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发明领域
本发明涉及猴腺病毒和用于使猴腺病毒生长的方法，所述方法使得这些猴腺病毒能够用 于多种应用中，包括治疗和预防人类疾病。
发明背景
对于许多研究者和临床医生，重组真核病毒载体已经成为基因转移的优选手段。体内基 因转移是施用核酸(通常为DNA形式)以实现所转移基因在有益于接受者的位置表达蛋白质产 物的一项策略。该益处可以是诱导针对该基因产物的免疫应答，即为治疗性目的接种或修饰 靶细胞的遗传库(geneticrepertoire)。这可以使用编码所谓“转基因”的重组腺病毒载体高效地完 成。腺病毒载体具有优于通常用于基因转移(例如，逆转录病毒载体)的其他载体的优点，原 因在于腺病毒载体(i)可以以高滴度(即，多达1013个病毒颗粒/ml)产生；(ii)它们将基因高效转 移至不复制以及复制的细胞；(iii)几乎不重组；(iv)尽管人感染腺病毒常见，但没有人恶性肿 瘤与腺病毒感染的已知关联；(v)可操作腺病毒基因组以容纳尺寸不定的外源基因；(vi)腺病毒 载体不将其DNA插入细胞的染色体中，因此它的作用是非永久性的并且不可能干扰细胞的 正常功能；和(vii)具有复制能力作为基本特征的活腺病毒已经安全地用作人类疫苗(Straus,引 自Adenoviruses,PienanPress,NewYork,N.Y.,451-496(1984)；Horwitz等，引自Virology，第 2版,Fields等编著,RavenPress,NewYork,N.Y.,1679-1721(1990)；Berkner,BioTechniques,6: 616(1988)；Chanock等,IAMA,195:151(1966)；HajAhmad等,J.Virol,57:267(1986)；和Ballay 等,EMBOJ，4:3861(1985))。人腺病毒是当前病毒载体疫苗和基因治疗方案中使用最广泛的 重组病毒载体之一。
就一般结构而言，迄今检验过的全部腺病毒均是直径约65至80纳米的无包膜规则二十 面体。腺病毒由与核心蛋白复合并且由腺病毒衣壳包围的线性双链DNA组成。衣壳的蛋白 质是中和抗体的靶，并且不同的血清型在处于病毒颗粒外部上的衣壳蛋白中具有不同的氨基 酸序列。
腺病毒属于腺病毒科，该科分为5个属：哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、腺胸病毒 属(Atadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)和美洲白鲟腺 病毒属(Ichtadenovirus)。哺乳动物腺病毒属中的腺病毒仅感染哺乳动物并且包括人腺病毒、 黑猩猩腺病毒和猴腺病毒。
腺病毒提供了将转基因转移至细胞中的精巧和高效手段。然而，在腺病毒载体用于体内 基因转移时遭遇的一个问题是存在针对腺病毒的先存免疫力，其由接受者因自然暴露于腺病 毒而获得。主要地，腺病毒感染在一生中诱导针对腺病毒衣壳蛋白上抗原表位的抗体产生。 如果滴度足够，则该抗体能够限制腺病毒基因转移载体的效力。此外，腺病毒载体的施用可 能诱导免疫力；因此，可能使用腺病毒不超过一次作为有效基因转移运载体。例如，动物研 究显示，静脉内或局部施用(例如，至肺、心脏或腹膜)2型或5型腺病毒基因转移载体可导致 产生针对该载体的抗体，这防止来自1至2周稍后施用的相同血清型载体的表达(见，例如， Yei等,GeneTherapy,1:192-200(1994)；Zabner等,Nat.Gen.,6:75-83(1994)；Setoguchi等,Am. J.Respir.Cell.Mol.Biol,10:369-377(1994)；Kass-Eisler等,GeneTherapy,1:395-402(1994)； Kass-Eisler等,GeneTherapy,3:154-162(1996))。这是腺病毒介导基因转移的一个缺点，原因 是腺病毒载体的许多用途(例如，用于诱导或增强针对病原体的免疫应答或提供治疗剂的二次 给药)需要反复施用。针对腺病毒的抗体能够防止或减少腺病毒编码基因表达的机理是不清楚 的。然而，这种现象被宽松地称作“中和作用”，并且起到这种作用的抗体称作“中和抗体”。 因此，为了充分利用腺病毒载体用于体内基因转移，需要这样的新型腺病毒，其(1)不易受由 针对另一个类型腺病毒的抗体引起的中和作用的影响，和(2)不易受由人群体中通常存在的抗 体引起的中和作用的影响。
存在从广泛的动物宿主中分离的许多不同的腺病毒，并且腺病毒由从中首次分离的宿主 命名。已经从中分离出腺病毒的宿主动物包括哺乳动物、鸟类、蛇类、蛙类和鱼类。哺乳动 物宿主包括灵长类等如猴、人和黑猩猩。
人和黑猩猩的亲缘关系极为接近并且一起被归类为人科动物。相反，猴不与人和黑猩猩 归类，因为它们之间存在显著较大的进化距离。猴在2500和3500万年前之间与人科动物趋 异，而人和黑猩猩腺仅在700万年前趋异(Samonte和Eichier,NatureReviewsGenetics,3:65-72 (2002))。人、黑猩猩和猴之间的这些相似性和差异与文献记录的腺病毒宿主范围限制一致。
存在宿主范围限制的许多不同方式。例如，野生型人腺病毒不在猴细胞上大量生长。在 被野生型人腺病毒感染的猴细胞中，病毒早期基因恰当地表达(Feldman等,JBacterial., 91:813-8(1966)；VanderVliet和Levine,Nature,246:170-4(1973))，并且病毒DNA复制正常 进行(Rapp等,J.Bacterial.,92:931-6(1966)；Reich等,PNAS,55:336-41(1966)；Friedman等,J. Virol,5:586-97(1970))。然而，几种晚期病毒蛋白质的表达减少。对晚期基因表达的阻断似 乎归咎于病毒晚期mRNA的异常产生(Klessig和Anderson,J.Virol.,16:1650-68(1975))，并且 这种阻断可以由腺病毒DNA结合蛋白(DBF)的单一突变来克服(Klessig和Grodzicker,Cell,17: 957-66(1979))。在DBF中含有这种单一突变的人腺病毒在猴细胞上大量生长，从而表明猴/ 人阻断的关键在于DBF在腺病毒生命周期期间的作用。
与猴/人阻断相反，观察到从黑猩猩分离的腺病毒在人细胞中没有限制并且可以高效地增 殖(W.P,Rowe等,Proc.Soc.Exp,Biol.Med.,97(2):465-470(1958)；W.D.Hillis等,American JournalofEpidemiology,90(4):344-353(1969)；N.Rogers等,Nature,216:446-449(1967))。具 体而言，发现一些黑猩猩腺病毒分离株的复制在人中比在猴细胞中更高效(M.Basnight等, AmericanJournalofEpidemiology,94(2):166-171(1971))。最近已经表明从其他大猿类物种如 大猩猩(gorillas)和倭猩猩(bonobos)分离的腺病毒在人细胞中生长(S.Roy等,PLoSPathogens, 5(7):el000503(2009))。由于表达E1的细胞系(例如，人胚肾293细胞、人视网膜PER.C6细 胞)和不表达E1的细胞系(A549人肺上皮癌细胞)已经用于野生型黑猩猩腺病毒的增殖，因此 它们在人细胞中复制不需要人腺病毒互补因子的表达(美国专利6,083,716；S.F.Farina等, JournalofVirology,74(23):1603-11613(2001)；S.Roy等,Virology,324:361-372(2004)；S.Roy 等,HumanGeneTherapy,15:519-530(2004)；E.Fattori等,GeneTherapy,13(14):1088-1096 (2006)；J.Skog等,MolecularTherapy,15(12):2140-2145(2007)；D.Peruzzi等,Vaccine,27(9): 1293-1300(2009))。不存在复制阻断与人和黑猩猩谱系之间密切的进化距离是一致的，它们在 仅在约700万年前趋异(Saraonte和Eichler,NatureReviewsGenetics,3:65-72(2002))。
与更大的宿主趋异性一致，已经描述了猴腺病毒在人细胞上生长的宿主范围限制(Am.J. Hyg.,68:31(1958)；Virology,35:248(1968)；Savitskaya等,DokladyBiochemistry,375:242 (2000)；Alstein等,JVi,2:488(1968)；Genetiki,39(6):725-31(2003年6月))，并且已经假设决 定因素部分地是E4并且可能是E2。Savitskaya等在上文报道，猴腺病毒SV7(C8)(现在称作 SV16(ICTV第8次报告，第220页)不在人胚肾(HEK)细胞系293上生长。因此，来自人腺病 毒的E1区不足以减轻对复制的阻断。病毒可以在插入Ad5E4区的HEK-293细胞(VK-10-9 细胞)上生长。然而，VK-10-9细胞仅提供复制阻断的部分减轻，因为复制比CV1细胞(绿猴 肾的连续细胞系)上低40倍。这表明VK-10-9细胞中仍存在对猴病毒复制的阻断。这些作者 基于E4ORF蛋白质水平得出结论：E4表达太低(Krougliak和Graham,Hum.GeneThen,6:1575 (1995))并且可能需要病毒特异性产物(Savitskaya等，上文)。这些作者随后提出该产物可能由 E2A基因编码，尽管将需要额外的研究来澄清这个问题。Savitskaya等在上文还指出，低E4 表达可能是原因或者可能需要来自E2A的额外因子以完全免除复制阻断，并且需要额外研究 来限定原因。有趣地，虽然据报道VK-10-9细胞中的E4表达水平较野生型Ad5复制期间显 著更低，但是该水平对于E4缺失的人腺病毒病毒5型复制到与HEK-293细胞中野生型人Ad5 相同的水平是足够高的(Krougliak和Graham1995)，这进一步表明E4的表达水平不是物种特 异性阻断的充分解释。因此，虽然认为需要更多E4表达和/或E2A产物，但二者均不需要。 另外，显然，对于病毒生长所需要的Ad5E4功能与克服猴腺病毒在人细胞上的宿主范围限制 所需要的功能无关，原因是用于生长的E4需求是与用于决定宿主范围的E4需求不相同的。 因此，Savitskaya等在上文表明，腺病毒E1区和E4区可能不足以用于减轻物种阻断并且其 他区域（尤其编码DBP(E2A)的区域）是重要的。
