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1、(10)授权公告号 CN 102888460 B (45)授权公告日 2013.10.23 CN 102888460 B *CN102888460B* (21)申请号 201210387026.7 (22)申请日 2012.10.12 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/14(2006.01) (73)专利权人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市学府路 301 号 (72)发明人 邵世和 侯艳娇 罗欲承 邵晨 管贤伟 丁杰 唐国建 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 CN 102660645 A,2012.09.12, 全文 . CN 。
2、102409103 A,2012.04.11, 权利要求 1. A Zbinden et al.recA-Based PCR Assay for accurate differentiation of Streptococcus pneumoniae from other viridans streptococci. Journal of clinical microbiology .2011, 第 49 卷 ( 第 2 期 ), 摘要、 523 页左栏倒数第 1 段至右栏第 1 段、 右栏倒数第 1 段 . 罗欲承等 . 多重降落 PCR 检测痰标本肺炎链 球菌与 b 型流感嗜血杆菌 .江苏。
3、大学学报 （医学 版） .2012, 第 22 卷 ( 第 3 期 ),251-254. (54) 发明名称 肺炎链球菌多重降落 PCR 检测试剂盒及检测 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种肺炎链球菌多重降落 PCR 检 测试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括 ： 10PCR 缓冲液， MgCl2， dNTP，TaqDNA 聚合酶， BSA， 肺炎链 球菌阳性对照 DNA， 序列如 SEQIDNO.1-6 所示的 3 对肺炎链球菌引物。本发明设计了 3 对肺炎链球 菌的特异性引物， 并建立了可检测肺炎链球菌的 多重降落 PCR 检测试剂盒及检测方法， 采用琼脂 糖凝胶电泳检测 PCR 产物。本发。
4、明建立的多重降 落 PCR 检测试剂盒及检测方法快速、 简便、 特异、 灵敏， 可用于肺炎链球菌感染的快速诊断与流行 病学调查。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高欣 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102888460 B CN 102888460 B *CN102888460B* 1/1 页 2 1. 一种肺炎链球菌多重降落 PCR 检测试剂盒， 包括 ： 10PCR 缓冲液， MgCl2， dNTP， Taq。
5、 DNA 聚合酶， BSA， 肺炎链球菌阳性对照 DNA， 3 对肺炎链球菌引物 ； 所述 3 对肺炎链球引物 为 ： SP_recA-F ： 5 - CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3 SP_recA-R ： 5 -CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3 SP_ply-F ： 5 - GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3 SP_ply-R ： 5 - AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3 SP_16S rRNA-F ： 5 - CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3 SP_16S rRNA-R ： 5 - CTAGCACTCATCGTTTA。
6、CA -3 。 权 利 要 求 书 CN 102888460 B 2 1/5 页 3 肺炎链球菌多重降落 PCR 检测试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及肺炎链球菌感染的分子诊断技术领域， 具体涉及多重降落 PCR 检测方 法在下呼吸道标本中肺炎链球菌 （Streptococcus pneumoniae） 检测中的应用。 背景技术 0002 肺炎链球菌又名肺炎球菌， 是社区获得性肺炎 （CAP） 的主要病原体， 培养要求较 高。 易发生肺炎链球菌肺部感染的高危人群有 ： 免疫缺陷者、 呼吸道病毒感染后、 婴幼儿、 年 老体弱者。肺炎链球菌是慢性阻塞性肺疾病 （COPD） 患者发生 。
7、CAP 的主要病因， 此外肺炎链 球菌还可引起脑膜炎、 中耳炎及脓毒血症等疾病。 0003 Corless, C.E 等 （Corless, C.E., et al., Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol, 2001. 39(4): p. 1553-8.） 。
8、建立了以ply基因为靶标检测肺炎链球菌的实时 PCR， 支持ply基因为肺炎链球菌所固有。 Murdoch, D.R报道了以ply基因为靶标建立的PCR 可将部分甲型溶血性链球菌误鉴定为肺炎链球菌 （Murdoch, D.R., Molecular genetic methods in the diagnosis of lower respiratory tract infections. APMIS, 2004. 112(11-12): p. 713-27.） 同时针对肺炎链球菌的多个基因进行检测可提高检测方法的特 异性。 Korbie, D.J.等 （Korbie, D.J. and J.。
