一种山羊关节炎脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710667109.4 (22)申请日 2017.08.07 (71)申请人 新疆畜牧科学院 地址 830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 市经济技术开发区阿里山街468号 (72)发明人 吴建勇王登峰李建军 古努尔吐尔逊刘志强杨学云 金映红刘艳丰班万里王文奇 马晓菁叶锋刘丽娅蒋晓梅 (74)专利代理机构 乌鲁木齐博亚思知识产权代 理事务所(普通合伙) 65110 代理人 王志刚 (51)Int.Cl. C07K 14/155(2006.01) C12N 15/49(200。

2、6.01) C12N 15/81(2006.01) G01N 33/569(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标 记蛋白gp135及其制备方法 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种山 羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白 gp135， 包含经优化后的gpP135蛋白的核苷酸序 列， 如SEQIDNO.1所示， 一致性不小于95%的其 它序列； 以及包含经优化后的gp135蛋白的氨基 酸序列， 如SEQIDNO.2所示， 一致性不小于95% 的其它序列。 经毕赤酵母GS115表达的gp135诊断 标记蛋。

3、白反应原性好、 便于工业化生产， 为开发 CAEV高通量血清学诊断方法提供抗原。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图5页 CN 107488219 A 2017.12.19 CN 107488219 A 1.一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135， 其特征在于： 包含经优化 后的gpP135蛋白的核苷酸序列， 如SEQ ID NO.1所示， 一致性不小于95%的其它序列； 以及包 含经优化后的gp135蛋白的氨基酸序列， 如SEQ ID NO.2所示， 一致性不小于95%的其它序 列。 2.如权利要求1所述的一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白GP135， 其。

4、特 征在于： 优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列， 如SEQ ID NO.1所示， 优化后的gpP135蛋白的 氨基酸序列， 如SEQ ID NO.2所示。 3.一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135的制备方法， 包括下述步 骤：（1） gp135基因的密码子优化及合成 用毕赤酵母GS115表达蛋白中的密码子对CAEV gp135蛋白的编码基因进行优化及合 成， 获得pUC57-gp135质粒； （2） 重组载体的构建 将上述pUC57-gp135质粒经Not 和EcoR 双酶切后与pPIC9K连接， 构建重组表达质粒 pPIC9K-gp135； （3） 毕赤酵母 GS115。

5、阳性重组子的筛选 通过电激转化将线性化的重组表达质粒pPIC9K-gp135导入毕赤酵母GS115中； （4） gp135/GS115工程菌的诱导表达， 获得gp135蛋白。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107488219 A 2 一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135及其 制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标 记蛋白gp135及其制备方法。 背景技术 0002 山羊关节炎-脑炎 （caprine arthritis-encephalitis， CAE） 是由山羊关节炎-脑 炎病毒 （caprine art。

6、hritis-encephalitis virus， CAEV） 引起的山羊的一种慢性病毒性传 染病。 该病的主要特征是： 成年山羊呈缓慢发展的关节炎， 间或伴有间质性肺炎和间质性乳 房炎； 2-6月龄羔羊表现为上行性麻痹的神经症状。 本病感染率高， 潜伏期长， 感染山羊终生 带毒， 且没有特异的治疗方法， 对畜群的生产性能特别是奶产量有重要影响， 同时也妨碍了 种用动物的正常贸易， 被我国列为二类动物疫病， 在国际贸易中， 相关动物及产品入境时必 须检疫。 0003 山羊关节炎-脑炎病毒自1982年被Crowford等人发现以来， 已经遍布世界许多国 家， 其中， 美国、 挪威、 英国、 日。

7、本、 墨西哥、 巴西等国家尤为严重， 血清学调查显示其阳性率 超过了30%。 我国在1987年从英国进口的萨能奶山羊中分离了山羊关节炎一脑炎病毒并命 名为CAEV89-GB1026。 目前， 主要分布于甘肃、 陕西、 贵州、 山东、 黑龙江、 辽宁、 四川等地区。 已经分离鉴定出5个不同的山羊关节炎-脑炎病毒株， 分别为甘肃、 陕西、 四川、 贵州和山东 毒株， 这些毒株的gag-pol基因序列相似在99.2%99.9%之间， 基因型为B1型， 与瑞士、 斯诺 文尼亚等欧洲国家流行株基因型相同。 0004 山羊关节炎-脑炎呈地方流行性， 发病山羊和隐性带毒者为传染源。 可以感染任何 年龄、 性。