此外，在另一项研究中，显示人Ad2和SA7(C8)的腺病毒-腺病毒杂合体是复制缺陷型的， 表明人E和猴E4是不相容的，并且人腺病毒E1不足以克服宿主范围限制，这与其中从细胞 表达的人E1不改变宿主范围的上述结果一致(Alstein等,JVi,2:488(1968)；Savitskaya等,上 文)。Ad2和SA7(C8)之间的不同腺病毒杂合体通过在阻止Ad2增殖的选择条件下使这两种病 毒生长而产生(Grinenko等,MolecularGenetics,MicrobiologyandVirology,5:25(2004))。在人 细胞(HEK-293)上生长和选择杂合病毒产生已经仅并入SA7(C8)的L3区的缺陷型病毒。这些 作者指出Ad2E4和E2A(编码DNA结合蛋白)在缺陷型杂合体中存在并且完好无损，并且声 称基因E4以及有可能E2A参与决定物种特异性宿主范围，这与需要不止E4以减轻宿主范围 限制的较早结论一致。这些结果显示，为了在人细胞上培育猴-人腺病毒杂合体，仅可以移除 10%的Ad2基因组，留下90%的Ad2基因组含有宿主范围决定因子。因此，这种杂合体没有 进一步阐明猴腺病毒在人细胞上生长所需要的人腺病毒产物。总而言之，这些报道表明E4 在宿主范围决定方面发挥作用，但是其他腺病毒基因也发挥作用。另外，E4区由至少5种已 知蛋白质产物组成，并且尽管进行过这些研究，但是没有鉴定出对部分减轻宿主范围阻断可 能必需的E4的组分或多种组分。
因此，对这样的方法存在需求，所述方法可以减轻并且甚至移除防止猴腺病毒在人细胞 上高效增殖或复制的物种特异性阻断或宿主范围限制。还对能够绕过对人类中抗腺病毒的先 存免疫力的腺病毒和腺病毒载体存在需求。本发明提供了此类方法、腺病毒和载体，以及使 用它们的方法。
发明简述
本发明提供一种猴腺病毒。所述猴腺病毒能够在包含人腺病毒的一种或多种基因产物的 细胞中增殖。
本发明还提供一种用于在细胞中增殖猴腺病毒的方法，其中所述细胞包含人腺病毒的基 因产物(和/或编码核酸序列)。在一个实施方案中，本发明提供一种细胞，其包含(a)人腺病毒 E1区的至少一个核酸序列，和(b)人腺病毒E4区的至少一个核酸序列。在另一个实施方案中， 提一种增殖猴腺病毒的方法，该方法包括使细胞与所述猴腺病毒接触。所述细胞表达由人腺 病毒E1A区和E1B区中一者或两者编码的基因产物和由基本上由人腺病毒E4ORF6组成的 E4区的一部分编码的基因产物，由此所述猴腺病毒在所述细胞中增殖。
本发明还提供一种用于在细胞中增殖猴腺病毒的方法，其中所述猴腺病毒包含编码人腺 病毒基因产物的核酸序列。在一个实施方案中，所述猴腺病毒包含(a)人腺病毒E1区的至少 一个核酸序列和(b)人腺病毒E4区的至少一个核酸序列。在另一个实施方案中，提一种增殖 猴腺病毒的方法，该方法包括使细胞与所述猴腺病毒接触。在一些实施方案中，所述猴腺病 毒包含编码人腺病毒的一种或多种基因产物的核酸序列，其中所述一种或多种基因产物包括 由负责减轻或克服人细胞中宿主复制阻断的E4区的一部分编码的基因产物，所述部分基本上 由E4ORF6组成，并且由此所述猴腺病毒在所述细胞中增殖。在一些实施方案中，所述一种 或多种基因产物还包括由人腺病毒E1A区和E1B区中一者或两者编码的基因产物。
本发明还提供一种通过本文所述的此类增殖方法获得的猴腺病毒。
在另一个方面，其中所述猴腺病毒增殖的细胞优选地是人细胞，并且在某些实施方案中 的猴腺病毒是复制缺陷型的。人腺病毒优选地是种类C人腺病毒。
本发明提供了优于现有技术的众多优点，包括用于解决人类中对人腺病毒的先存免疫力 顾虑的手段。本发明还提供了用于减轻或克服针对猴腺病毒在人细胞中增殖或复制的宿主范 围限制或阻断的明显改进的方法。本发明因此使得能够使猴腺病毒大量生长并且将猴腺病毒 用于各种目的，最突出地包括治疗和预防人类中的疾病。
附图简述
图1是说明灵长目分类的图。
图2A和图2B是说明在单次裂解条件下产生猴腺病毒子代的图。图2A描述了在表达的 Ad5因子方面不同的人细胞系中的产生(A549=无Ad5因子，A549+Ad5E4ORF6=Ad5E4ORF6 因子，293-ORF6=Ad5E1和E4ORF6因子)。图2B描述了在具有Ad5E1(293细胞)、Ad5E1+Ad5 E4ORF6的人细胞系中或在猴细胞系(BSC-1)中的产生。数据是平均值+/-标准偏差。
图3是示意图，其说明构建具有替换E1的表达盒的猴腺病毒的方法。带有所标识的主要 区域的猴腺病毒基因组(SV)(未按比例)：点画框=ITR，Ψ=包装信号，TATA=E1a启动子的 TATAA框，和E1a、E1b、pIX、E3及E4的编码区。B是受体质粒，其包含由在pIX编码序 列和ITR之间线性化的CMV启动子(箭头)、开放阅读框(orf)和SV40聚腺苷酸化信号(SV)组 成的表达盒、细菌复制起点(Ori)和编码卡那霉素(Kan)耐药性的基因。SV基因组和质粒B之 间的同源重组(X)导致CMV-orf表达盒替换E1启动子和E1A和E1B编码序列。通过用这两 种DNA转化重组感受态细菌BJ5183产生同源重组，从而产生质粒C。筛选耐受Kan的细菌， 并且通过限制性消化和测序鉴定质粒C。在病毒基因组转染至293-ORF6细胞中以产生病毒 颗粒之前，用识别病毒基因组外部的位点(R)的核酸内切酶限制性消化质粒C。
发明详述
本发明总体上提供了减轻或克服防止猴腺病毒在人细胞中高效增殖或复制的物种特异性 阻断或宿主范围限制的方法。
本发明总体上还提供一种猴腺病毒，其使用伴有在人群体中不存在针对猴腺病毒的先存 免疫力的优点。
在一个方面，本发明提供用于在细胞中增殖猴腺病毒的方法，其中所述细胞表达人腺病 毒的一种或多种基因产物，和/或其中所述猴腺病毒包含编码人腺病毒基因产物的核酸序列。
在第二方面，本发明提供了通过此类增殖方法获得的猴腺病毒。
在第三方面，本发明提供了所述猴腺病毒作为载体的用途。
本发明提供一种增殖猴腺病毒的方法，所述方法包括使细胞(转化此细胞)与该腺病毒接 触。在一个实施方案中，该细胞包含由人腺病毒的E1A区、E1B区和E4区中一者或多者编 码的基因产物。在另一个实施方案中，该细胞包含有负责减轻或克服猴腺病毒在人细胞中的 宿主复制阻断的基因产物(和/或其编码性核酸序列)。在另一个实施方案中，该方法包括使细 胞与猴腺病毒接触，其中该细胞表达由人腺病毒E1A区和E1B区中一者或两者编码的基因产 物，和由负责减轻或克服人细胞中宿主复制阻断的E4区的一部分编码的基因产物，所述部分 基本上由E4ORF6组成，并且由此猴腺病毒在所述细胞中增殖。在另一个实施方案中，该方 法包括使细胞与猴腺病毒接触，其中猴腺病毒包含编码人腺病毒基因产物的核酸序列，所述 人腺病毒基因产物可以包括由人腺病毒的E1A区、E1B区和E4区中一者或多者编码的基因 产物，并且将包括负责减轻或克服人细胞中宿主复制阻断的E4区的部分编码的基因产物。在 另一个实施方案中，提供一种增殖猴腺病毒的方法，该方法包括使细胞与所述猴腺病毒接触。 所述猴腺病毒包含编码人腺病毒的一种或多种基因产物的核酸序列，其中所述一种或多种基 因产物包括由负责减轻或克服人细胞中宿主复制阻断的E4区的一部分编码的基因产物，所述 部分基本上由E4ORF6组成，并且由此所述猴腺病毒在所述细胞中增殖。
在一些实施方案中，所述细胞表达负责减轻或克服物种特异性阻断的E4区。在一些实施 方案中，表达的E4区包含ORF6。在一些实施方案中，表达的E4区基本上由ORF6组成。 在一些实施方案中，表达的E4区由ORF6组成并且没有E4区的其他ORF。
在一个实施方案中，接触猴腺病毒的细胞优选地表达人腺病毒C种类的一种或多种基因 产物，所述种类C人腺病毒包括众多的人腺病毒，包括优选的人血清型5腺病毒。
人细胞优选用于增殖猴腺病毒，并且优选的人细胞包括HEK-293细胞或PerC.6细胞。
猴腺病毒也可以是复制缺陷型的。当为复制缺陷型时，所述腺病毒需要该腺病毒的E1A 区、E1B区和E4区中一者或多者的互补作用以用于增殖。在一个实施方案中，所述猴腺病毒 包含在腺病毒基因组的E1区内的缺陷和E4区至少一部分内的缺陷。在又一个实施方案中， 该腺病毒还包含在腺病毒基因组E3区内的缺陷。
在另一个实施方案中，该猴腺病毒可以包含异源核酸序列，包括编码抗原的核酸序列。 所述猴腺病毒优选地包含腺病毒E1区的缺失并且更优选地还包含腺病毒E4区的至少一部分 的缺失，并且所述异源核酸序列插入该腺病毒缺失的E1区或缺失的E4区中。
所述猴腺病毒可以具有已知或未来发现的多种血清型，包括以下已知的血清型1、3、7、 11、16、18、19、20、27、33、38、39或其组合。
如本文所用，术语“猴”指新世界猴和旧世界猴，并且不包括人科(Hominidae)的任何成员 (例如，人、黑猩猩、大猩猩和猩猩(orangutans)，它们又称作“巨猿”)。新世界猴包括狨猴科 (Cattitrichidae)(例如，绒猴(marmoset)和绢毛猴(tamarin))、卷尾猴科(Cebidae)(例如，僧帽猴 (capuchin)和松鼠猴(squirrelmonkey))、青猴科(Aotidae)(例如，夜猴或枭猴(douroucouli))、僧 面猴科(Pitheciidae)(例如，绒（绢毛猴）（titis）、粗尾猴（sakis）和秃猴（uakaris）)和蜘蛛 猴科(Atelidae)(例如，吼猴、蜘蛛猴和绒毛猴)(见，例如，Hershkovitz(编著),LivingNewWorld Monkeys(Platyrrhini),第1卷,UniversityofChicagoPress(1977))。旧世界猴包括猕猴亚科中 的动物，例如猕猴、狒狒和白眉猴(见，例如，Whitehead编著,OldWorldMonkeys,Cambridge UniversityPress(2002))。术语“猴(monkey)”还在本文中与术语“猴(simian)”同义使用。图1中 说明灵长目分类。
腺病毒血清型基于中和测定法划分。血清型定义为与其他类型不显示交叉反应或显示有 限交叉反应的类型(见,Fauquet等(编著)，VirusTaxonomy:TheEighthReportoftheInternational CommitteeonTaxonomyofViruses,AcademicPress,第216页(2005))。血清学上可区分的血清 型(也称作腺病毒“型”)划分成种。习惯上，种名称反映首次描述的宿主。缺少交叉中和，同时 计算的系统发生距离大于10%，可将两个血清型区分成两个不同种。此外，种命名取决于腺 病毒血清型之间不同的其他特征，包括宿主范围、DNA杂交、RFLP分析、基因组中的GC 百分数、啮齿类中的致瘤性、生长特征、重组概率、VARNA基因数目、血凝性、E3区的遗 传构成及宿主范围。从猴分离的猴腺病毒距人腺病毒和黑猩猩腺病毒更远。黑猩猩腺病毒与 常见人腺病毒种类B和E亲缘关系密切，如此相似以致于将黑猩猩腺病毒划归于人种类B和 E。对猴腺病毒的有限系统发生重构揭示，猴腺病毒与常见的黑猩猩病毒和人腺病毒相当不同 (VirusTaxonomy:VlllthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(2005))。感 染灵长类的腺病毒的系统发生在例如Roy等,PLoSPathog.,5(7):e100050.doi: 10.1371/journal.ppat.1000503(2009)中公开。