9、S. Mattick, Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3(9): p. 1452-1456.） 发现降落 PCR 可提高 PCR 的特异性与灵敏度。当前尚无同时针对肺炎链 球菌recA、ply、16S rRNA基因以检测肺炎链球菌的多重 PCR 报道。本发明建立的多重降落 PCR 可直接检测下呼吸道标本中的肺炎链球菌， 费时少， 具高度特异性与灵敏性， 有利于肺 炎链球菌感染的快速诊断与流行病学调查。 发明内容 0004 本发。
10、明要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测下呼吸道标本中肺炎链球 菌的多重 PCR 检测试剂盒及检测方法。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明是通过以下技术发案实现的 ： 0006 一种肺炎链球菌多重降落 PCR 检测试剂盒， 包括 ： 10PCR 缓冲液， MgCl2， dNTP， Taq DNA 聚合酶， BSA， 肺炎链球菌阳性对照 DNA， 3 对肺炎链球菌引物 ； 0007 所述 3 对肺炎链球菌引物对序列如下 ： 0008 第 1 对 ： 0009 SP_recA-F ： 5 - CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3 （SEQ ID NO.1） 0010 SP_。
11、recA-R ： 5 - CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3 （SEQ ID NO.2） ； 0011 第 2 对 ： 0012 SP_ply-F ： 5 - GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3 （SEQ ID NO.3） 说 明 书 CN 102888460 B 3 2/5 页 4 0013 SP_ply-R ： 5 - AGCAGCCTCTACTTCATCACT -3 （SEQ ID NO.4） ； 0014 第 3 对 ： 0015 SP_16S rRNA-F ： 5 - CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3 （SEQ ID NO.5） 0016 SP_。
12、16S rRNA-F: 5 - CTAGCACTCATCGTTTACA -3 （SEQ ID NO.6） 。 0017 本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法 ： 0018 （一） 提取待检样本 DNA 0019 （二） 多重降落 PCR 法扩增检测待检样本 DNA 中的recA、ply、16S rRNA基因， 具体 步骤如下 ： 0020 反应体系 ： 25 l 0021 H2O 9.05 l 0022 缓冲液 （10PCR） 2.5 l 0023 BSA(10 mg/ml) 0.25 l 0024 SP_recA-F（10 mol/L） 3 l 0025 SP_recA-R（10 mol/。
13、L） 3l 0026 SP_ply-F（10 mol/L） 0.25 l 0027 SP_ply-R（10 mol/L） 0.25 l 0028 SP_16S rRNA-F（10 mol/L） 0.5l 0029 SP_16S rRNA-R（10 mol/L） 0.5 l 0030 MgCl2(25 mM) 3l 0031 dNTP(10 mM) 0.5 l 0032 Taq DNA 聚合酶 （5 U/l） 0.2 l 0033 DNA 模板 2 l 0034 3 对肺炎链球菌引物为 ： 0035 SP_recA-F ： 5 - CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3 （SEQ I。
14、D NO.1） 0036 SP_recA-R ： 5 - CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3 （SEQ ID NO.2） 0037 SP_ply-F ： 5 - GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3 （SEQ ID NO.3） 0038 SP_ply-R ： 5 - AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3 （SEQ ID NO.4） 0039 SP_16S rRNA-F ： 5 - CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3 （SEQ ID NO.5） 0040 SP_16S rRNA-R ： 5 - CTAGCACTCATCGTTTACA -3 （SEQ I。
15、D NO.6） 0041 （三） PCR 反应循环参数如下 ： 0042 94 5 min ； 94 30s, 65 ( 每循环降低 0.5 ) 30 s, 72 1 min， 20 个循环 ； 94 30s, 55 30s,72 1 min,20 个循环 ； 72 7 min ； 0043 （四） 电泳检测鉴定 ： 0044 对多重降落 PCR 反应产物进行琼脂糖电泳检测， 如电泳图中含有 217 bp、 581 bp、 735 bp 条带中的 2 条或 3 条则代表检出肺炎链球菌。 0045 有益效果 ： 本发明所建立的多重降落 PCR 可克服常规培养的耗时长、 灵敏度低等 问题， 具有快。
16、速、 简便、 特异、 灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告， 可同时检测肺炎 链球菌的 3 个基因， 对肺炎链球菌 DNA 的检测下限达 5 pg。该多重降落 PCR 可用于肺炎链 球菌感染的快速诊断与流行病学调查。 说 明 书 CN 102888460 B 4 3/5 页 5 附图说明 0046 图 1 为实施例 1 的检测结果 ； 泳道 1 13 模板依次对应为 ： 大肠埃希氏 菌 （Escherichia coli） 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus） 、 铜 绿 假 单 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa） 、 肺炎克雷。