8、别的山羊。 CAEV感染对宿主具有特异性， 山羊是本病的主要易感动物， 其中奶山羊 最易感， 多呈慢性持续感染， 潜伏期长， 待该病发现时， 整个羊群可能已经全部被感染。 有国 外引种历史的羊群和地区， CAEV感染的风险越高。 主要传播途径为羔羊通过吸吮含病毒的 初乳和常乳而进行传播， 也可以通过易感羊与感染的成年羊长期密切接触而传播。 0005 琼脂糖凝胶扩散试验 （AGID） 是用于检测血清中CAEV抗体的最常用的方法， 也是国 际兽医组织 （OIE） 推荐的检测方法。 AGID的常用抗原是全病毒抗原， 而衣壳蛋白P28和囊膜 蛋白gp135也可以用做AGID的抗原， 为血清学诊断标记蛋。

9、白。 同时， 由于ELISA更敏感、 更经 济， 且能够用于大规模的血清学筛查， 在2004年被OIE定为CAEV检测的标准方法。 目前， 常用 于ELISA抗原包括全病毒抗原和重组抗原， 重组抗原中gp135蛋白为重要的血清学诊断标记 蛋白。 0006 目前gp135蛋白的重组表达方法主要以大肠杆菌表达为代表的原核表达， CAEV病 毒感染哺乳动物上皮细胞， 利用宿主的蛋白质表达系统进行翻译、 表达， 而原核细胞的蛋白 表达系统与真核细胞差异较大， 由于密码子的偏好差异和蛋白结构形成环境的差异使表达 得到的蛋白在氨基酸序列、 二级和三级结构上存在较大差异； 此外， 大肠杆菌表达已形成包 涵体。

10、， 不利于工业化生产。 说明书 1/5 页 3 CN 107488219 A 3 发明内容 0007 发明目的： 本申请以GeneBank中公开的CAEV 病毒遗传物质DNA序列为基础， 根据 毕赤酵母GS115表达蛋白中密码子的偏好、 优化表达蛋白的稳定性、 形成分泌表达等方面对 gp135蛋白的编码基因进行优化并合成， 将合成的基因克隆入pPIC9K质粒构建重组质粒， 并 将线性化的重组质粒电激转化入毕赤酵母GS115中， 筛选表达gp135蛋白的单克隆菌落， 经 诱导表达确定为分泌表达， 且与CAEV感染靶标动物刺激产生的抗体产生抗原-抗体反应。 0008 本发明技术方案如下： 一种山羊。

11、关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135， 包含经优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列， 如SEQ ID NO.1所示， 一致性不小于95%的其它 序列； 以及包含经优化后的gp135蛋白的氨基酸序列， 如SEQ ID NO.2所示， 一致性不小于 95%的其它序列。 0009 进一步， 仅为优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列， 如SEQ ID NO.1所示， 优化后的 gpP135蛋白的氨基酸序列， 如SEQ ID NO.2所示。 0010 一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135的制备方法， 包括下述步 骤： （1） gp135基因的密码子优化及合成 用毕赤酵母GS1。

12、15表达蛋白中的密码子对CAEV gp135蛋白的编码基因进行优化及合 成， 获得pUC57-gp135质粒； （2） 重组载体的构建 将上述pUC57-gp135质粒经Not 和EcoR 双酶切后与pPIC9K连接， 构建重组表达质粒 pPIC9K-gp135； （3） 毕赤酵母 GS115阳性重组子的筛选 通过电激转化将线性化的重组表达质粒pPIC9K-gp135导入毕赤酵母GS115中； （4） gp135/GS115工程菌的诱导表达， 获得gp135蛋白。 0011 有益效果： 用该方法制备的CAEV血清学诊断标记蛋白gp135反应原性好、 便于工业 化生产， 为开发CAEV高通量血清。

13、学诊断方法提供抗原。 附图说明 0012 附图1为CAEV GP135基因序列的同源性和遗传偏离分析； 附图2为优化后的GP135 基因序列 （5 -3 ） 及蛋白质氨基酸序列 （C-N） ； 附图3为pPIC9K-GP135重组质粒的双酶切鉴 定结果， 其中1： pPIC9K-gp135 Not 和EcoR 双酶切结果； 2： pPIC9K Not 和EcoR 双酶切结 果； 3： 空白对照； 4： marker D （生工） ； 附图4为线性化pPIC9K-GP135转化GS115结果； 附图5为 GP135/GS115菌株PCR鉴定结果， 其中， M： marker D （生工） ； 2。