多种起源、血清型或血清型混合物可以用作猴腺病毒载体的病毒基因组来源(如在例如， 美国专利7,247,472和7,491,508中描述那些)。例如，猴腺病毒可以具有血清型1、3、6、7、 11、16、18、19、20、27、33、38、39、48、49、50或任何其他猴腺病毒血清型。可以通过 使用本领域已知的任何合适的缩写例如SV、SAdV或SAV来指称猴腺病毒。在一些实施方 案中，猴腺病毒载体是血清型3、6、7、11、16、18、19、20、27、33、38或39的猴腺病毒 载体。在一些实施方案中，猴腺病毒载体是血清型7、11、16、18或38。在一个实施方式中， 猴腺病毒载体是血清型7。从猴分离的这些猴腺病毒与人血清型5腺病毒具有低序列同源性， 并且虽然与肠F和G血清型腺病毒相当不同，但是与其更密切相关。它们含有两个不同的纤 维基因(长纤维和短纤维)，而不是一个纤维基因，这表明它们可以靶向肠粘膜，类似于嗜肠 性人腺病毒，在那里它们预期刺激粘膜免疫应答。此外，病毒六邻体蛋白之间的比较表明， 猴腺病毒血清型7、11、16和38与人腺病毒关系较远，并且更密切地归类为嗜肠腺病毒(人 Ad40、41和52)而不划入其他组。
使用任何适合的方法，可以分离任何血清型的野生型猴腺病毒。例如，使用本领域的标 准方法，可以从猴活检和身体分泌物(包括肠活检、粪便洗液、鼻洗液、肺洗液和其他身体分 泌物)分离猴腺病毒。野生型猴腺病毒也可从商业来源如美国典型培养物保藏中心(ATCC，马 纳萨斯，弗吉尼亚州)获得。
在一些实施方案中，猴腺病毒来自狒狒(例如，ATCC-VR275)或恒河猴(或非洲绿猴(例如， ATCC-VR196、ATCC-VR201、ATCC-VR209、ATCC-VR353、ATCC-VR355、ATCC-VR541、 ATCC-VR941、ATCC-VR942和ATCC-VR943)。
本发明提供了猴腺病毒在人细胞中增加的复制，同时在大部分情况下优选地完全减轻宿 主范围阻断。本文中提出的数据证实，猴腺病毒在人细胞上不生长，并且与猴细胞相比，表 明猴腺病毒在具有人腺病毒组分的人细胞上相等或甚至优越的生长(见实施例1)。实施例1显 示了猴腺病毒子代在具有最少人腺病毒组分的人细胞系上的高生产率，与猴细胞上可比较或 甚至更高，这与上文Savitskaya等中所报道的少40倍相反。在一些实施方案中，可以通过在 腺病毒感染期间表达人腺病毒E4ORF6蛋白(34K)的同时在人胚肾细胞系293(HEK-293)上增 殖猴病毒来移除宿主范围限制。令人惊讶的是，实施例1中34k蛋白在HEK-293细胞中的表 达太低，以致于不能检测到，这令人想起先前对V-10-9细胞所报道的情况(Krougliak和Graham, Hum.GeneTher.,6:1575(1995))。因此，出乎意料的是，实施例1中的人细胞系如同猴细胞 容许猴腺病毒那样同等地容许猴腺病毒(数据未显示)。
因此，根据本发明，为了克服猴腺病毒在人细胞上生长的宿主范围限制，必须在细胞中 病毒复制期间表达人腺病毒E4的子类或部分，而不是整个E4区，原因是E4克服人细胞中 复制阻断的功能存在于ORF6内部。VK-10-9细胞不能充分支持猴腺病毒生长的原因可能是 在插入细胞的人E4序列内存在抑制功能。因此，宿主范围决定因素不包括全部E4，并且不 包括E2A。相反，宿主范围决定因素是E4ORF6，并且显然不是单独或组合的在E4内部编 码的其他因子之一。尤其，根据E4ORF6足够使用的发现，可以再解释Savitskaya等上文中 的数据，即，需要更少而非更多的E4并且抑制猴腺病毒在人细胞中生长的组分可能存在于 VK-10-9细胞中所包含的人腺病毒E4内。
鉴定出允许猴腺病毒在人细胞上复制的人腺病毒组分具有许多优点，例如，但不限于， 可行地制造基于猴腺病毒的产品。此外，与需要全部E4相比，能够减少为减轻对人细胞上猴 腺病毒的宿主范围阻断所需要的E4组分的能力具有明显的优点。简化E4需求允许更容易地 操作DNA序列和恰当地调节E4序列的表达。这允许更容易地设计允许猴病毒在人细胞上增 殖的系统。例如，人腺病毒E4序列的子类可以被包含于猴腺病毒基因组中，整合至细胞的基 因组中，或者既不作为人细胞的部分，也不作为猴腺病毒的部分而在染色体额外地存在。仅 用包含E4ORF6的E4序列子类操作允许更容易和更可靠地调节这些序列的表达。这种增强 的控制导致更高产量的猴腺病毒，这将允许降低商品的成本并且扩展可以使用猴腺病毒的商 业及科学应用。
鉴定到足以允许猴腺病毒在人细胞上复制的人腺病毒组分的另一个优点是能够产生条件 复制性腺病毒(CRAD)。例如，在猴腺病毒中纳入处于对给定疾病、综合征、病状、组织或细 胞类型特异性的表达控制元件下的人腺病毒E1和E4ORF6序列允许猴病毒仅在需要时以受 控方式复制。CRAD的应用是众多的并且包括，例如裂解肿瘤细胞、仅在病毒载体复制的条 件下表达治疗性基因和有限复制型疫苗。
鉴定到足以使猴腺病毒在人细胞上显著复制的人腺病毒组分的另一个优点是能够产生其 中转基因表达盒并入猴腺病毒基因组中的腺病毒基因转移载体。源自人细胞系-人腺病毒系统 上所增殖猴腺病毒的腺病毒载体具有以下优点：(1)在人群体中不存在针对猴腺病毒的先存免 疫力，(2)对复制的物种特异性阻断以增强人群安全性，和(3)避免因在非人细胞系上制造所致 的不确定性异种病原体风险。例如，发现猴多瘤病毒SV40污染在猴细胞上制造的多批人疫 苗产品。
用于产生猴腺病毒载体的互补性细胞系包括，但不限于293细胞(其在例如，Graham等,J. Gen.Virol,36:59-72(1977)中描述)、PER.C6细胞(其在例如，国际专利申请公开WO97/00326 和美国专利5,994,128和6,033,908中描述)和293-ORF6细胞(其在例如，国际专利申请公开 WO95/34671和Brough等,J.Virol,71:9206-9213(1997)中描述)。另外的互补性细胞在例如美 国专利6,677,156和6,682,929以及国际专利申请公开WO03/20879中描述。在一些情况下， 细胞基因组不需要包含基因产物补足复制缺陷型腺病毒载体全部缺陷的核酸序列。在复制缺 陷型腺病毒载体中缺少的一项或多项复制必需基因功能可以由辅助病毒(例如，反式提供对于 所需腺病毒载体复制所需要的一项或多项必需基因功能的腺病毒载体)提供。经常将辅助病毒 工程化以防止感染性辅助病毒的包装。例如，腺病毒基因组的E1区的一项或多项复制必需基 因功能由互补性细胞提供，而腺病毒基因组的E4区的一项或多项复制必需基因功能由辅助病 毒提供。
理想地，复制缺陷型猴腺病毒载体存在于基本上没有可复制性腺病毒(RCA)污染的组合 物中，例如，药物组合物，(例如基于该组合物中的总腺病毒，该组合物包含小于约1%的可 复制性腺病毒)。最希望的是，该组合物不含RCA。美国专利5,944,106、美国专利申请公开 2002/0110545A1和国际专利申请WO95/34671中描述了无RCA的腺病毒载体组合物和原液。
如果猴腺病毒载体不是复制缺陷型的，则理想地操纵猴腺病毒载体以使该载体的复制限 于靶组织内部。例如，所述猴腺病毒载体可以是条件复制型腺病毒载体，所述载体经工程化 以在执业医师所预定的条件下复制。例如，复制必需基因功能，例如，由腺病毒早期区域编 码的基因功能，可以与诱导型、阻遏型或组织特异性转录控制序列（例如启动子）可操作地 连接。在该实施方案中，复制需要存在或不存在与转录控制序列相互作用的特定因子。在治 疗病毒感染时，例如，可能有利的是控制腺病毒载体例如在淋巴结中复制以获得连续的抗原 产生并且控制免疫细胞产生。条件复制型腺病毒载体进一步在美国专利5,998,205中描述。
猴腺病毒的用途之一是将蛋白质或蛋白质的部分递送至细胞。递送蛋白质的一种方法是 将它们系留至病毒衣壳的一种外壳蛋白。可以修饰衣壳以促进这种系留。存在修饰病毒衣壳 以将非腺病毒物质系留至该衣壳的众多实例。一些修饰在本质上是蛋白质性质的，而其他则 不是。可以与腺病毒衣壳连接的物质的实例包括抗体、受体、PEG和交联化学品。病毒衣壳 基因也可以进行基因修饰以包含外源基因或其部分，从而所述外源基因产物是病毒衣壳蛋白 的部分，所述病毒衣壳蛋白变成病毒颗粒的部分。该蛋白质的作用可以在该蛋白质内化或不 内化的情况下施加于细胞。如果该蛋白质不内化，它可能激活或失活细胞途径，导致想要的 结果。此外，如果猴病毒内化，则该蛋白质可以对细胞施加作用。该蛋白质还可能刺激可能 针对蛋白质本身的免疫应答。已经显示衣壳蛋白纤维、六邻体、pIX和五邻体均能够被修饰 以包含非腺病毒蛋白质或其部分和或非蛋白质物质。
修饰病毒衣壳可以具有另外的益处。可以改变病毒的天然嗜性。可能使该病毒再指向一 种新受体，可以废除病毒与其正常受体的相互作用，或可以增强病毒与其正常受体的相互作 用。猴腺病毒的再指向可以通过将病毒指向想要的细胞类型而增加病毒的期望活性，或这可 以帮助避开可能产生不期望后果的细胞类型。修饰作用也可以导致逃避免疫系统。可以同时 修饰多种衣壳蛋白。
可以操作腺病毒的外壳蛋白以改变腺病毒对潜在宿主细胞上受体的结合特异性或识别。 对于腺病毒，此类操作可以包括缺失腺病毒外壳蛋白的区域(例如，纤维、五邻体或六邻体)、 将多种天然或非天然配体插入到外壳蛋白的部分等。对外壳蛋白的操作可以拓宽受腺病毒感 染的细胞的范围或使得能够将腺病毒靶向至特定细胞类型。
可以操作腺病毒载体以改变腺病毒对潜在宿主细胞上受体的结合特异性或识别。对于腺 病毒，此类操作可以包括缺失腺病毒外壳蛋白的区域(例如，纤维、五邻体或六邻体)、将多 种天然或非天然配体插入到外壳蛋白的部分等。对外壳蛋白的操作可以拓宽受猴腺病毒载体 感染的细胞的范围或使得能够将猴腺病毒载体靶向至特定细胞类型。这也可以避免与存在于 血液中的蛋白质如凝血因子X(FX)相互作用，这种相互作用可能影响腺病毒载体生物学。六 邻体的修饰是避免与FX相互作用的优选方法。
