混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410706801.X (22)申请日 2014.12.01 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104371001 A (43)申请公布日 2015.02.25 (73)专利权人 济南大学 地址 250022 山东省济南市南辛庄西路336 号 (72)发明人 郑庚修陈环宇王秋芬王卫 乔宇马志佳刘悦 (51)Int.Cl. C07K 5/062(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/02(2006.01) (56)对比文件 CN 。

2、103694313 A,2014.04.02, CN 102993271 A,2013.03.27, CN 1532204 A,2004.09.29, CN 101429230 A,2009.05.13, 审查员 刘新蕾 (54)发明名称 混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺 (57)摘要 本发明公开了一种混合溶剂合成高纯度甘 谷二肽的制备工艺， 属于药物化学领域， 以N-氯 乙酰-L-谷氨酰胺为原料进行氨解反应， 其氨解 反应特征在于利用非质子化极性溶剂与氨水混 合溶剂条件下， 提高N-氯乙酰-L-谷氨酰胺氨解 的反应活性； 采用浓氨水和(NH4)2CO3在密闭条 件下进行氨解反应有效提高活性。

3、氨的浓度， 降低 了甘氨酰-L-谷氨酰胺水解而产生的甘氨酰-L- 谷氨酸副产物， 提高了氨解的选择性。 将反应液 浓缩， 采用水、 甲醇与酯的三溶剂混合体系结晶 得到98.5%以上高纯度的甘氨酰-L-谷氨酰胺粗 品， 粗品经水、 甲醇与酯的混合溶剂一次精制就 可以得到纯度99.8%甘谷二肽， 提高了收率， 简化 了操作， 适合工业化生产。 权利要求书1页 说明书5页 CN 104371001 B 2017.06.23 CN 104371001 B 1.一种混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺， 其特征包含以下步骤： 采用高含量N- 氯乙酰-L-谷氨酰胺在非质子化极性溶剂与氨水混合溶剂条件下与(N。

4、H4)2CO3进行氨解反 应， 向密闭反应釜中依次加入非质子化极性溶剂和氨水的混合溶剂、 碳酸铵和高含量N- 氯 乙酰-L- 谷氨酰胺， 升温进行反应； 反应结束后， 常温下减压回收过量的氨水， 升温减压蒸 分解过量的(NH4)2CO3， 将反应液浓缩后使用甲醇与酯的混合溶剂析晶， 过滤， 干燥得纯度高 的甘氨酰-L- 谷氨酰胺粗品； 将粗品悬浮于水中， 升温溶解、 活性炭吸附脱色， 热过滤后加 入甲醇与酯的混合溶剂， 析晶， 抽滤， 真空干燥得到高纯度的甘氨酰-L- 谷氨酰胺。 2.如权利要求1 所述的一种混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺， 其特征在于， 所 述氨解反应中， 在非质子化极性。

5、与氨水混合溶剂中， N- 氯乙酰-L- 谷氨酰胺与浓氨水和 (NH4)2CO3 投入密闭反应釜中进行反应， 其中非质子化极性溶剂， 是指二甲基亚砜 （DMSO） 、 二甲基甲酰胺 （DMF） 、 二甲基乙酰胺 （DMAC） 、 N- 甲基吡咯烷酮 （NMP） 。 3.如权利要求1 所述的一种混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺， 其特征在于， 所 述氨解反应中， 混合溶剂中非质子化极性溶剂与氨水体积比例=1 ： 3-20。 4.如权利要求1 所述的一种混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺， 其特征在于， 结 晶溶剂为甲醇与酯的混合溶剂， 酯是指乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 乙酸甲酯、 乙酸叔丁酯； 混合。

6、溶 剂中甲醇与酯比例=1-5 ： 1。 5.如权利要求1 一种混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺， 其特征在于所述的水、 甲醇与酯重结晶过程中， 水的加入体积与甘氨酰-L- 谷氨酰胺质量比=3-6:1， 水的体积以 毫升计， 甘氨酰-L- 谷氨酰胺质量以克计； 酯是指乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 乙酸甲酯、 乙酸叔丁 酯； 甲醇与酯的混合溶剂与水的体积比=1-2.5:1； 冷却析晶的温度为0-5。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104371001 B 2 混合溶剂中合成高纯度甘谷二肽的工艺 技术领域 0001 本发明属于药物化学领域， 涉及甘氨酰-L-谷氨酰胺的制备工艺， 更具体的涉及一 种在密。