14、、 5、 9-17， 20-23： PCR阳性结果， 24： 阴性对照； 其它为阴性结果； 附图6； 附图7为GP135蛋白表达与定量； 其中， 1-2： GP135/ GS115工程菌诱导培养上清 （20倍浓缩） ； M蛋白分子量marker （低） （TAKARA） ； 附图8为WB方法 诊断CAEV感染羊结果； 其中， M： 预染蛋白Marker； 1： 阴性血清样本； 2、 3： CAEV感染山羊阳性 血清样本； 附图9为AGID方法诊断CAEV感染羊结果； 其中， 左、 右两幅图中： 左-1、 右-3为CAEV 感染山羊阳性血清样本； 左-3和左-4、 右-1和右-2为CAEV阴性血。

15、清样本； 左-2、 右-4为空白 对照。 说明书 2/5 页 4 CN 107488219 A 4 具体实施方式 0013 实施例1、 CAEV gp135基因的优化与合成 （1） CAEV gp135基因的同源性分析 对GeneBank中公开的属于我国分离的三株山羊关节炎-脑炎病毒 （CAEV） （GeneBank： KT749879.1, KT749880.1， KT749881.1） 编码gp135蛋白的基因进行同源性分析。 经序列比 对分析表明， 三株CAEV编码的gp135基因序列差异较小， 同源性在99.2%以上， 与国际上公开 的基因序列的同源性大于78%， 见图1。 0014 。

16、（2） CAEV gp135基因的密码子优化 根据毕赤酵母GS115表达蛋白中密码子的偏好、 诱导表达蛋白的稳定性、 糖基化、 形成 分泌表达等方面对gp135蛋白的编码基因进行优化， 委托上海生物工程技术有限公司合成 部进行全基因合成， 最终获得了pUC57-gp135质粒， 优化后的编码gp135蛋白基因的序列 （5 -3 ） 及表达蛋白的氨基酸序列 （C-N） ， 见图2。 0015 2. 重组载体的构建 将pUC57-gp135质粒经Not 和EcoR双酶切后与pPIC9K连接， 构建了重组表达质粒 pPIC9K-gp135， 经双酶切验证， 出现预期条带， 见图3。 0016 3. 。

17、GS115阳性重组子的筛选 通过DTT-LiAc法制备毕赤酵母GS115电转化感受态、 大量提取试剂盒提取毫克级质粒， 通过Sac I酶切线性化后进行胶回收。 通过电激转化 （Biorad真菌转化默认参数） 成功将线 性化的重组质粒导入毕赤酵母GS115中， 涂布MD平板， 出现预期单一菌落， 见图4。 0017 毕赤酵母阳性重组子的筛选通过G418多拷贝重组子的筛选， 选择分别耐受1mg/ mL、 2mg/mL、 3mg/mL G418的单菌落进行PCR鉴定， 出现预期的目的条带， 表明目的基因实现 了与酵母的同源重组， 见图5。 0018 4. gp135/GS115重组蛋白反应原性鉴定 。

18、gp135/GS115工程菌进行甲醇诱导表达 （1%甲醇） ， 使用Western Blotting进行反应原 性鉴定分析， 一抗为自然感染CAEV山羊产生的阳性血清， 二抗为HRP标记的兔抗山羊IgG， 结 果显示gp135重组表达蛋白与CAEV利用宿主蛋白合成系统合成的蛋白有一致的反应原性， 见图6。 0019 5. gp135/GS115工程菌的诱导表达 使用TAKARA的蛋白定量Marker进行SDS-PAGE分析， 利用BandScan5.0软件对目的条带 的灰度值进行计算， 结果Gp135蛋白的表达量为69.3mg/L， 包括两条带： 未进行糖基化的 64KDa条带为22.5mg/。

19、L， 经糖基化修饰的80KD条带为46.9mg/L， 见图7。 0020 实际应用举例 具体实例1. 使用免疫印迹方法诊断CAEV感染羊 山羊关节炎-脑炎病毒 （CAEV） 感染山羊后， 刺激产生抗体， 将gp135/GS115 工程菌诱导 表达、 纯化的gp135 重组蛋白作为抗原， 使用免疫印迹方法 （Western Blotting） 检测被检 山羊血清抗体， 可以用于CAE的血清学诊断。 0021 1. 材料方法 1.1 材料 说明书 3/5 页 5 CN 107488219 A 5 血清： CAEV感染山羊血清样本3份， 其中阳性样本2份， 阴性1份； 抗原： gp135/GS115。