可以使用用于改变与宿主细胞的天然结合(如纤维蛋白与其细胞受体的天然结合)的任何 适合技术。例如，变动纤维长度可以用来减弱与细胞的天然结合。这任选地可以通过将结合 序列添加至五邻体基部或纤维结节来完成。可以通过双特异性或多特异性结合序列直接或间 接地进行结合序列的这种添加。在备选实施方案中，可以修饰腺病毒纤维蛋白以减少纤维柄 部内氨基酸的数目，从而产生“短柄”纤维(如例如美国专利5,962,311中所描述的)。包含短柄 腺病毒纤维基因的腺病毒的使用降低了腺病毒纤维与其细胞表面受体结合的水平或效率并且 增加腺病毒五邻体基部与其细胞表面受体的结合，从而增加腺病毒与给定细胞结合的特异性。 备选地，通过将非天然氨基酸序列导入五邻体基部或纤维结节中，包含短柄纤维的猴腺病毒 载体的使用使得能够将猴腺病毒载体靶向至期望的细胞表面受体。
在又一个实施方案中，可以改变、补充或缺失编码与天然基底结合相关的氨基酸残基的 核酸残基(见，例如，国际专利申请公开WO00/15823,Einfeld等,J.Virol，75(23):11284-11291 (2001)和vanBeusechem等,J.Virol,76(6):2753-2762(2002))，以致于并入突变的核酸残基(或 因此具有其所编码的纤维蛋白)的猴腺病毒载体更难以能够结合其天然基底。
可以突变或移除纤维蛋白中介导或辅助该结节与天然细胞受体之间相互作用的任何适合 的氨基酸残基，只要纤维蛋白能够三聚化。类似地，可以将氨基酸添加至纤突节，只要纤维 蛋白保持三聚化能力。合适的残基包括在纤突节结构域的暴露环（例如AB环、DE环、FG 环和HI环）内部的氨基酸。
可以突变或移除五邻体基底蛋白中介导或辅助五邻体基底蛋白与整联蛋白之间相互作用 的任何合适的氨基酸残基。合适的残基包括例如位于猴腺病毒五邻体基底蛋白的高变区内的 RGD氨基酸序列基序。也可以通过以下方式破坏五邻体基底蛋白上的天然整联蛋白结合位 点：修饰编码天然RGD基序的核酸序列，从而天然RGD氨基酸序列在构象上无法用于与整 联蛋白受体结合，如将DNA序列插入编码腺病毒五邻体基底蛋白的核酸序列中或与其毗邻。
猴腺病毒载体可以包含不与其相应的天然细胞结合位点结合的纤维蛋白和五邻体基底蛋 白。备选地，猴腺病毒载体包含与其相应的天然细胞结合位点结合，但亲和力小于相应野生 型外壳蛋白的纤维蛋白和五邻体基底蛋白。如果修饰的腺病毒纤维蛋白和五邻体基底蛋白与 它们相应的天然细胞结合位点以比相同血清型的未修饰的腺病毒纤维蛋白和五邻体基底蛋白 低至少约5倍、10倍、20倍、30倍、50倍或100倍的亲和力结合，那么猴腺病毒载体显示 出与天然细胞结合位点减低的结合。
猴腺病毒载体也可以包含嵌合外壳蛋白，所述嵌合外壳蛋白包含结合基底(即，配体)(如 除天然细胞受体之外的细胞受体)的非天然氨基酸序列。嵌合腺病毒外壳蛋白的非天然氨基酸 序列允许包含嵌合外壳蛋白的猴腺病毒载体结合并且期望地感染不被不含所述非天然氨基酸 序列的相应腺病毒天然感染的宿主细胞(即，不被相应野生型腺病毒感染的宿主细胞)，与被 相应野生型腺病毒天然感染的宿主细胞以比不含所述非天然氨基酸序列的相应腺病毒更大的 亲和力结合，或与特定靶细胞以比非靶细胞更大的亲和力结合。“非天然的”氨基酸序列可以 包括不天然存在于腺病毒外壳蛋白中的氨基酸序列或存在于腺病毒外壳中但是位于衣壳内的 非天然位置的氨基酸序列。所谓“优先地结合”意指非天然氨基酸序列以比非天然配体结合不 同受体(例如αvβ1整联蛋白)大至少约3倍(例如，至少约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、 35倍、45倍或50倍的亲和力)的亲和力结合受体，如例如αvβ3整联蛋白。
猴腺病毒载体可以包含含有非天然氨基酸序列的嵌合外壳蛋白，所述的非天然氨基酸序 列赋予该嵌合外壳蛋白比野生型腺病毒外壳蛋白与免疫细胞更高效结合的能力。特别地，猴 腺病毒载体可以包含嵌合腺病毒纤维蛋白，所述嵌合腺病毒纤维蛋白包含促进猴腺病毒载体 由免疫细胞、优选地抗原呈递细胞如树枝状细胞、单核细胞和巨噬细胞摄入的非天然氨基酸 序列。在优选的实施方案中，猴腺病毒载体包含嵌合纤维蛋白，所述嵌合腺病毒纤维蛋白包 含含有RGD基序的氨基酸序列(例如，非天然氨基酸序列)，所述RGD基序增加猴腺病毒载 体进入树枝状细胞的转导效率。将RGD基序或任何非天然氨基酸序列优选地插入至腺病毒纤 突结区域中，理想地在腺病毒结节的暴露环如HI环中。也可以将非天然氨基酸序列附加至腺 病毒纤维蛋白的C末端，任选地通过间隔序列附加。间隔序列优选地包含介于一个至二百个 之间的氨基酸，并且可以(但是不需要)具有希望的功能。
在另一个实施方案中，猴腺病毒载体可以包含对特定类型的真核细胞没有选择性的嵌合 病毒外壳蛋白。该嵌合外壳蛋白与野生型外壳蛋白不同在于将非天然氨基酸序列插入或替换 内部外壳蛋白序列，或非天然氨基酸序列连接至外壳蛋白的N或C末端。例如，包含约5个 至约9个赖氨酸残基(优选地7个赖氨酸残基)的配体可以通过非功能性间隔序列与腺病毒纤 维蛋白的C-末端连接。在该实施方案中，嵌合病毒外壳蛋白高效地与范围较野生型病毒外壳 蛋白更广的真核细胞结合，如美国专利6,465,253和国际专利申请公开WO97/20051中所描 述。
可以在没有遗传操作的情况下调节猴腺病毒载体识别潜在宿主细胞的能力，即，通过使 用双特异性分子。例如，将腺病毒与下述双特异性分子复合使得猴腺病毒载体靶向特定细胞 类型成为可能，其中所述双特异性分子包含五邻体基底结合结构域和选择性结合特定细胞表 面结合位点的结构域。同样地，可以通过非遗传手段将抗原与腺病毒颗粒的表面缀合。
可以将非天然氨基酸序列与腺病毒外壳蛋白中任一者缀合以形成嵌合腺病毒外壳蛋白。 因此，例如，非天然氨基酸序列可以与纤维蛋白、五邻体基底蛋白、六邻体蛋白、蛋白IX、 VI或IIIa等缀合、插入其中或与之连接。使用此类蛋白质的方法是本领域熟知的(见，例如， 美国专利5,543,328；5,559,099；5,712,136；5,731,190；5,756,086；5,770,442；5,846,782；5,962,311； 5,965,541；5,846,782；6,057,155；6,127,525；6,153,435；6,329,190；6,455,314；6,465,253； 6,576,456；6,649,407；6,740,525和6,951,755和国际专利申请公开WO96/07734、WO96/26281、 WO97/20051、WO98/07877、WO98/07865、WO98/40509、WO98/54346、WO00/15823、 WO01/58940和WO01/92549)。嵌合腺病毒外壳蛋白可以使用本领域已知的标准重组DNA 技术产生。优选地，编码嵌合腺病毒外壳蛋白的核酸序列位于腺病毒基因组内部并且与调节 外壳蛋白在野生型腺病毒中表达的启动子可操作地连接。备选地，编码嵌合腺病毒外壳蛋白 的核酸序列位于腺病毒基因组内部并且是表达盒的一部分，所述表达盒包含为高效表达嵌合 外壳蛋白所需要的遗传元件。
嵌合腺病毒外壳蛋白的外壳蛋白部分可以是附加有非天然氨基酸序列的全长腺病毒外壳 蛋白，或它可以被截短的，例如，在内部截短或在C末端和/或N末端处截短。无论怎样修 饰(包括存在非天然氨基酸)，嵌合外壳蛋白优选地能够并入腺病毒衣壳中。在非天然氨基酸 序列与纤维蛋白连接的情况下，优选地，它不扰乱病毒蛋白质或纤维单体之间的相互作用。 因此，非天然氨基酸序列优选地本身不是寡聚化结构域，因为此类结构域可以不利地与腺病 毒纤维的三聚化结构域相互作用。优选地，将非天然氨基酸序列以这样的方式添加至病毒粒 子蛋白并且并入，从而容易地暴露于基底、细胞表面受体或免疫细胞(例如，在腺病毒蛋白的 N-末端或C-末端、与面朝基底的残基连接、位于在肽间隔序列上等)以最大限度地暴露非天然 氨基酸序列。理想地，将非天然氨基酸序列在纤维蛋白的C-末端并入腺病毒纤维蛋白中(并且 经间隔序列连接)或并入纤维的暴露环(例如，HI环)中以产生嵌合外壳蛋白。在非天然氨基酸 序列与五邻体基底连接或替换其一部分的情况下，优选地，它位于高变区内部以确保它接触 基底、细胞表面受体或免疫细胞。在非天然氨基酸序列与六邻体连接的情况下，优选地，它 位于高变区内部(Crawford-Miksza等,J.Virol,70(3):1836-44(1996))。在非天然氨基酸与plX 连接或替换plX的一部分的情况下，优选地，它位于pIX的C-末端内部。使用间隔序列使非 天然氨基酸序列延伸离开腺病毒颗粒的表面可能是有利的，因为非天然氨基酸序列可以更多 地可用于结合至受体，并且可以减少非天然氨基酸序列和腺病毒纤维单体之间的空间相互作 用。
在其他实施方案(例如促进在在特定工程化细胞类型内纯化或增殖)中，非天然氨基酸(例 如，配体)可以结合除细胞表面蛋白之外的化合物。因此，所述配体可以结合血液源和/或淋巴 液源蛋白质(例如，白蛋白)、合成肽序列如聚氨基酸(例如，聚赖氨酸、聚组氨酸等)、人工肽 序列(例如，FLAG)和RGD肽片段(Pasqualini等,J.Cell.Biol.,130:1189(1995))。配体甚至可 以结合非肽基底如塑料(例如，Adey等,Gene,156:27(1995))、生物素(Saggio等,Biochem.J., 293:613(1993))、DNA序列(Cheng等,Gene,171:1(1996)，和Krook等,Biochem.Biophys.,Res. Commun.,204:849(1994))、链霉亲和素(Geibel等,Biochemistry,34:15430(1995)和Katz, Biochemistry,34:15421(1995))、硝基链霉亲和素(Baiass等,Anal.Biochem.,243:264(1996))、 肝素(Wickham等,NatureBiotechnol,14:1570-73(1996))和其他基底。
腺病毒外壳蛋白与细胞表面受体天然结合的破坏也可以使它更不能够与先天或获得性宿 主免疫系统相互作用。腺病毒载体施用诱导炎症并且激活先天和获得性免疫机制。腺病毒载 体激活抗原特异性(例如，T-细胞依赖性)免疫应答，其限制初次施用该载体后转基因表达的持 续时间。此外，暴露于腺病毒载体刺激由B细胞产生中和抗体，这可以阻止由腺病毒载体随 后给药引起的基因表达(Wilson和Kay,Nat.Med.,3(9):887-889(1995))。实际上，反复施用载 体的有效性可能极大地受宿主免疫力限制。除刺激体液免疫之外，细胞介导的免疫功能负责 从身体清除病毒。病毒的快速清除归功于先天免疫机制(见，例如，Worgali等,HumanGene Therapy,8:37-44(1997))，并且可能牵涉肝脏内部存在的枯否氏细胞。因此，通过去除腺病毒 纤维蛋白和五邻体基底蛋白的天然结合，削弱免疫系统对腺病毒载体的识别，从而增加宿主 的载体耐受性。