7、闭体系中采用N-氯乙酰-L-谷氨酰胺在非质子化极性溶剂与氨水混合溶剂条件下和 碳酸铵进行氨解反应制备甘谷二肽的方法。 背景技术 0002 L-谷氨酰胺 （L-Gln） 是人体内最丰富的有理氨基酸， 对于危重和营养不良者是一 种条件必须氨基酸。 尽管L-谷氨酰胺生理功能和药理作用受到普遍重视， 但由于其在水溶 液中溶解度低增加了输液时患者的水负荷， 在高温灭菌和储存时生成毒副作用较大的焦谷 氨酸， 限制了其在临床上的广泛应用。 甘氨酰-L-谷氨酰胺 （简称甘谷二肽） 是一种人工合成 的二肽类氨基酸， 在体内可以被二肽酶水解成游离氨基酸供组织蛋白质的合成， 也可直接 被肝脏、 肾脏等组织器官利用。。

8、 甘氨酰-L-谷氨酰胺易溶于水， 在解热消毒和长时间储存过 程中性质稳定。 因此， 与同类产品比较， 甘氨酰-L-谷氨酰胺具有明显优势， 市场前景广阔。 0003 目前， 甘氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法主要有以下几种： 0004 1. 以氯乙酰氯与谷氨酰胺-甲酯为原料， 生成氯乙酰谷氨酸-甲酯， 然后再 氨解制得甘氨酰谷氨酰胺 （JP63051399， 1988） 。 该方法中谷氨酰胺-甲酯成本较高， 且中 间体氨解时副反应较多， 氨解不彻底， 后处理周期长。 0005 2. 用保护后的苄氧羰基甘氨酸为原料， 在二环己基碳二亚胺 （DCC） 作用下， 制得 羟基丁二亚胺 （HOSU） 活性酯，。

9、 然后与谷氨酰胺反应生成二肽， 最后在甲醇/水混合溶剂中用 Pd-C催化氢化得到甘氨酰-L-谷氨酰胺 （CN 1532204,2004） 。 该反应过程较复杂， DCC难以除 去， 产品难以提纯， 反应过程中要用到一些价格较高的原料， 如DCC、 钯炭、 四氢呋喃等使产 品成本增大， 并且加压氢化对生产设备要求比较苛刻。 0006 3. 甘氨酸和和L-谷氨酰胺为主要原料， 首先用邻苯二甲酸酐对甘氨酸进行保护， 在与氯化亚砜反应生成相应酰氯， 与L-谷氨酰胺缩合后再利用水合肼肼解得到产品 （化学 试剂， 2011,33,177） 。 该方法制得产品纯度虽然可以， 但中间缩合过程中需时刻检测pH，。

10、 不 利于生产控制； 而且处理的大量酸液对环境不友好。 0007 4. 混酐法师50年代初期发展起来的。 反应分两步进行， 首先是将酰基氨基酸在低 温和叔胺的存在下同氯甲酯反应生成混合酸酐， 接着所生成的混合酸酐再同氨基组份反应 得到肽。 其优点是方法简单， 反应速度快， 产物的分离和纯化较方便， 但存在易消旋化的缺 点， 因此对反应条件的选择和控制是必要的。 0008 5. 以氯乙酰氯为起始原料， 以L-谷氨酰胺酰胺化， 产物在氨水中氨解得到甘氨 酰-L-谷氨酰胺 （US 5780677， 1988） 。 此方法虽然步骤短， 操作简单， 但是在氨水中氨解， 活 性氨的浓度低， 反应慢， L-。

11、谷氨酰胺的酰胺键可能同时水解而引入甘氨酰-L-谷氨酸， 由 于甘氨酰-L-谷氨酸和甘氨酰-L-谷氨酰胺是结构很相似的二肽， 最终使产品难以纯化。 制 得粗品甘氨酰-L-谷氨酰胺纯度低， 不利于原料药的生产。 说明书 1/5 页 3 CN 104371001 B 3 发明内容 0009 本发明的目的是为克服上述现有技术的不足， 提供一种混合溶剂合成高纯度甘谷 二肽的制备工艺， 采用高含量N-氯乙酰-L-谷氨酰胺在非质子化极性溶剂与氨水混合溶剂 条件下与 (NH4)2CO3氨化剂在密闭条件下进行氨解反应。 反应结束后回收氨水， 分解(NH4) 2CO3， 将反应液浓缩， 用水、 甲醇与酯的混合溶剂。