17、伯菌 （Klebsiella pneumoniae） 、 鲍曼不动杆菌 （Acinetobacter baumannii） 、 卡它莫拉菌 （Moraxella (Branhamella) catarrhalis） 、 粪 肠球菌 （Enterococcus faecalis） 、 耻垢分枝杆菌 （Mycobacterium smegmatis） 、 流感嗜血 杆菌 （Streptococcus pneumoniae） 、 结核分枝杆菌 （Mycobacterium tuberculosis） 、 b型流 感嗜血杆菌、 牛分枝杆菌 （Mycobacterium bovis） 、 牛分枝杆菌 B。
18、CG（Mycobacterium bovis BCG） ； 泳道 M 为 ： DL2000 DNA 分子质量标准 ； 泳道 14 15 模板依次为 ： 阳性对照肺炎链球 菌 （Streptococcus pneumoniae） 与阴性对照。 0047 图 2 为实施例 2 检测结果 ； 泳道 M 为 DL2000 DNA 分子质量标准 ； 泳道 1 8 模 板为临床痰标本基因组 DNA， 泳道 4、 5 于 215 bp、 620 bp、 821 bp 处出现 3 条对应大小的条 带， 判为检出肺炎链球菌 ； 泳道 9、 10 为阳性对照与阴性对照。 0048 具体实施方式 0049 实施例 。
19、1 ： 0050 选 取 分 别 含 有大肠 埃 希 氏 菌 （Escherichia coli） 、金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus） 、 铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 、 肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae） 、 鲍 曼 不 动 杆 菌 （Acinetobacter baumannii） 、 卡 它 莫 拉 菌 （Moraxella (Branhamella) catarrhalis） 、 粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） 、 耻垢分 枝杆菌 （Mycobacteriu。
20、m smegmatis） 、 流感嗜血杆菌 （Streptococcus pneumoniae） 、 结核分 枝杆菌 （Mycobacterium tuberculosis） 、 b 型流感嗜血杆菌、 牛分枝杆菌 （Mycobacterium bovis） 、 牛分枝杆菌 BCG（Mycobacterium bovis BCG） 的痰标本， 对本发明建立的多重 PCR 体系的特异性进行验证。 0051 痰标本预处理 ： 痰标本应用生理盐水洗涤 2 次， 加入等量的 1% 胰酶 （当天现配现 用） 于 37 消化 90 min。 0052 提取痰标本中的细菌 DNA ： 取已消化的痰标本 1.5。
21、 ml 用 Takara minibest 细菌基 因组提取试剂盒 （Takara， 大连宝生） 提取痰标本中的细菌 DNA。提取的 DNA 直接用于 PCR 扩增或置于 20 保存备用。 0053 PCR扩增总体系25 l， 在200 l PCR小管内依次加入9.05l双蒸水， 2.5l缓冲 液 （10PCR） ， BSA(10 mg/ml)0.25l、 引物 SP_recA-F（10 mol/L） 3 l， SP_recA-R（10 mol/L） 3l， SP_ply-F（10 mol/L） 0.25 l， SP_ply-R ：（10 mol/L） 0.25 l， SP _16S rRNA。
22、-F （10 mol/L） 0.5l， SP _16S rRNA-R （10 mol/L） 0.5l， 3l MgCl2(25 mM)， 0.5 l dNTP(10 mM)， 0.2 l Taq DNA 聚合酶 （5U/l） ,2 l 提取的痰标本基因组 DNA。模板依次 对应为 ： 大肠埃希氏菌 （Escherichia coli） 、 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） 、 铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 、 肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae） 、 鲍 曼 不 动 杆 菌 （Acinetobacter b。
23、aumannii） 、 卡 它 莫 拉 菌 （Moraxella (Branhamella) catarrhalis） 、 粪 肠 球 菌 （Enterococcus faecalis） 、 耻 垢 分 枝 杆 菌 （Mycobacterium smegmatis） 、 流感嗜血杆菌 （Streptococcus pneumoniae） 、 结核分枝杆菌 （Mycobacterium 说 明 书 CN 102888460 B 5 4/5 页 6 tuberculosis） 、 b 型流感嗜血杆菌、 牛分枝杆菌 （Mycobacterium bovis） 、 牛分枝杆菌 BCG （Mycobac。
24、terium bovis BCG） ； 同时设肺炎链球菌阳性模板对照与阴性对照 （双蒸水作为模 板） 。手指轻弹混匀， 短暂离心后放入 PCR 仪。 0054 3 对肺炎链球菌引物为 ： SP_16S rRNA-F 和 SP_16S rRNA-R 的扩增片断长度 217 bp ； SP_ply-F 和 SP_ply-R 的扩增片断长度 581 bp ； SP_recA-F 和 SP_recA-R 扩增片断长 度 735 bp。 0055 设置PCR反应循环参数 ： 94 5min ； 94 30 s, 65 (每循环降低0.5 ) 30 s, 72 1 min， 20个循环 ； 94 30 s。