用于规避针对腺病毒的先存宿主免疫力的方法包括修饰腺病毒外壳蛋白，从而它显示出 减弱的宿主免疫系统识别作用。修饰的外壳蛋白优选地是五邻体、纤维或六邻体蛋白。最优 选地，修饰的外壳蛋白是六邻体蛋白。外壳蛋白可以用任何合适的方式修饰，但是优选地通 过在外壳蛋白中产生多样性来修饰。优选地，此类外壳蛋白变体不被先存的宿主腺病毒特异 性中和抗体识别。可以使用本领域已知的任何合适方法，包括例如定向进化(即，多核苷酸改 组)和易错PGR(见，例如，Cadwell,PCRmethAppl,2:28-33(1991)，Leung等,Technique,1:1 1-15(1989)和Pritehard等,J.TheoreticalBiol,234:497-509(2005))产生多样性。免疫规避也包 括聚乙二醇化等。
也可以通过以下方式修饰腺病毒外壳蛋白以规避先存的宿主免疫力：缺失外壳蛋白的某 个区域并且将其替换为来自另一种腺病毒血清型，尤其在人类中免疫原性较低的血清型的外 壳蛋白的相应区域。就这一点而言，可以将纤维蛋白、五邻体基底蛋白和/或六邻体蛋白内部 的氨基酸序列移去并且替换为来自不同腺病毒血清型的相应序列。因此，例如，当修饰纤维 蛋白以规避先存的宿主免疫力时，可以将来自猴腺病毒纤维蛋白的结节区域的氨基酸残基缺 失并且替换为来自不同血清型(如本文所述的那些血清型)的猴腺病毒中的相应氨基酸残基。 同样地，当修饰五邻体基底蛋白以规避先存的宿主免疫力时，可以将猴腺病毒五邻体基底蛋 白的高变区内的氨基酸残基缺失并且替换为来自不同血清型(如本文所述的那些血清型)的猴 腺病毒中的相应氨基酸残基。优选地，将猴腺病毒载体的六邻体蛋白以这种方式修饰以规避 先存的宿主免疫力。就这一点而言，将六邻体蛋白的环中存在的一个或多个高变区内的氨基 酸残基移去并且替换为来自不同血清型的相应氨基酸残基。可以从六邻体蛋白中移去整个环 区域并且将其替换为另一种猴腺病毒血清型的相应环区域。备选地，可以从猴腺病毒载体六 邻体蛋白中移去环区域的部分并且将其替换为另一种猴腺病毒血清型(猴或人)的六邻体环的 相应部分。可以将猴腺病毒载体的一个或多个六邻体或其部分移去并且替换为来自任何其他 腺病毒血清型(猴或人)(如本文所描述的那些血清型)的六邻体环中的相应序列。修饰六邻体蛋 白的方法在例如Rux等,J.Virol,77:9553-9566(2003)和美国专利6,127,525中公开。也可以将 六邻体蛋白的高变区替换为随机肽序列或源自致病性病原体(例如，HIV)的肽序列。
对腺病毒外壳蛋白的修饰在例如美国专利5,543,328；5,559,099；5,712,136；5,731,190； 5,756,086；5,770,442；5,846,782；5,871,727；5,885,808；5,922,315；5,962,311；5,965,541； 6,057,155；6,127,525；6,153,435；6,329,190；6,455,314；6,465,253；6,576,456；6,649,407； 6,740,525和6,951,755；以及国际专利申请WO96/07734、WO96/26281、WO97/20051、WO 98/07865、WO98/07877、WO98/40509、WO98/54346、WO00/15823、WO01/58940和WO 01/92549中描述。
猴腺病毒也可以用来将遗传物质递送至细胞。遗传物质通常是DNA。插入猴病毒基因组 中的任何DNA在本文中称作异源核酸序列或“hDNA”。存在所述hDNA可以具有的本领域已 知的众多功能。hDNA可以具有调节特性。一些更常见的元件调节转录，如启动子、增强子、 转录终止子、剪接元件、基质结合调节元件、转录绝缘子和聚腺苷酸化序列，不一而足。如 果RNA从所述hDNA产生，它可能具有功能。一些功能在本质上是调节性的，如siRNA、 shRNA、微RNA、反义RNA、VARNA所显示。所述RNA也可以编码多肽如蛋白质。该蛋 白质可以是天然的或以本领域已知的任何方式修饰。存在本领域已知的许多方式来调节RNA 水平、翻译和蛋白质稳定性。
存在调节性RNA和多肽可以具有的众多功能。
异源核酸序列优选地编码病原体的抗原。病原体可以是病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、 人免疫缺陷病毒(HIV)、口蹄疫病毒(FMDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、丙型肝炎病毒(HCV)、埃 博拉病毒或马尔堡病毒。病原体也可以是寄生虫，例如，造成疟疾的疟原虫属(Plasmodium) 寄生虫(例如，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum))。备选地，该异源核酸序列可以编码例如 无调同源物蛋白(例如，HATH1或MATH1)、TNF-α或色素上皮衍生因子(PEDF)。
本发明的腺病毒载体可以有复制能力。例如，腺病毒载体可以在腺病毒基因组中具有不 抑制宿主细胞中病毒复制的突变(例如，缺失、插入或置换)。然而，优选地，腺病毒载体是 复制缺陷型的。所谓“复制缺陷型”意指腺病毒载体包含有缺少至少一个复制必需基因功能 (即，以致于该腺病毒载体在常见宿主细胞中不复制，尤其在人患者内可能在本发明方法过程 中被腺病毒载体感染的那些宿主细胞)的腺病毒基因组。如本文所用，基因、基因功能或者基 因或基因组区域的缺乏定义为病毒基因组的大量遗传物质缺失以致于损害或消除核酸序列完 全或部分缺失的基因的功能。尽管优选遗传物质的缺失，但通过添加或置换使遗传物质突变 也适用于破坏基因功能。复制必需基因功能是复制(例如，增殖)所需要的那些基因功能并且 由例如腺病毒早期区(例如，E1、E2和E4区)、晚期区(例如，L1-L5区)、参与病毒包装的基 因(例如，IVa2基因)和病毒相关RNA(例如，VA-RNA1和/或VA-RNA-2)编码。更优选地， 复制缺陷型腺病毒载体包含在一个或多个腺病毒基因组区域的至少一项复制必需基因功能方 面有缺陷的腺病毒基因组。优选地，腺病毒载体在病毒复制所需要的腺病毒基因组E1A区、 E1B区或E4区的至少一项基因功能方面有缺陷(称作E1-缺陷或E4-缺陷型腺病毒载体)。除 E1区中的缺陷之外，该重组腺病毒还可以在主要晚期启动子(MLP)中具有突变，如国际专利 申请WO00/00628中所讨论。在一些实施方案中，腺病毒载体在E1区的至少一项复制必需 基因功能(期望的是全部复制必需基因功能)方面和非必需E3区的至少一项基因功能方面有缺 陷(例如，E3区的XbaI缺失)(称作E1/E3缺陷型腺病毒载体)。相对于E1区，腺病毒载体可 以在全部或部分的E1A区和全部或部分的E1B区内有缺陷。为了说明但是不限于这个实施方 案，血清型35腺病毒载体可以包含核苷酸570位至3484的E1缺失。当腺病毒载体在腺病毒 基因组的仅一个区域内至少一项复制必需基因功能方面有缺陷时(例如，E1-缺陷型或E1/E3- 缺陷型腺病毒载体)，该腺病毒载体称作是“单一复制缺陷型的”。
本发明的猴腺病毒载体可以是“多重复制缺陷型的”，这意指该腺病毒载体在两个或更多 个腺病毒基因组区域的每个区域内一项或多项复制必需基因功能方面有缺陷。例如，前述的 E1-缺陷或E1/E3-缺陷型腺病毒载体可以在E4区的至少一项复制必需基因功能方面进一步有 缺陷(称作E1/E4-缺陷型或E1/E3/E4-缺陷型腺病毒载体)和/或在E2区的至少一项复制必需基 因功能方面进一步有缺陷(称作E1/E2-缺陷型或E1/E2E3-缺陷型腺病毒载体)，优选地在E2A 区的至少一项复制必需基因功能方面进一步有缺陷(称作E1/E2A-缺陷型或E1/E2A/E3-缺陷型 腺病毒载体)。
通过移除腺病毒基因组的全部或部分，例如E1、E3和E4区，所得到的腺病毒载体能够 接受外源核酸序列的插入，而同时保留被包装入腺病毒衣壳的能力。所述核酸序列可以位于 腺病毒基因组的E1区、E3区或E4区内。实际上，可以将核酸序列插入腺病毒基因组中的任 何位置，只要该位置不阻止该核酸序列的表达或干扰腺病毒载体的包装。腺病毒载体还可以 包含多个(即，两个或更多个)编码相同抗原的核酸序列。或者，腺病毒载体可以包含多个编 码两种或更多种不同抗原的核酸序列。根据执业医师期望的表达谱，每个核酸序列可以与相 同启动子或与不同启动子可操作地连接，并且可以插入腺病毒基因组的相同区域(例如，E4 区)内或腺病毒基因组的不同区域内。
当具有多重复制缺陷型时，尤其在E1和E4区的复制必需基因功能方面，猴腺病毒载体 优选地包含间隔序列以在互补性细胞系中提供病毒生长，类似于由单一复制缺陷型腺病毒载 体、尤其E1-缺陷型腺病毒载体所实现的那种情况。所述间隔序列可以含有期望长度的任何 核苷酸序列或多个序列，如长度为至少约15个碱基对(例如，在约15个碱基对和约12,000 个碱基对之间)、优选地约100个碱基对至约10,000个碱基对、更优选地约500个碱基对至约 8,000个碱基对、甚至更优选地约1,500个碱基对至约6,000个碱基对并且最优选地约2,000 至约3,000个碱基对的序列。间隔元件序列可以是编码性或非编码性的并且相对于腺病毒基 因组是天然或非天然的，但是不恢复缺陷区域的复制必需功能。间隔元件优选地位于腺病毒 基因组的E4区内。美国专利5,851,806中描述了间隔区在腺病毒载体中的用途。
已经观察到至少E4-缺陷型腺病毒载体在体内以高水平表达有限的时间量转基因并且观 察到转基因在至少E4-缺陷型腺病毒载体中表达的持续性可以借助尤其是反式作用因子(如 HSVICP0、AdpTP、CMV-IE2、CMV-IE86、HIVtat、HTLV-tax、HBV-X、AAVRep78、 来自U205骨肉瘤细胞系中如HSVICP0那样发挥作用的细胞因子或PC12细胞中由神经生长 因子诱导的细胞因子)的作用进行调节，如在例如美国专利6,225,113、美国专利申请公开 2002/0031823A1和国际专利申请WO00/34496中所描述。鉴于上文，多重缺陷型腺病毒载 体(例如，至少E4-缺陷型腺病毒载体)或第二表达载体期望地包含编码反式作用因子的核酸序 列，所述反式作用因子调节核酸序列表达的持续性。当产生免疫耐受时，抗原性DNA的持 续表达可能是期望的。