12、结晶得到高纯度的甘氨酰-L-谷氨酰胺粗 品， 粗品经水、 甲醇与酯的混合溶剂一次精制就可以得到纯度99.8%以上的甘谷二肽。 0010 其氨解反应由于利用非质子化极性溶剂与氨水混合溶剂条件下， 提高N-氯乙酰- L-谷氨酰胺氨解的反应活性； 采用浓氨水和(NH4)2CO3在密闭条件下进行氨解反应有效提高 活性氨的浓度， 大大降低了甘氨酰-L-谷氨酰胺水解而产生的甘氨酰-L-谷氨酸副产物， 提 高氨解的选择性。 反应结束后， 常温下回收过量氨水， 加压蒸分解过量(NH4)2CO3， 将反应液 浓缩、 采用甲醇与酯的混合溶剂进行粗品甘氨酰-L-谷氨酰胺的结晶， 利用甲醇和酯对不同 杂质的溶解度不同。

13、， 减少产品结晶的包杂， 有效提高甘氨酰-L-谷氨酰胺粗品纯度到98.5% 以上。 粗品悬浮于水中， 升温溶解、 活性炭吸附脱色， 热过滤后加入甲醇与酯的混合溶剂， 冷 却析晶， 抽滤， 减压干燥得到纯度99.8%的甘氨酰-L-谷氨酰胺。 0011 为实现上述目的， 本发明采用下述技术方案： 0012 以N-氯乙酰-L-谷氨酰胺为原料制备甘谷二肽， 包括将非质子化极性溶剂和氨水 的混合溶剂投入到密闭反应釜中， 搅拌下依次投入 (NH4)2CO3和N-氯乙酰-L-谷氨酰胺， 密 闭加热使其完全反应， 反应结束后， 常温下减压回收过量的氨水， 在60， -0.08-0.10MPa 下减压蒸分解过量。

14、的(NH4)2CO3。 将反应液浓缩后使用甲醇与酯的混合溶剂析晶， 过滤， 干燥 得粗品甘氨酰-L-谷氨酰胺， 将粗品悬浮于水中， 升温溶解、 活性炭吸附脱色， 热过滤后加入 甲醇与酯的混合溶剂， 冷却析晶， 抽滤， 减压干燥得到纯度99.8%的甘氨酰-L-谷氨酰胺； 0013 所述氨解反应在密闭条件下进行， 密封体系反应压力为： 0.01-0.5MPa。 0014 所述所述氨解反应中， 溶剂为非质子化极性溶剂与氨水的混合溶剂， 其中非质子 化极性溶剂， 是指二甲基亚砜 （DMSO） 、 二甲基甲酰胺 （DMF） 、 二甲基乙酰胺 （DMAC） 、 N-甲基吡 咯烷酮 （NMP） ， 优选二甲。

15、基甲酰胺 （DMF） 。 混合溶剂中非质子化极性溶剂与氨水体积比例=1： 3-20， 优选1： 5。 。 0015 所述氨解反应中， 氨解试剂为浓氨水和(NH4)2CO3复合体系， 浓氨水的质量浓度为 25%34%， 优选28%氨水。 N-氯乙酰-L-谷氨酰胺和氨水及(NH4)2CO3的摩尔比为1:1322： 4 10， 优选1： 16.5： 5.5。 0016 所述氨解反应中， 反应温度为2060， 优选2540。 氨解反应时间4h12h。 0017 结晶溶剂为甲醇与酯的混合溶剂， 酯是指乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 乙酸甲酯、 乙酸叔 丁酯， 优选乙酸乙酯、 乙酸叔丁酯。 混合溶剂中甲醇与酯比例。