25、， 55 30 s， 72 1 min， 20 个循环 ； 72 7 min。 0056 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳， 上样量为5 l与6上样缓冲液混匀后加入胶 孔中， 于1TAE溶液中， 在100V电压下， 电泳30 min， 电泳后经1 g/l的溴化乙锭浸泡染 色 10 20 min 后， 于凝胶成像分析系统中分析检测结果。泳道 1 13 模板依次对应为 ： 大肠埃希氏菌 （Escherichia coli） 、 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） 、 铜绿假单 胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 、 肺炎克雷伯菌 （Klebsiella。
26、 pneumoniae） 、 鲍曼不动杆菌 （Acinetobacter baumannii） 、 卡它莫拉菌 （Moraxella (Branhamella) catarrhalis） 、 粪 肠球菌 （Enterococcus faecalis） 、 耻垢分枝杆菌 （Mycobacterium smegmatis） 、 流感嗜血 杆菌 （Streptococcus pneumoniae） 、 结核分枝杆菌 （Mycobacterium tuberculosis） 、 b型流 感嗜血杆菌、 牛分枝杆菌 （Mycobacterium bovis） 、 牛分枝杆菌 BCG（Mycobacteri。
27、um bovis BCG） ； 均无条带出现， 泳道 14 阳性对照于 217 bp、 581 bp、 735 bp 处出现对应大小的条带， 泳道 15 阴性对照无条带。证实本发明所建立的多重降落 PCR 体系具有特异性 （见图 1） 。 0057 实施例 2 ： 0058 痰标本预处理 ： 痰标本应用生理盐水洗涤 2 次， 加入等量的 1% 胰酶 （当天现配现 用） 于 37 消化 90 min。 0059 提取痰标本中的细菌 DNA ： 取已消化的痰标本 1.5 ml 用 Takara minibest 细菌基 因组提取试剂盒 （Takara， 大连宝生） 提取痰标本中的细菌 DNA。提取。
28、的 DNA 直接用于 PCR 扩增或置于 20 保存备用。 0060 PCR扩增总体系25 l， 在200 l PCR小管内依次加入9.05l双蒸水， 2.5l缓冲 液 （10PCR） ， BSA(10 mg/ml)0.25l、 引物 SP_recA-F（10 mol/L） 3 l， SP_recA-R（10 mol/L） 3l， SP_ply-F（10 mol/L） 0.25 l， SP_ply-R ：（10 mol/L） 0.25 l， SP _16S rRNA-F（10 mol/L） 0.5l， SP _16S rRNA-R（10 mol/L） 0.5l， 3l MgCl2(25 mM)。
29、， 0.5 l dNTP(10 mM)， 0.2 l Taq DNA 聚合酶 （5U/l） ,2 l 提取的痰标本基因组 DNA。同时 设肺炎链球菌阳性模板对照与阴性对照 （双蒸水作为模板） 。手指轻弹混匀， 短暂离心后放 入 PCR 仪。 0061 3 对肺炎链球菌引物为 ： SP_16S rRNA-F 和 SP_16S rRNA-R 的扩增片断长度 217 bp ； SP_ply-F 和 SP_ply-R 的扩增片断长度 581 bp ； SP_recA-F 和 SP_recA-R 扩增片断长 度 735 bp。 0062 设置PCR反应循环参数 ： 94 5min ； 94 30 s, 。
30、65 (每循环降低0.5 ) 30 s, 72 1 min， 20个循环 ； 94 30 s， 55 30 s， 72 1 min， 20 个循环 ； 72 7 min。 说 明 书 CN 102888460 B 6 5/5 页 7 0063 扩增产物进行 2% 琼脂糖凝胶电泳， 上样量为 5 l 与 6 上样缓冲液混匀后加入 胶孔中， 于1TAE溶液中， 在100V电压下， 电泳30 min， 电泳后经1 g/l的溴化乙锭浸泡 染色 10 20 min 后， 于凝胶成像分析系统中分析检测结果。如阴性对照无条带， 阳性对照 于 217 bp、 581 bp、 735 bp 处出现对应大小的条带。
31、， 检测样本出现 217 bp、 581 bp、 735 bp 条带中的 2 条或 3 条则代表检出肺炎链球菌 （见图 2） ； 如阳性对照于 217 bp、 581 bp、 735 bp 处未出现对应大小的条带或阴性对照出现非特异性条带， 则判为实验失败， 需重新检测。 说 明 书 CN 102888460 B 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 江苏大学 肺炎链球菌多重降落 PCR 检测试剂盒及检测方法 6 PatentIn version 3.3 1 22 DNA 人工序列 1 caagcggaac ttcttcattc ac 22 2 20 DNA 人工序列 2 cagactcagg agagcaaggt 20 3 20 DNA 人工序列 3 gcctctatcc tggagcactt 20 序 列 表 CN 102888460 B 8 2/2 页 9 4 21 DNA 人工序列 4 agcagcctct acttcatcac t 21 5 20 DNA 人工序列 5 ctgtggctta accatagtag 20 6 19 DNA 人工序列 6 ctagcactca tcgtttaca 19 序 列 表 CN 102888460 B 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102888460 B 10 。