猴腺病毒载体可以在仅腺病毒基因组的早期区域、仅腺病毒基因组的晚期区域以及腺病 毒基因组的早期和晚期区域的复制必需基因功能方面有缺陷。猴腺病毒载体也可以被移除基 本上整个腺病毒基因组，在这种情况下，优选留下至少病毒末端反向重复序列(ITR)和一个或 多个启动子或病毒ITR和包装信号保持完整(即，腺病毒复制子)。在一个实施方案中，本发 明的猴腺病毒载体可以包含缺少编码腺病毒蛋白的天然核酸序列的腺病毒基因组。可以保留 为复制腺病毒基因组和将其包装入腺病毒衣壳蛋白中所需要的腺病毒基因组元件。缺少腺病 毒蛋白编码序列的最小腺病毒载体称作“辅助依赖性”腺病毒载体，并且经常需要辅助腺病毒 的互补作用以高效增殖。在美国专利5,837,511；5,851,806；5,994,106；6,127,175和6,482,616； 美国专利申请公开2001/0043922A1、2002/0004040A1、2002/0031831A1和2002/0110545A1 以及国际专利申请WO94/28352、WO95/02697、WO95/16772、WO95/34671、WO96/22378、 WO97/12986、WO97/21826和WO03/022311中公开了合适的复制缺陷型腺病毒载体，包括 多重复制缺陷型腺病毒载体。
如果腺病毒载体不是复制缺陷型的，则理想地操作腺病毒载体以使该载体的复制限于靶 组织内。例如，所述腺病毒载体可以是条件复制型腺病毒载体，所述载体经工程化以在执业 医师所预定的条件下复制。例如，复制必需基因功能，例如，由腺病毒早期区域编码的基因 功能，可以与诱导型、阻遏型或组织特异性转录控制序列（例如启动子）可操作地连接。在 该实施方案中，复制需要存在或不存在与转录控制序列相互作用的特定因子。在自身免疫病 治疗中，可能有利的是控制腺病毒载体在例如淋巴结中复制以获得连续的抗原产生并且控制 免疫细胞产生。条件复制型腺病毒载体进一步在美国专利5,998,205中描述。
在猴腺病毒中添加大量hDNA可能是有利的。例如，如果需要大的调节序列，需要多重 转录单位或转录物庞大，则这种情况可以出现。由于腺病毒的包装尺寸上限是大约105%野生 型基因组，具有较大基因组的病毒难以产生并且经常是不稳定的。
为克服这种包装和稳定性限制，可以使病毒DNA序列缺失以容纳庞大量的hDNA。存在 至少3个可以从病毒中移除并且仍能够产生感染病毒颗粒的病毒区域(即，E1、E3和E4区)。 这些病毒区域中每个区域由至少一个启动子和多腺苷酸化信号组成，所述区域编码多种转录 物和蛋白质。可以使这些区域的全部或部分从病毒基因组缺失。本领域已知，已经将hDNA 插入或用来替换这些区域的每一个。这些区域可以逐一或组合地进行修饰以产生E1、E3和 E4修饰的病毒。这进一步扩展所述猴病毒的灵活性并因此扩展其用途。
从该病毒移去E1、E3和E4区对于猴腺病毒的用途具有额外益处。这些区域已知编码可 以直接改变宿主细胞或刺激额外的病毒蛋白表达的多种调节蛋白。尤其已知E1和E4区编码 致癌基因。在许多应用中，优选病毒的基因不表达。更少病毒基因表达的益处中的一些是： 来自所添加hDNA的改进的活性，如基因表达，规避在该病毒施用至动物时的免疫监视，和 增加可以施用的病毒剂量。增加剂量和改进hDNA基因调节的能力扩展了猴病毒的应用并且 因此扩展其用途。因此，缺失病毒DNA将同时扩展病毒可以容纳的hDNA的量和从病毒移 除有害序列，从而扩展病毒的用途。
本文所述的技术支持缺失型猴腺病毒的构建。如上文所述，腺病毒E1区编码调节蛋白。 在E1功能不存在的情况下，腺病毒是复制缺陷型的(本文中也称作“复制缺陷型的”)。以下实 施例说明，用人腺病毒E1和E4ORF6实现了E1缺失型猴腺病毒的复制缺陷性的完全互补作 用(见实施例3)。因此，对于猴腺病毒在猴细胞上生长必需的这些区域对人细胞系-人腺病毒 系统中的生长是非必需的(实施例3)。由E3区编码的蛋白质对病毒生长是非必要的。本领域 已知，甚至在带有E1缺和或E4缺失的病毒中容易产生带有E3缺失的腺病毒。令人惊讶的 是，在多种已知的E4蛋白中，一种负责扩展猴腺病毒宿主范围至人细胞的蛋白质(ORF6)也 能够对E4缺失型腺病毒生长起到补足作用。已经显示，来自相同C组血清型的E1和E4表 达均支持带有E1-、E3-、E4-缺失的非种类C腺病毒生长(Tatsis等,GeneTher.,13(5):421-9 (2006))。
源自猴腺病毒的腺病毒载体用于以下的应用：(1)用于传染病适应症的疫苗载体，(2)用于 抗癌应用的疫苗载体，(3)转移编码治疗性蛋白的转基因用于急性和慢性疾病介入治疗。
猴腺病毒载体可以用于诱导哺乳动物中的免疫应答(接种)。在这个方面，人腺病毒载体 的广泛用途至少部分地因载体的免疫原性而受阻。大部分的美国人群已经暴露于野生型人腺 病毒并且发展针对基于人腺病毒的基因转移载体的先存免疫力。因此，人腺病毒载体因先存 的宿主免疫应答而失活，从而降低该载体的效力。身体内对腺病毒载的中和和/或清除使得使 用这些载体作为DNA疫苗复杂化。DNA疫苗利用基因转移载体来递送编码抗原的DNA至 宿主细胞。通过在体内产生抗原性蛋白质，将免疫系统的体液介导免疫和细胞介导的免疫激 活，从而与其中将外源蛋白注入体内的传统疫苗相比，产生针对该抗原的更完整免疫应答。 尽管人腺病毒载体作为基因递送载体存在有利特征，然而该载体的免疫原性阻止了高效的反 复给药，这可以有利于“增强”免疫系统对抗病原体，并且导致仅一小部分剂量的腺病毒载体 递送其有效载荷至宿主细胞。
猴腺病毒载体将不经历由针对人腺病毒的先存免疫力介导的中和和/或清除。另外，两种 或更多种猴腺病毒载体的组合将避免随着反复施用人腺病毒载体时所观察到的抑制；因此将 可能增强免疫系统对抗病原体。因此，猴腺病毒载体提供了人腺病毒载体的相同优点，而没 有其缺点。
本发明腺病毒的一个实施方案包括编码抗原的核酸序列，其中所述抗原在哺乳动物中表 达以诱导免疫应答。“抗原”是在哺乳动物中触发免疫应答的分子。“免疫应答”可以引起例如 抗体生产和/或免疫效应细胞的活化。在本发明的语境下的抗原可以包括任何蛋白质分子的任 何亚单位，所述蛋白质分子包括病毒、细菌、寄生虫、真菌、原虫、朊蛋白、细胞或胞外来 源的蛋白质或肽，它们理想地在哺乳动物中诱发免疫应答，优选地导致保护性免疫。抗原也 可以是自身抗原，即，身体已经将其错误地视为外来入侵者的自体蛋白。
在一个实施方案中，抗原是病毒抗原。病毒抗原可以从任何病毒分离，所述病毒包括， 但不限于来自以下任何病毒科的病毒：沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)、 星状病毒科(Astroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)、杆状 RNA病毒科(Barnaviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、 布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、毛状病毒组(Capillovirus)、香石竹 潜隐病毒属(Carlavirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、圆环病毒科(Circoviridae)、线形 病毒组(Closterovirus)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠 状病毒属(Coronavirus)、如严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)病毒)、覆盖噬菌体科 (Corticoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、δ病毒属(Deltavirus)、香石竹病毒组 (Dianthovirus)、耳突花叶病毒属(Enamovirus)、丝状病毒科(Filoviridae)(例如，马尔堡病毒和 埃博拉病毒(例如，Zaire株、Reston株、象牙海岸株或苏丹株)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如， 丙型肝炎病毒、登革病毒1、登革病毒2、登革病毒3和登革病毒4)、嗜肝DNA病毒科 (Hepadnaviridae)(例如，乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，人疱疹病毒1、2、 3、4、5及6和细胞巨化病毒)、减毒病毒科(Hypoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、光滑病 毒科(Leviviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)(例如，甲型和乙型流感病毒)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科 (Paramyxoviridae)(例如，麻疹病毒、腮腺炎病毒和人呼吸道合胞体病毒)、细小病毒科 (Parvoviridae)、微RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、嗜肝病毒和 口蹄疫病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(例如，痘苗病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状 病毒(rotavirus)、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，慢病毒属(lntivirus)，如人免疫缺陷病毒 (HIV)1和HIV2)、弹状病毒科(Rhahdoviridae)和整体病毒科(Totiviridae)。在一个实施方案中， 本发明方法的抗原是呼吸道合胞体病毒(RSV)抗原。该抗原可以是例如RSVA株或B株抗原， 如F、G、M、Ml、M2、SH或NS1或NS2蛋白的全部或部分，或不止一种这些蛋白质的全 部或部分的融合物。由腺病毒载体编码的抗原也可以是逆转录病毒抗原。逆转录病毒抗原可 以是例如，HIV抗原，如gag、env或pol蛋白的全部或部分。HIV的任何进化支适用于抗原 选择，包括进化支A、B、C、MN等。在一些实施方案中，由腺病毒载体编码的至少一种抗 原是单纯疱疹病毒2(HV-2)抗原。本发明方法的合适SARS病毒抗原包括例如UL19、UL47 或gD蛋白的全部或部分。本文中具体提到的抗原性肽仅是示例性的，因为可以在本发明的 语境中使用任何病毒蛋白。
抗原也可以是寄生虫抗原，例如，但不限于孢子虫(Sporozoan)抗原。例如，核酸序列可 以编码疟原虫(Plasmodium)抗原，如环子孢子蛋白、子孢子表面蛋白、肝期抗原、顶端膜相 关蛋白质或裂殖子表面蛋白的全部或部分。