16、=15： 1， 优选3： 1。 0018 所述的精制过程包括如下步骤： 0019 （1） 溶解： 将甘氨酰-L-谷氨酰胺粗品悬浮于水中， 升温至50使其溶解。 水的加入 体积与甘氨酰-L-谷氨酰胺质量比=36:1， 优选4:1； 0020 （2） 吸附脱色： 加入活性炭进行吸附脱色， 然后过滤， 活性炭与甘氨酰-L-谷氨酰胺 的质量比为2%； 0021 （3） 析晶： 温度3040下向滤液中滴加甲醇与酯的混合溶剂， 晶体析出后降温 说明书 2/5 页 4 CN 104371001 B 4 至05继续析晶3h， 酯是指乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 乙酸甲酯、 乙酸叔丁酯， 优选乙酸乙酯、 乙酸叔丁酯。。

17、 混合溶剂中甲醇与酯比例=1： 15， 优选： 1： 3。 甲醇与酯的混合溶剂的体积与水 的体积比=12.5:1， 优选1.5:1。 0022 （4） 过滤干燥： 过滤后进行65真空干燥， 得到高纯度的甘氨酰-L-谷氨酰胺。 0023 通过上述步骤制备的甘氨酰-L-谷氨酰胺使用高效液相色谱检测纯度在99.8%以 上。 0024 本发明的有益效果是： 0025 1.本发明的氨解反应在非质子化极性溶剂中进行， 提高了N-氯乙酰-L-谷氨酰胺 的反应活性， 提高了反应速率， 减少了杂质产生。 0026 2.本发明使用浓氨水和(NH4)2CO3在密闭条件下反应， 减少了氨气的损失， 提高了 反应效率，。

18、 大大提高了活性氨的浓度， 有效抑制了酰胺键的水解， 使杂质甘氨酰-L-谷氨 酸的量减少。 0027 3.使用水-甲醇-酯体系析晶及精制， 利用甲醇和酯对不同杂质的溶解度不同， 减 少了产品结晶的包杂， 提高了产物纯度。 0028 4.反应温度降低， 减少了由于高温引入的杂质L-焦谷氨酸和环(甘氨酰-L-谷氨酰 胺)的量。 具体实施方式 0029 下面结合实施例对本发明进一步说明。 0030 实例1： 0031 将二甲基亚砜 （DMSO） 18ml和质量分数为25%的氨水40ml的混合溶剂投入到密闭反 应釜中， 搅拌下依次投入43g (NH4)2CO3和10g N-氯乙酰-L-谷氨酰胺， 密闭。

19、加热到50使其 完全反应， 4.5h后经HPLC检测反应完毕， 常温下减压回收过量的氨水， 在60， -0.08- 0.10MPa下减压蒸分解过量的(NH4)2CO3,将反应液浓缩至27g， 50下滴加20ml甲醇与20ml 乙酸丁酯的混合溶剂， 晶体析出后， 降温至03析晶3h， 过滤， 减压干燥得粗品甘氨酰-L- 谷氨酰胺7.78g， 纯度98.85%。 0032 实例2： 0033 将二甲基甲酰胺 （DMF） 10ml和质量分数为28%的氨水50ml的混合溶剂投入到密闭 反应釜中， 搅拌下依次投入23.5g (NH4)2CO3和10g N-氯乙酰-L-谷氨酰胺， 密闭加热到25 使其完全。

20、反应， 8h后经HPLC检测反应完毕， 常温下减压回收过量的氨水， 在60， -0.08- 0.10MPa下减压蒸分解过量的(NH4)2CO3,将反应液浓缩至27g， 50下滴加30ml甲醇与10ml 乙酸乙酯的混合溶剂， 晶体析出后， 降温至03析晶3h， 过滤， 减压干燥得粗品甘氨酰-L- 谷氨酰胺7.81g， 纯度98.92%。 0034 实例3： 0035 将N-甲基吡咯烷酮 （NMP） 7ml和质量分数为28%的氨水66ml的混合溶剂投入到密闭 反应釜中， 搅拌下依次投入17.5g (NH4)2CO3和10g N-氯乙酰-L-谷氨酰胺， 密闭加热到40 使其完全反应， 6h后经HPL。

21、C检测反应完毕， 常温下减压回收过量的氨水， 在60， -0.08- 0.10MPa下减压蒸分解过量的(NH4)2CO3,将反应液浓缩至27g， 50下滴加27ml甲醇与13ml 乙酸甲酯的混合溶剂， 晶体析出后， 降温至03析晶3h， 过滤， 减压干燥得粗品甘氨酰-L- 说明书 3/5 页 5 CN 104371001 B 5 谷氨酰胺7.80g， 纯度98.87%。 0036 实例4： 0037 将二甲基乙酰胺 （DMAC） 6ml和质量分数为34%的氨水33ml的混合溶剂投入到密闭 反应釜中， 搅拌下依次投入23.5g (NH4)2CO3和10g N-氯乙酰-L-谷氨酰胺， 密闭加热到6。