20、 工程菌诱导表达的gp135蛋白； 二抗： HRP标记的兔抗山羊IgG （天根生物技术有限公司） 。 0022 1.2 试验方法 根据科学出版社的第三版 分子克隆-实验指南 中 “附录8 分子克隆中的常用技术-免 疫印迹” （p 1723-1726） 进行： （1） gp135重组蛋白进行SDS-PAGE电泳， 上样量10 L （gp135蛋白100ng） ， 电压150 V， 电 泳40 min； （2） 将聚丙烯酰胺凝胶转移至滤膜上； （3） 封闭， 被检血清 （50倍稀释） 孵育60 min， 清洗； （4） 二抗孵育 （1000倍稀释） ， 清洗； （5） 显色 2. 结果 一抗为自然。

21、感染CAEV山羊产生的阳性血清， 二抗为HRP标记的兔抗山羊IgG， 结果显示 gp135重组表达蛋白与CAEV利用宿主蛋白合成系统合成的蛋白有一致的反应原性， 见图8WB 方法诊断CAEV感染羊结果； M： 预染蛋白Marker； 1： 阴性血清样本； 2、 3： CAEV感染山羊阳性血 清样本 。 0023 实例2. 琼脂糖凝胶扩散方法诊断CAEV感染羊 山羊关节炎-脑炎病毒 （CAEV） 感染山羊后， 刺激产生抗体， 将gp135/GS115 工程菌诱导 表达、 纯化的gp135 重组蛋白作为抗原， 使用琼脂糖凝胶扩散方法 （AGID） 检测被检山羊血 清抗体， 可以用于CAE的血清学诊。

22、断。 0024 1.1 材料 血清： CAEV感染山羊血清样本10份， 其中阳性样本3份， 阴性6份； 抗原： gp135/GS115 工程菌诱导表达、 纯化的80 KD的gp135 蛋白； 1.2 试验方法 参考 SNT 1171.2-2003 山羊关节炎-脑炎抗体检测方法-琼脂免疫扩散试验 进行， gp135/GS115 工程菌诱导表达、 纯化重组gp135 蛋白2 g/孔。 0025 2. 结果 AGID结果显示:gp135重组表达蛋白与CAEV感染山羊阳性血清产生免疫沉淀线， 与阴性 血清无反应线， 见图9AGID方法诊断CAEV感染羊结果； 左、 右两幅图中： 左-1、 右-3为CA。

23、EV感 染山羊阳性血清样本； 左-3和左-4、 右-1和右-2为CAEV阴性血清样本； 左-2、 右-4为空白对 照。 0026 实例3. 间接ELISA方法诊断CAEV感染羊 山羊关节炎-脑炎病毒 （CAEV） 感染山羊后， 刺激产生抗体， 将gp135/GS115 工程菌诱导 表达、 纯化的80 KD的gp135 重组蛋白作为抗原， 使用间接ELISA方法检测被检山羊血清抗 体， 可以用于CAE的血清学诊断。 0027 1.1 材料 血清： IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒 （产品编号: CVT1135T） 筛查， 山羊阳性血清 样本30份， 阴性60份； 说明书 4/5 页 。

24、6 CN 107488219 A 6 抗原： gp135/GS115 工程菌诱导表达、 纯化的组80KD 的gp135 重组蛋白； 1.2 试验方法 建立了以gp135/GS115 工程菌诱导表达、 纯化gp135 重组蛋白为抗原的CAEV血清学检 测间接ELISA方法， 阴性对照和阳性对照使用IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒配备的标 准物。 0028 1） gp135/GS115 工程菌诱导表达、 纯化的重组gp135 蛋白 （60 ng/mL） ， 100 L/ 孔， 4 过夜； 2） 5%脱脂乳 （PBS-T） 封闭液孵育30 min， 200 L/孔， 清洗； 3） 100。

25、 L/孔加入被测血清 （500倍稀释） ， 孵育1 h， 清板； 4） 100 L/孔加入3000倍稀释的HRP标记兔抗山羊二抗孵育1 h， 清洗； 5） 100 L/孔加入OPD， 显色10 min； 6） 50 L/孔加入H2SO4终止液终止反应； 7） 待检血清孔OD值与阴性对照比值2.1者判为阳性。 0029 2. 结果 经IDEXX CAEV/MVV总抗体筛查试剂盒 （产品编号: CVT1135T） 筛查后， 经建立的IELISA 方法检测， 30份山羊阳性血清样本中27份为阳性， 3份为阴性； 60份阴性样本全部为阴性。 与 IDEXX MVV/CAEV gp135抗体筛查试剂盒相。

