技术领域
本发明属于生物制药技术领域。更具体地，涉及一种抗犬细小病毒精制抗体及其制备方法。
背景技术
犬细小病毒病，又称犬细小病毒性肠炎，是由犬细小病毒（Canine parbovirus，CPV）引起的一种高度接触性传染病，主要引起犬急性出血性肠炎或新生犬急性心肌炎，发病犬的临床症状主要为体温升高、剧烈呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少。该病常年均发，特别以春季和秋季居多，不同种类、年龄的犬均可感染此病，其中以幼犬危害最大，感染率和死亡率最高，严重危害我国养犬业。目前，采用疫苗免疫注射方法以预防该病取得一定效果，但因母源抗体、毒株变异等原因，经常出现免疫失败而感染犬细小病毒。CPV只有一个抗原血清型CPV-2，但由于抗原漂移，VP2基因的改变导致氨基酸替换出现了不同的基因亚型，CPV-2a、CPV-2b以及2000年自意大利发现的CPV-2c的突变体，这些新亚型的出现有可能是导致免疫失败的原因之一。黄永亮（2012）在深圳（9株）和广州（10株）地区分到19株CPV，经分离鉴定仅1株为CPV-2b，2株New CPV-2b，其余均为New CPV-2a亚型。这表明在广州和深圳以New CPV-2a为优势流行毒株。治疗方面，尚无有效的防治犬细小病毒药物和防治方法，所以，犬细小病毒的治愈率低。抗犬细小病毒免疫球蛋白浓缩制剂是防治犬细小病毒病的特异性生物制品，是一种被动免疫制剂，同时还有紧急预防接种的作用，具有较高的推广应用价值。
免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称Ig)是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是桨细胞合成的一类具有抗体活性的球蛋白。免疫球蛋白普遍存在于哺乳动物的血液、组织液、淋巴液及外分泌液中。免疫球蛋白在动物体内具有重要的免疫和生理调节作用，是动物体内免疫系统最为关键的组成物质之一。它最主要的生物学特性就是与相应的抗原特异性结合，还有激活补体，促吞噬作用等功能。免疫球蛋白的使用，在免疫学理论中可称为被动免疫，当免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失败时，可利用免疫球蛋白注射替代主动免疫接种，发挥抗病作用。
因此，开发一种特异性针对犬细小病毒New CPV-2a和New CPV-2b两种亚型的高浓度、高活性和高效价的抗犬细小病毒免疫球蛋白制剂，是临床治疗和紧急预防犬细小病毒病的有效手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有犬细小病毒病防治药物的缺陷和不足，提供一种防治犬细小病毒病的药物——抗犬细小病毒免疫球蛋白制剂，即一种抗犬细小病毒精制抗体。
本发明的目的是提供一种抗犬细小病毒精制抗体。
本发明另一目的是提供所述抗犬细小病毒精制抗体的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种抗犬细小病毒精制抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备犬细小病毒灭活疫苗；
S2.疫苗免疫健康犬只制备犬细小病毒高免血清；
S3.饱和硫酸铵分步盐析分离S2制备的血清中的抗犬细小病毒免疫球蛋白；
S4.纯化：葡聚糖凝胶对步骤S3所提取的抗犬细小病毒免疫球蛋白进行脱盐；
S5.将步骤S4脱盐处理后的抗犬细小病毒免疫球蛋白超滤浓缩、过滤除菌、分装，即得。
其中，优选地，步骤S1的方法为：以广东地区分离鉴定的犬细小病毒CPV-S5 (New CPV-2a)和CPV-1401 (New CPV-2b)为基础毒株，分别在F81细胞上扩大培养、小型切向流超滤浓缩后与水溶性佐剂MONTANIDE GEL按9：1的比例混合制备灭活疫苗。