22、0 使其完全反应， 4h后经HPLC检测反应完毕， 常温下减压回收过量的氨水， 在60， -0.08- 0.10MPa下减压蒸分解过量的(NH4)2CO3， 将反应液浓缩至27g， 50下滴加32ml甲醇与8ml乙 酸叔丁酯的混合溶剂， 晶体析出后， 降温至03析晶3h， 过滤， 减压干燥得粗品甘氨酰-L- 谷氨酰胺7.81g， 纯度98.88%。 0038 实例5： 0039 将二甲基甲酰胺 （DMF） 2.5ml和质量分数为34%的氨水50ml的混合溶剂投入到密闭 反应釜中， 搅拌下依次投入43g (NH4)2CO3和10g N-氯乙酰-L-谷氨酰胺， 密闭加热到20使 其完全反应， 10。

23、h后经HPLC检测反应完毕， 常温下减压回收过量的氨水， 在60， -0.08- 0.10MPa下减压蒸分解过量的(NH4)2CO3， 将反应液浓缩至27g， 50下滴加33.3ml甲醇与 6.7ml乙酸叔丁酯的混合溶剂， 晶体析出后， 降温至03析晶3h， 过滤， 减压干燥得粗品甘 氨酰-L-谷氨酰胺7.80g， 纯度98.87%。 0040 实例6： 0041 将二甲基亚砜 （DMSO） 10ml和质量分数为25%的氨水40ml的混合溶剂投入到密闭反 应釜中， 搅拌下依次投入17.5g (NH4)2CO3和10g N-氯乙酰-L-谷氨酰胺， 密闭加热到30使 其完全反应， 7.5h后经HP。

24、LC检测反应完毕， 常温下减压回收过量的氨水， 在60， -0.08- 0.10MPa下减压蒸分解过量的(NH4)2CO3， 将反应液浓缩至27g， 50下滴加20ml甲醇与20ml 乙酸乙酯的混合溶剂， 晶体析出后， 降温至03析晶3h， 过滤， 减压干燥得粗品甘氨酰-L- 谷氨酰胺7.79g， 纯度98.91%。 0042 实例7： 0043 将10g甘氨酰-L-谷氨酰胺粗品加入250mL三口瓶中， 加入30mL纯化水， 搅拌， 升温 至50使其完全溶解， 加入0.2g活性炭， 搅拌3040min， 过滤， 将滤液保持30， 向其中滴加 50mL甲醇与25ml乙酸乙酯的混合溶剂， 析出晶体。

25、后， 降温至05， 继续析晶3h， 过滤、 65 真空干燥， 得纯品8.87g， 纯度99.85%。 0044 实例8： 0045 将10g甘氨酰-L-谷氨酰胺粗品加入250mL三口瓶中， 加入60mL纯化水， 搅拌， 升温 至50使其完全溶解， 加入0.2g活性炭， 搅拌3040min， 过滤， 将滤液保持40， 向其中滴加 45mL甲醇与15ml乙酸乙酯的混合溶剂， 析出晶体后， 降温至05， 继续析晶3h， 过滤、 65 真空干燥， 得纯品8.84g， 纯度99.88%。 0046 实例9： 0047 将10g甘氨酰-L-谷氨酰胺粗品加入250mL三口瓶中， 加入40mL纯化水， 搅拌，。

26、 升温 至50使其完全溶解， 加入0.2g活性炭， 搅拌3040min， 过滤， 将滤液保持40， 向其中滴加 45mL甲醇与15ml乙酸叔丁酯的混合溶剂， 析出晶体后， 降温至05， 继续析晶3h， 过滤、 65 真空干燥， 得纯品8.86g， 纯度99.87%。 0048 上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述， 但并非对本发明保护 范围的限制， 所属领域技术人员应该明白， 在本发明的技术方案的基础上， 本领域技术人员 说明书 4/5 页 6 CN 104371001 B 6 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。 说明书 5/5 页 7 CN 104371001 B 7 。