26、比： 符合率为96.7%， 特异性为100%， 敏感性为 90.0%。 说明书 5/5 页 7 CN 107488219 A 7 SEQUENCE LISTING 新疆畜牧科学院 一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135及其制备方法 2 PatentIn version 3.5 1 1674 DNA 人工序列 1 gaattcatgt gtgttagagc agaagactat attaccttga tttcagatcc ttatggattc 60 tctcctatta agaacgtttc cggagtccca gtaacttgcg tcactaaaga atttgctcgt 。

27、120 tggggatgtc aacccctagg tgcttaccca gacccagaga tcgaatatcg taacgtctct 180 caagagattg ttaaagaggt ttatcaggaa aattggccct ggaataccta ccattggccc 240 ctgtggcaga tggaaaatgt tcgttactgg ttaaaagaaa atattgctga gaacaaaaag 300 cgtaagaata gtactaagga aggtattgag gagttactgg ccggaacaat cagaggtagg 360 ttttgtgttc catac。

28、ccatt tgctttactt aaatgtacaa agtggtgttg gtaccctgca 420 gaaattgacc aggaaaccgg aagagctagg aagataaaga taaactgtac ggaggccaga 480 gccgtgtctt gtactgaaga aatgcctcta gcttctattc atagagctta ttgggacgag 540 aaggacaggg aatcaatggc cttcatgaac attagagctt gtgactccaa cctgagatgc 600 cagaaaaggc ctggtgggtg tgttgaaggt tat。

29、cctatcc ctgtaggtgc caacattatt 660 ccagagaaca tgaagtactt gcgtggtcaa aagtctcaat atggaggtat aaaagataaa 720 aatggcgagt tgaagcttcc actaactatg agagtttggg tcaagttggc taacgtttcc 780 acctgggtaa acggtacccc accttactgg caaaaccgaa ttaatggttc taaaggtatt 840 aacggtacac tgtgggggca attgtctgga atgcatcacc ttggttttaa t。

30、ttaagtcag 900 aacggtaaat ggtgtaacta cactggcaaa ataaagatag gtcaagagac tttctcatac 960 cactacaagc ccaattggaa gtgcacaggg aactggacgc aatacccagt ttggcaagta 1020 atgcgagatc tggatatggt ggagcacatg actggtgaat gcgttcaaag accacagaga 1080 cacaacatta ctgtcgatag aaatcaaact atcacgggaa attgctctgt gacgaactgg 1140 gat。

31、ggatgta actgttcaag atctggtaat tacttgtata acagtactac cgggggtttg 1200 cttgtcatca tttgccgaaa taattctact ataacaggca ttatgggaac taatactaat 1260 tggaccacaa tgtggagaat ctatagaaat tgtagtggtt gcgagaacgc caccttggat 1320 aggaaggaaa caggcacttt aggaggcgtg gcaaataaaa attgttcatt gcctcataag 1380 aacgagagta acaaatgg。

32、ac atgcgcacca aggcaacgtg gaggaaaaac agattccttg 1440 tacattgctg gaggcaagag attttggaca agagaaaaag cacaatactc atgtgaaaac 1500 aatatcggag aattggatgg tatgctacac cagcaaatct tgcttcagaa gtaccaggtg 1560 attaaagttc gtgcctatac ttatggggtt atcgaaatgc cagagaatta tgcaaagacc 1620 cgtatcatca acagaaggaa aagagaattg tc。

33、ccatacca gaaagaaacg ataa 1674 序列表 1/3 页 8 CN 107488219 A 8 1 557 PRT 人工序列 1 Glu Phe Met Cys Val Arg Ala Glu Asp Tyr Ile Thr Leu Ile Ser Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Gly Phe Ser Pro Ile Lys Asn Val Ser Gly Val Pro Val Thr 20 25 30 Cys Val Thr Lys Glu Phe Ala Arg Trp Gly Cys Gln Pro Leu Gly Ala 35 40 45 Tyr 。

34、Pro Asp Pro Glu Ile Glu Tyr Arg Asn Val Ser Gln Glu Ile Val 50 55 60 Lys Glu Val Tyr Gln Glu Asn Trp Pro Trp Asn Thr Tyr His Trp Pro 65 70 75 80 Leu Trp Gln Met Glu Asn Val Arg Tyr Trp Leu Lys Glu Asn Ile Ala 85 90 95 Glu Asn Lys Lys Arg Lys Asn Ser Thr Lys Glu Gly Ile Glu Glu Leu 100 105 110 Leu Al。