备选或另外，由腺病毒载体编码的至少一种抗原是细菌抗原。抗原可以源自任何细菌， 包括但不限于放线菌属(Actinomyces)、鱼腥藻属(Anabaena)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属 (Bacteroides)、蛭弧菌属(Bdeilovihrio)、柄杆菌属(Caulobacter)、衣原体属(Chlamydia)、绿菌 属(Chlorobium)、染绿菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、异 常球菌属(Deinococcus)、埃西氏菌属(Escherichia)、盐杆菌属(Halobacterium)、螺旋杆菌属 (Heliobacter)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属 (Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、粘球菌属(Myxococcus)、 奈瑟菌属(Neisseria)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、颤蓝细菌属(Oscillatoria)、原绿菌属 (Prochloron)、变形菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、立 克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属、志贺氏菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、螺旋体属 (Spirochaeta)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、 硫化叶菌属(Sulfolobus)、热原体属(Thermoplasma)、硫杆菌属(Thiobacillus)和密螺旋体属 (Treponema)。在一个实施方案中，由核酸序列编码的至少一种抗原是假单胞菌(Pseudomonas) 抗原或螺旋杆菌(Heliobacter)抗原。
可以理解不需要整个、完好的病毒蛋白或细菌蛋白以产生免疫应答。实际上，大部分抗 原表位的尺寸相对小，因此蛋白质片段对暴露于哺乳动物免疫系统而言可能是足够的。此外， 可以在一种或多种抗原的两个或更多个抗原表位之间产生融合蛋白。例如，HIVgp120或 gp160的全部或部分可以与HIVpol蛋白的全部或部分融合以与由单一表位所产生的免疫应 答相比，产生针对HIV病原体的更完整的免疫应答。融合蛋白由腺病毒载体递送至哺乳动物 允许免疫系统暴露于多种抗原，并且因此使单一疫苗组合物针对多种病原体提供免疫力成为 可能。
核酸序列(包括编码抗原的核酸序列)不限于一个类型的核酸序列或任何特定起源。该核 酸序列可以是重组DNA，可以是基因组DNA，可以从潜在抗原表位的DNA文库获得，或可 以通过合成的方式产生。该核酸序列可以作为表达盒的部分存在，所述表达盒另外包含为高 效表达核酸序列和产生编码的抗原所需要的遗传元件。理想的是，编码抗原的核酸序列与如 本文所述的启动子和聚腺苷酸化序列可操作地连接。可以通过匹配启动子的活性的特定模式 与期望的抗原表达模式和水平，选择用于本发明方法中的启动子。例如，腺病毒载体可以包 含编码不同抗原并且与显示出不同表达谱的不同启动子可操作地连接的两个或更多个核酸序 列。例如，选择第一启动子以介导抗原产生的初始峰，从而引发免疫系统对抗编码的抗原。 选择第二启动子以驱动相同或不同抗原的产生，从而在第一启动子的表达峰值稍后几日出现 表达峰，因此“增强”免疫系统对抗该抗原。备选地，可以构建杂合启动子，其组合了多个启 动子的期望方面。例如，本发明方法的许多实施方案中特别优选将CMV启动子活性最初突 增和RSV启动子维持高水平活性组合在一起的CMV-RSV杂合启动子。在抗原可能对真核细 胞有毒的情况下，可能有利的是，修饰启动子以降低用来增殖腺病毒载体的互补性细胞系中 的活性。
以下实施例进一步说明本发明，但是当然不得以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例1
该实施例说明，猴腺病毒蚀斑的形成在表达人腺病毒组分E1和E4ORF6的人细胞系上 十分高效。
猴腺病毒在人细胞上复制受限，并且人腺病毒因子克服这种限制。如本文所表明的，本 发明具有两个意料之外的结果：猴腺病毒在人细胞上的生长比在含有完整E4区的那些人细胞 上的生长改进，并且与建议用于猴腺病毒生长的天然宿主细胞系相比，猴腺病毒在人细胞上 的增殖有优势。用两种方法学定义生长。使用蚀斑形成来测定在很低的感染复数(MOI)条件下 的生长，并且需要多于一个感染性循环以产生正结果，即，细胞单层中的蚀斑。因此，蚀斑 形成真实地表明病毒的连续生长：单个感染性病毒颗粒感染单个细胞，病毒生命周期的彻底 完成出现，随后病毒子代感染邻近细胞等。第二种方法评估单轮病毒复制产生的感染性病毒 子代的数目。该方法基于基本上所有单层中细胞的同步感染，称作单次裂解生长评估。
在全部E4因子中，本文表明ORF6足以在人细胞上增殖猴腺病毒。出乎意料的是，人细 胞系在支持猴腺病毒形成蚀斑(一种测量病毒生长的标准方法)的能力方面优于猴细胞系。从 恒河猴和绿长尾猴分离的两种猴腺病毒SV-11和SV-38在293-ORF6、BSC-1、 LLC-MK2(MK2)、Vero和CV-1细胞上形成蚀斑。除293-ORF6细胞系之外的其他细胞系均 源自猴。BSC-1和MK-2是由美国典型培养物保藏中心(ATCC)推荐的增殖该病毒的细胞系。 使用两种病毒的连续稀释物来感染每个细胞系，所述细胞系在60mm培养皿中达到80%汇合 度。感染条件是500μl病毒1小时，每隔15分钟振摇。随后移去病毒并且用EMEM+2%FBS 和0.9%琼脂糖覆盖细胞。14日后，对蚀斑进行计数。293-ORF6细胞产生最高的蚀斑形成效 率，十倍优于所测试的任何其他细胞系(表1)。先前曾报道，在含有来自人腺病毒2的完整 E4区的人细胞上形成蚀斑的猴病毒具有与CV-1细胞相比低40倍的蚀斑形成效率。采用本发 明时，在生长方面存在明显的400倍改善，如通过蚀斑形成活性所度量。如本文所表明的， 本发明具有两个意料之外的结果：猴腺病毒在人细胞上的生长比在含有完整E4区的那些人细 胞上的生长改进，并且与推荐用于猴腺病毒生长的天然宿主细胞系相比，猴腺病毒在人细胞 上的增殖有优势。
表1
*蚀斑形成单位
实施例2
该实施例显示在具有人腺病毒种类C因子的人细胞系代上产生高滴度的猴腺病毒子代。
进行单次裂解生长实验以确定人腺病毒E1和E4Orf6的组合是否足以克服对人细胞中猴 腺病毒复制的限制性阻断。将不表达Ad5因子(A549)、Ad5E4ORF6(A549+Ad5E4ORF6)、 Ad5E1(293)或Ad5E1和E4ORF6(293-ORF6)的人细胞以每孔1.5×106个细胞以三个重复接种 于6孔平板中。源自非洲绿猴的容许猴腺病毒复制的BSC-1细胞以每孔1×105个细胞接种。 使全部细胞在具有10%FCS的DMEM中维持并且在37℃，5%CO2下生长。次日，使细胞用 CsCl2梯度纯化的猴腺病毒原液，以每孔300μl中3个(图2A)或1个(图2B)集落形成单位(FFU)/ 细胞的MOI感染2小时，随后抽吸并且用3ml具有5%FCS和100μMZnCl2的DMEM覆盖 以允许在A549+Ad5E4ORF6和293-ORF6细胞中诱导E4ORF6表达。随后孵育细胞并且在感 染后72小时收获。通过由交替暴露于由干冰和37℃水浴组成的3次冻融循环，使病毒颗粒 从细胞释放。用Vaccine,25:2074-2084(2007)中描述的FFU测定法，评估病毒-细胞裂解物中 子代病毒粒子的数目。
与A549和表达Ad5E4ORF6的A549细胞相比(图2A)，用猴腺病毒在人细胞系上产生 感染性子代在采用293-ORF6细胞时最高。类似地，以MOT为1在293-ORF6细胞上产生病 毒子代至少与在猴细胞系BSC-1上一样高效(图2B)。在一些情况下，与BSC-1细胞相比，从 293-ORF6细胞产生10至1,000倍更多的病毒子代。相反，猴腺病毒在293细胞上复制比在 BSC-1细胞上复制的效率低。因此，E1和E4ORF6的存在克服了人细胞中的宿主复制阻断。 这用SV-1得到进一步证实，当在293-ORF6细胞上生长时，所述SV-1在纯化后产生90,090 个颗粒/细胞。最后，感染性子代在293-ORF6细胞上的产生比在BSC-1细胞上的产生高多达 1,000倍，从而表明猴腺病毒在表达E1和E4ORF6的人细胞上的生长显著地大于建议用于猴 腺病毒生长的天然宿主细胞系上的生长。
总之，猴腺病毒的蚀斑形成效率分析和单次裂解生长分析表明，猴腺病毒可以在 293-ORF6细胞中高效复制，并且人腺病毒组分(Ad5E1和E4ORF6)的组合表达克服了人复制 阻断。另外，用8种猴腺病毒(相当大的该组代表)证明了这一点。
实施例3
该实施例显示在具有人腺病毒组分的人细胞系上构建和增殖带有E1缺失的猴腺病毒载 体。
已将来自3个不同物种(绿长尾猴、食蟹猴和恒河猴)的7种不同猴腺病毒的E1区替换为 表达盒。本文所用的猴腺病毒是来自ATCC的SV-1、SV-7、SV-11、SV-16、SV-18、SV-38 和SV-39。为有助于左ITR至E1a启动子的克隆，测定pIX启动子区和紧邻野生型病毒右ITR 的序列。设计E1缺失以使E1a启动子和E1蛋白失活，但是保留pIX病毒启动子、病毒包装 信号和复制起点。这些序列的同一性通过它们与已知腺病毒基因组的同源性确定，并且可以 使用可公开获得的软件(例如在伯克利果蝇基因组计划、国家中心生物技术信息和蛋白质分析 专家系统处找得到的软件)鉴定。通常，E1缺失始于E1a启动子TATA框的5′的50碱基对(bp) 内并且终于pIX启动子的5′的50至300bp。这些仅是其中可以产生缺失的实例，因为可以根 据病毒载体的用途改变缺失。例如，对于源自SV-38的载体，E1缺失保留E1a启动子的大部 分，表明为了构建体腺病毒载体，不需要完全移除E1a启动子。
虽然存在构建此类病毒的多种方式，但是它基本上包括两个步骤。在细菌中产生期望的 病毒载体基因组，随后将所述基因组转染入293-ORF6细胞以产生病毒颗粒。
