCurzsc-3768)， 室温避光孵育 20min， 2mL1permeabilizationbuffer洗一次， 1000rpm室温离心。
29、5min， 弃上清， 加入2mL 流式染色液， 上机检测。 从图2中细胞多能性流式分析得知， 在hAECs体外扩增至p20时， 仍能 够维持其多能性， 具有潜在的分化能力。 0131 培养结果分析为： 0132 在使用实施例3的方法和试剂进行试验时， hAECs体外培养第5-20代， 细胞多能性 标记表达正常， 具有稳定的分化潜能。 此外， 经过其他4个实施例的实施例15均具有较好 的试验效果， 其中以实施例5和实施例3较佳， 实施例5较实施例1效果好。 说明了本发明的培 养液适合于hAECs的连续传代培养， 能够很好维持其多能性以及潜在的分化能力， 克服了其 无端粒酶活性的缺点。 说明书 6/6 页 8 CN 105734011 A 8 图1 图2 图3 图4 说明书附图 1/1 页 9 CN 105734011 A 9 。