35、a Gly Thr Ile Arg Gly Arg Phe Cys Val Pro Tyr Pro Phe Ala 115 120 125 Leu Leu Lys Cys Thr Lys Trp Cys Trp Tyr Pro Ala Glu Ile Asp Gln 130 135 140 Glu Thr Gly Arg Ala Arg Lys Ile Lys Ile Asn Cys Thr Glu Ala Arg 145 150 155 160 Ala Val Ser Cys Thr Glu Glu Met Pro Leu Ala Ser Ile His Arg Ala 165 170 17。

36、5 Tyr Trp Asp Glu Lys Asp Arg Glu Ser Met Ala Phe Met Asn Ile Arg 180 185 190 Ala Cys Asp Ser Asn Leu Arg Cys Gln Lys Arg Pro Gly Gly Cys Val 195 200 205 Glu Gly Tyr Pro Ile Pro Val Gly Ala Asn Ile Ile Pro Glu Asn Met 210 215 220 Lys Tyr Leu Arg Gly Gln Lys Ser Gln Tyr Gly Gly Ile Lys Asp Lys 225 23。

37、0 235 240 Asn Gly Glu Leu Lys Leu Pro Leu Thr Met Arg Val Trp Val Lys Leu 245 250 255 Ala Asn Val Ser Thr Trp Val Asn Gly Thr Pro Pro Tyr Trp Gln Asn 260 265 270 序列表 2/3 页 9 CN 107488219 A 9 Arg Ile Asn Gly Ser Lys Gly Ile Asn Gly Thr Leu Trp Gly Gln Leu 275 280 285 Ser Gly Met His His Leu Gly Phe A。

38、sn Leu Ser Gln Asn Gly Lys Trp 290 295 300 Cys Asn Tyr Thr Gly Lys Ile Lys Ile Gly Gln Glu Thr Phe Ser Tyr 305 310 315 320 His Tyr Lys Pro Asn Trp Lys Cys Thr Gly Asn Trp Thr Gln Tyr Pro 325 330 335 Val Trp Gln Val Met Arg Asp Leu Asp Met Val Glu His Met Thr Gly 340 345 350 Glu Cys Val Gln Arg Pro G。

39、ln Arg His Asn Ile Thr Val Asp Arg Asn 355 360 365 Gln Thr Ile Thr Gly Asn Cys Ser Val Thr Asn Trp Asp Gly Cys Asn 370 375 380 Cys Ser Arg Ser Gly Asn Tyr Leu Tyr Asn Ser Thr Thr Gly Gly Leu 385 390 395 400 Leu Val Ile Ile Cys Arg Asn Asn Ser Thr Ile Thr Gly Ile Met Gly 405 410 415 Thr Asn Thr Asn T。

40、rp Thr Thr Met Trp Arg Ile Tyr Arg Asn Cys Ser 420 425 430 Gly Cys Glu Asn Ala Thr Leu Asp Arg Lys Glu Thr Gly Thr Leu Gly 435 440 445 Gly Val Ala Asn Lys Asn Cys Ser Leu Pro His Lys Asn Glu Ser Asn 450 455 460 Lys Trp Thr Cys Ala Pro Arg Gln Arg Gly Gly Lys Thr Asp Ser Leu 465 470 475 480 Tyr Ile A。

41、la Gly Gly Lys Arg Phe Trp Thr Arg Glu Lys Ala Gln Tyr 485 490 495 Ser Cys Glu Asn Asn Ile Gly Glu Leu Asp Gly Met Leu His Gln Gln 500 505 510 Ile Leu Leu Gln Lys Tyr Gln Val Ile Lys Val Arg Ala Tyr Thr Tyr 515 520 525 Gly Val Ile Glu Met Pro Glu Asn Tyr Ala Lys Thr Arg Ile Ile Asn 530 535 540 Arg Arg Lys Arg Glu Leu Ser His Thr Arg Lys Lys Arg 545 550 555 序列表 3/3 页 10 CN 107488219 A 10 图1 说明书附图 1/5 页 11 CN 107488219 A 11 说明书附图 2/5 页 12 CN 107488219 A 12 图2 图3 说明书附图 3/5 页 13 CN 107488219 A 13 图4 图5 图6 说明书附图 4/5 页 14 CN 107488219 A 14 图7 图8 图9 说明书附图 5/5 页 15 CN 107488219 A 15 。