图3中概括出在细菌中产生病毒载体基因组的一般方法或该方法的较小变形。使用本领 域已知的标准分子生物学技术，构建穿梭质粒，其包含病毒ITR(点画框)、包装信号(Ψ)、替 换E1区的表达盒和pIX序列，此后是病毒右ITR。这个实施例中的表达盒由CMV启动子(箭 头)、开放阅读框(orf)和SV40多腺苷酸化信号(SV)组成。表达盒的方向和组成是说明性的并 且不意在限定。该质粒优选地含有低拷贝数细菌复制起点如p15，不过也可以使用其他复制 起点。纳入提供对抗生素的耐药性(如卡那霉素耐药性(Kanr))的基因例如可用于选择携带该质 粒的细菌。为构建腺病毒载体基因组，通过同源重组将病毒基因组从pIX至右ITR的剩余部 分克隆至穿梭质粒中。为实现这种克隆，将重组感受态细菌如BJ5183用约50ng以核酸内切 酶在pIX和右ITR之间限制性消化的穿梭质粒和100ng纯化的病毒基因组同时转化。优选在 穿梭质粒和用于重组的病毒基因组(X)的每个pIX和右ITR之间具有至少50bp的同源性。存 在本领域已知的众多方法来鉴定具有克隆的腺病毒载体基因组的细菌，包括限制性消化法、 聚合酶链反应(PCR)和DNA测序。病毒六邻体基因的测序例如可以用来进一步证实腺病毒的 身份。使用与以下六邻体序列的同源性来进一步证实腺病毒及其衍生物的身份：SV-1(SEQID NO:22)；SV-7(SEQIDNO:23)；SV-11(SEQIDNO:24)；SV-16(SEQIDNO:25)；SV-18(SEQID NO:26)；SV-38(SEQIDNO:27)；SV-39(SEQIDNO:28)。一旦已经鉴定到病毒载体基因组， 则使用质粒转化从其中扩增和纯化该质粒的RecA-细菌菌株，如DH10B。
其次，如下实施第二步骤，从基因组质粒转化(拯救)出感染性病毒。用限制性酶消化基因组质粒以从质粒骨架释放两个ITR，由苯酚:氯仿:异戊醇提取和乙醇沉淀法纯化，并且重悬于10mMTris，1mMEDTA(pH8.0)中。随后采用Polyfect试剂(Qiagen)，以5μg消化的质粒转染293-ORF6细胞系，约1.5×106个细胞/60mm平板。转染后5日，收获细胞，经历3次冻融循环，并且使细胞裂解物在新鲜的细胞上传代。使细胞-病毒裂解物以这种方式以3至5日间隔连续传代直至观察到充分的细胞病变效应(c.p.e)。如在GallJG等，Rescueandproductionofvaccineandtherapeuticadenovirusvectorsexpressinginhibitorytransgenes.MolBiotechnol.35(3):263-73(2007),PubMedPMID:37652790中所描述的，从感染的细胞产生纯化的腺病毒原液。简而言之，收集感染的细胞并且弃去培养基。将细胞在25mMTris(pH7.5)、75mMNaCl、5mMMgCl2的缓冲液中通过3次冻融循环裂解并且用Benzonase以100单位/mL在室温下处理过夜。进行氯化铯等密度梯度离心并且如Mittereder,N.等,Evaluationoftheconcentrationandbioactivityofadenovirusvectorsforgenetherapy.J.Virol.70:7498-7509(1996)中所描述的，通过在260nm处的吸光度确定总粒子单位滴度。如在GallJG等Rescueandproductionofvaccineandtherapeuticadenovirusvectorsexpressinginhibitorytransgenes.MolBiotechnol.35(3):263-73(2007),PubMedPMID:37652790；和LemialeF等,Noveladenovirusvaccinevectorsbasedontheenteric-tropicserotype41.Vaccine25(11):2074-84(2007),2006年11月28电子出版.PubMedPMID:17250935,PubMedCentralPMCID:PMC2584667中所描述的，在用Ad2六邻体抗体的荧光聚焦单位(FFU)测定法中确定活性粒子滴度。病毒制备物具有高品质，总颗粒与感染性颗粒平均比是49+/-23(n=6)，并且产率高，纯化后每个细胞多达37,000个颗粒。通过部分DNA测序和诊断性PCR证实每种病毒的身份。通过蛋白质印迹分析证实表达盒的功能性。
以下显示了用来产生本文所述的和图3中的拯救穿梭质粒的病毒序列的身份。全部序列 以标准病毒基因组从左至右的方向给出。在标准病毒基因组中，E1区位于病毒基因组的左侧。 包含左侧ITR、包装信号但是缺少完整E1a启动子的序列称作“左侧序列”。pIX区中用于同源 重组的序列称作“pIX区序列”。由用于同源重组的右ITR的部分组成的序列称作“右侧序列”。 全部序列以标准的5′至3′方向给出。
SV-1：左侧序列：(SEQIDNO:1)；pIX区序列：(SEQIDNO:2)；右侧序列：(SEQIDNO:3)。
SV-7:左侧序列：(SEQIDNO:4)；pIX区序列：(SEQIDNO:5)；右侧序列：(SEQIDNO:6)。
SV-11：左侧序列：(SEQIDNO:7)；pIX区序列：(SEQIDNO:8)；右侧序列：(SEQIDNO:9)。
SV-16：左侧序列：(SEQIDNO:10)；pIX区序列：(SEQIDNO:11)；右侧序列：(SEQID NO:12)。
SV-18：左侧序列：(SEQIDNO:13)；pIX区序列：(SEQIDNO:14)；右侧序列：(SEQID NO:15)。
SV-38:左侧序列：(SEQIDNO:16)；pIX区序列：(SEQIDNO:17)；右侧序列：(SEQID NO:18)。
SV-39:左侧序列：(SEQIDNO:19)；pIX区序列：(SEQIDNO:20)；右侧序列：(SEQID NO:21)。
实施例4
该实施例显示缺失E1区序列的猴腺病毒是复制缺陷型的。
将E1-缺失如实施例3中所描述的那样工程化至猴腺病毒SAV7、SAV11和SAV16中。 设计E1-缺失以移去E1A的启动子、全部E1A编码区、E1B启动子、E1B21K蛋白质同源物 编码区、E1B55K同源物编码区5′末端的大部分。另外，将如在实施例3和GallJG等Rescue andproductionofvaccineandtherapeuticadenovirusvectorsexpressinginhibitorytransgenes.Mol Biotechnol.35(3):263-73(2007),PubMedPMID:17652790中所描述的没有所编码蛋白质产物 的表达盒插入E1缺失的位置内。为确定这些序列的移除是否改变病毒的复制，用所述病毒感 染猴细胞并且测量感染性病毒子代。使用两个猴源细胞系，并且它们被供应商(ATCC)推荐用 于增殖猴腺病毒。LC-MK2细胞系是来自恒河猴(Macacamullata)的肾细胞系，并且BSC-1细 胞系是来自非洲绿猴(Cercopithectisaethiops)的肾细胞系。用每种E1缺失型和野生型腺病毒 的100个颗粒/细胞感染以6孔平板每孔3×105个细胞接种的所述细胞系的贴壁培养物。感染 后72和96小时(hpi)，收集细胞和培养基并且进行3次冻融循环(在干冰上冷冻约10分钟， 在37℃水浴中融化约10分钟)以裂解细胞。在如在GallJG等,Rescueandproductionof vaccineandtherapeuticadenovirusvectorsexpressinginhibitorytransgenes.MolBiotechnol. 35(3):263-73(2007),PubMedPMID:37652790.；和LemialeF等,Noveladenovirusvaccine vectorsbasedontheenteric-tropicserotype41.Vaccine25(11):2074-84(2007),2006年11月28 电子出版.PubMedPMID:17250935,PubMedCentralPMCID:PMC2584667中所描述的荧光聚 焦单位(FFU)测定法中测定细胞裂解物的感染性病毒。在产生自用野生型病毒感染的细胞的裂 解物中存在高滴度的病毒子代(表2)；因此该细胞培养物是可容许猴腺病毒的。重要的是，采 用25,32525,875FFU/mL(每个显微镜视野最少5个转化灶，每个细胞培养物孔1013个视野， 并且裂解物未稀释)的测定定量限，没有在来自用E1缺失型猴腺病毒感染的细胞的裂解物中 检测到子代病毒粒子。比较用每种血清型的野生型病毒所实现的最大滴度与所述定量限，显 示了SAV7的复制减少至少19,348倍；SAV11的复制减少至少10,266倍；并且SAV16的复 制减少至少5,133倍。此外，进一步降低分析限至检测限5FFU/mL时，没有在用来自无效病 毒感染中的裂解物所感染的孔内观察到转化灶。比较以每种血清型的野生型病毒所实现的最 大滴度与所述检测限，确立了SAV7、SAV11和SAV16的复制分别减少9.8×107倍、5.2×107倍和2.6×107倍。因此，具有E1缺失的猴腺病毒是复制缺陷型的。
表2：病毒子代的产生(FFU/mL).
*n.d.=未进行
本文中引用的全部参考文献，包括出版物、专利申请及专利，通过引用的方式并入，其 程度如同每一份参考文献被单独且明确地指明以通过引用的方式并入并且在本文中被完整地 描述。
术语“一个”和“一种”和“该”和相似指称在描述本发明的语境中(尤其在以下权利要求的语 境中)的使用解释为涵盖单数和复数，除非本文另外说明或明显与语境矛盾。术语“包含”、“具 有”、“包括”和“含有”将解释为是开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另外指出。 本文中对值范围的描述仅意在作为单独指称落入该范围内的每个独立值的简化方法，除非本 文中另外说明，并且将每个独立值如同本文中单独提到的那样并入本说明书中。本文所述的 全部方法可以按任何合适的顺序进行，除非本文另外说明或除非明显与语境矛盾。本文中提 供的任何和全部实施例或示例性语言(例如，“如”)的用途仅意在更好地说明本发明而不是对本 发明的范围加以限制，除非另外声明。本说明书中的语言均不应解释为表明未要求保护的任 何要素是实施本发明必需的。
本文中描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。 根据阅读前述描述，那些优选实施方案的变化对本领域普通技术可能变得显而易见。发明人 希望技术人员视情况采用此类变化，并且发明人希望本发明不仅仅如本文所具体所描述的那 样实施。因此，本发明包括适用法律所允许的在本文所附权利要求中所述主题的全部修改和 等同物。另外，本发明包括全部可能变化中上述要素的任何组合，除非本文另外说明或另外 与语境明显矛盾。