优选地，步骤S2的方法为：选取5周龄CPV HI阴性的健康犬只，同时背部皮下多点接种犬细小病毒CPV-S5和CPV-1401两种灭活疫苗，25～30d （优选28d）后按照同样方法加强免疫；免疫后7～14d，颈动脉无菌采集CPV HI抗体效价不低于1：3072的犬血，静置、离心分离得到血清。
优选地，犬细小病毒CPV-S5和CPV-1401两种灭活疫苗的免疫剂量为1mL/只。
优选地，步骤S3饱和硫酸铵分步盐析的步骤如下：
（a）将血清用磷酸缓冲液（PBS）稀释，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和硫酸铵（AS）溶液至终浓度为15～25%，搅拌10～30min，0～10℃静置0.5～2h后，5000～8000r/min离心20～40min，弃沉淀；
（b）向步骤（a）得到的上清溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和硫酸铵溶液至终浓度40～60%，0～4℃静置0.5～2h后，5000～8000r/min离心2～40min，弃上清，收集沉淀；
（c）向步骤（b）所得沉淀中加入原血清两倍体积的PBS溶解，磁力搅拌器下缓慢滴加预冷饱和AS溶液至终浓度25%～35%，0～4℃静置0.5～2h，5000～8000r/min离心20～40 min，弃上清，收集沉淀；
（d）重复步骤（c）两次。
步骤S3饱和硫酸铵分步盐析的步骤最优选如下：
（a）将血清用磷酸缓冲液（PBS，pH = 7.0）作2倍稀释，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和硫酸铵（AS）溶液（pH = 7.0）至终浓度为20%，搅拌20min，4℃静置1 h后，6500 r/min离心30min，弃沉淀；
（b）向步骤（a）得到的上清溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和硫酸铵（AS）溶液（pH=7.0）至终浓度50%，4℃静置1 h后，6500 r/min离心30min，弃上清，收集沉淀；
（c）向步骤（b）所得沉淀中加入原血清两倍体积的PBS溶解，磁力搅拌器下缓慢滴加饱和AS溶液至终浓度33%，4℃静置1 h，6500 r/min离心30 min，弃上清，收集沉淀；
（d）重复步骤（c）两次。
优选地，步骤S4所述纯化的方法为采用Sephadex™ G-25 预装凝胶柱，利用葡聚糖凝胶对步骤S3所提取的抗犬细小病毒免疫球蛋白进行脱盐纯化。具体步骤如下：
（1）将预装柱与蛋白纯化系统连接，过程中防止空气进入柱体；
（2）平衡柱子：用5倍柱体积的PBS对柱子平衡，以完全除去保存柱子的乙醇，同时使得柱子完全填充PBS，流速控制在5 mL/min；
（3）上样与洗脱：样品体积最大1.5 mL,流速1mL/min，上样完成后继续充入PBS洗脱；
（4）收集：以紫外吸收值、电阻率为参考，用1.5 mL ep管收集峰处洗脱液，-20℃保存备用；
（5）洗涤柱子：用5倍柱体积的PBS洗涤，再用5倍柱体积的20%乙醇洗涤，以保存柱子。
优选地，步骤S5所述超滤浓缩为使用小型切向流超滤浓缩，即得HI效价为1：10240的精制抗体。
为了能够获得蛋白含量更高、抗体活性更好以及内毒素含量更低的免疫球蛋白，本发明对传统的饱和硫酸铵分离和提取血清中的免疫球蛋白的方法进行了优化。结果表明，采用优化后的饱和硫酸铵所制备的抗犬细小病毒精制抗体的免疫球蛋白浓度为134 mg/mL；CPV HI效价的测定结果表明，采用优化后的饱和硫酸铵盐析法所制备的抗犬细小病毒精制抗体效价达1:10240。
最优选地，本发明所述犬细小病毒(CPV) 精制抗体的制备方法为：将以广东地区分离鉴定的犬细小病毒CPV-S5 (New CPV-2a)和CPV-1401 (New CPV-2b)为基础毒株制备的两种灭活疫苗，按照1mL/只皮下注射CPV阴性犬只，28 d后加强免疫。二免后7 d HI抗体达到最高值。二免10 d，颈动脉无菌取血，混合后获得HI效价不低于1：3072的高免血清。采用20%～50%饱和硫酸铵分步盐析对高免血清进行粗提纯除去大部分杂蛋白，对盐析沉淀的硫酸铵浓度、pH进行优化，确定饱和硫酸铵浓度33%、pH=7.0为最优条件。按此方法大量提取纯化后，经HiTrap™ Desalting 5mL预装柱脱盐，再通过小型切向流超滤浓缩系统制得抗犬细小病毒精制抗体，HI效价高达1：10240。
综上，采用优化后的饱和硫酸铵盐析法所制备的抗犬细小病毒精制抗体的浓度、纯度相对较高；犬细小病毒血凝抑制效价明显提高。
另外，根据上述方法制备得到的抗犬细小病毒精制抗体及其应用也在本发明的保护范围之内。
所述抗犬细小病毒精制抗体包括抗犬细小病毒免疫球蛋白；其中，所述抗犬细小病毒免疫球蛋白的含量＞130 mg/mL，CPV HI抗体效价达1：10240以上。
本发明制备的抗犬细小病毒精制抗体为pH7.0左右的液体或冻干剂型；其中，抗犬细小病毒精制抗体主要以IgG单体存在。本发明抗犬细小病毒精制抗体保存期长，2～8℃可保存2年以上。
本发明抗犬细小病毒精制抗体中还可以加入适宜的保护剂，例如麦芽糖、葡萄糖等。本领域技术人员可以根据实际需要对保护剂的用量进行调整。
另外，本发明所述抗犬细小病毒抗体可以应用于预防和治疗犬细小病毒病，还能够应用于预防或治疗犬细小病毒病毒性肠炎，可增加患病犬机体免疫力和抵抗力。
因此，本发明制备的抗犬细小病毒精制抗体在作为或制备犬细小病毒病的预防和/或治疗药物方面的应用，或在作为或制备预防和/或治疗犬细小病毒病毒性肠炎的药物或试剂方面的应用，或在作为或制备可增加患病犬（所述患病犬是指患犬细小病毒病的犬）机体免疫力和抵抗力的药物中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
本发明所述抗犬细小病毒精制抗体的使用方法：一般采用皮下或肌肉注射；主要用于各品种犬的细小病毒感染的治疗与紧急预防，有效增加患病犬机体免疫力和抗病力。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备的抗抗犬细小病毒精制抗体蛋白含量达到134mg/ml，血凝抑制效价不低于1：10240；可应用于各品种犬接触感染细小病毒时的治疗与紧急预防，增加患病犬机体免疫力和抵抗力。
而且，安全性实验检验结果表明，该抗体制剂接种犬只（如对犬只肌肉或者皮下注射）后，犬只精神、体温、食欲正常，注射部位没有肿块，均无不良反应，无临床副作用，安全性好，具有很好的推广应用前景。
本发明优化后的抗抗犬细小病毒精制抗体的制备方法，既保持了免疫球蛋白分子结构的完整性和生物活性，同时制备过程中所用试剂廉价、操作简单，提高了蛋白质纯度、免疫球蛋白含量和生物安全性。
附图说明
图1为不同AS浓度提取蛋白SDS-PAGE分析；M.标准蛋白。
图2为抗犬细小病毒精制抗体与原血清SDS-PAGE分析；1. 高免血清 2. 抗犬细小病毒精制抗体，M.蛋白marker。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明所涉及到的术语定义：
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“红血球凝集试验（HA）和红血球凝集抑制试验（HI）”，犬细小病毒在4℃有特异性凝集猪红细胞的作用，称为红血球凝集试验。血凝现象能被相应抗体抑制称为红血球凝集抑制试验，以能抑制100%红细胞凝集的最高血清稀释度为该血清的HI效价。
实施例1 抗犬细小病毒精制抗体的制备
1.试验方法
1.1 抗犬细小病毒高免血清的制备
按照常规灭活疫苗制备方法制备CPV-S5 (New CPV-2a)和CPV-1401 (New CPV-2b)两毒株灭活疫苗。选取一定数量的CPV HI效价阴性的健康幼犬，背部皮下多点接种CPV-S5和CPV-1401两种灭活疫苗，待HI效价降到1:80以下（4周左右）进行加强免疫。
二免接种完成后10 ~ 14 d，以血凝抑制试验（HI）测定抗体效价，选取抗体效价不低于1：2048的犬只，颈动脉无菌采血，混合后，低温保存。
1.2 饱和硫酸铵（AS）分步盐析
（1）将上述制备的血清融化，加入等倍体积的磷酸缓冲液（PBS，pH = 7.0），磁力搅拌下缓慢滴加饱和硫酸铵（AS，pH = 7.0）溶液至终浓度为20%，搅拌20 min，4℃冰箱静置1 h，取出后6500 r/min离心30 min，收获上清液。
（2）磁力搅拌下向步骤（1）收获的上清液中缓慢滴加饱和AS溶液至终浓度50%，搅拌20 min，4℃静置1 h，取出后6500 r/min离心30 min，弃上清，收集沉淀。
（3）用原血清两倍体积的PBS溶解步骤（2）得到的沉淀，磁力搅拌下缓慢滴加饱和AS溶液至不同的终浓度（25%～35%），搅拌20 min，4℃冰箱静置1 h，取出后6500 r/min离心30 min，弃上清，收集沉淀。
（4）重复步骤（3）两次。
1.3 HiTrap™ Desalting 5 mL预装柱脱盐
（1）将预装柱与蛋白纯化系统连接，过程中防止空气进入柱体。
（2）平衡柱子：用5倍柱体积的PBS对柱子平衡，以完全除去保存柱子的乙醇，同时使得柱子完全填充PBS，流速控制在5 mL/min。
（3）上样与洗脱：样品体积最大1.5 mL,流速1 mL/min，上样完成后继续充入PBS洗脱。
（4）收集：以紫外吸收值、电阻率为参考，用1.5 mL ep管收集峰处洗脱液，-20℃保存备用。
（5）洗涤柱子：用5倍柱体积的PBS洗涤，再用5倍柱体积的20%乙醇洗涤，以保存柱子。
1.4 超滤浓缩免疫球蛋白
（1）将超滤膜（Pellicon XL Cassette，Biomax 50kDa）按说明书与小型切向流超滤机器连接好。
（2）往样品槽中加入500 mL三蒸水，对小型切向流超滤系统进行清洗，循环20 min。
（3）将蒸馏水排出，加入500 mL 0.1M NaOH 溶液对小型切向流超滤系统进行消毒，循环20 min。
（4）排出NaOH 溶液，重复步骤（2）。
（5）排出蒸馏水，加入200 mL的PBS润洗10 min，之后排出。
（6）上样：加入待浓缩样品（已经直径为0.45μm的滤膜过滤），调节压力阀，防止压力过大造成膜损坏。整个过程保持低温，防止病毒失活。
（7）达到浓缩体积，将样品导出，无菌离心管分装，-80℃保存备用。
（8）重复步骤（3）→（2）→（3），膜充满新鲜0.1M NaOH 溶液后，拆下，4℃保存。
1.5 抗犬细小病毒精制抗体蛋白浓度及纯度检测
采用BCA方法检测蛋白浓度、经SDS-PAGE蛋白电泳对蛋白纯度进行分析。
2. 实验结果
图1为不同AS浓度提取蛋白SDS-PAGE分析结果。图2为抗犬细小病毒精制抗体与原血清SDS-PAGE对比分析结果。
本发明所制备的抗犬细小病毒精制抗体的蛋白浓度为134 mg/mL，血凝抑制效价（HI）为：12800。
实施例2 抗犬细小病毒病毒精制抗体安全性检测
1. 实验方法
分别按每千克体重1.0，2.0，4.0 mL剂量，皮下、肌肉注射5月龄比格犬，连续观察48 h，继续饲养观察3个月，记录试验犬注射部位有无肿胀、是否过敏、精神及饮食状况。
2. 实验结果
按不同剂量注射抗抗犬细小病毒精制抗体的比格犬只，连续观察48 h，注射部位未见肿胀和过敏等异常现象，体温及精神饮食状况均正常。继续饲养3个月，期间也没有任何异常，表明抗抗犬细小病毒精制抗体无副作用，适合临床推广。