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1、(10)申请公布号 CN 102382829 A (43)申请公布日 2012.03.21 CN 102382829 A *CN102382829A* (21)申请号 201110351486.X (22)申请日 2011.11.08 201110112679.X 2011.05.03 CN C12N 15/113(2010.01) C07K 14/47(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院放 射与辐射医学研究所 地址 100850 北京市海淀区太平路 27 号军 事医学科学院放射与辐射医学研究所 (72)发明人 张令强 贺福。
2、初 崔宇 何珊 邢桂春 梁超 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 FBXL15 蛋白抑制剂以及它们的应用 (57) 摘要 本发明公开了 FBXL15 蛋白抑制剂以及它们 的应用。 本发明提供的FBXL15蛋白的抑制剂为如 下 (1) 至 (6) 中的任意一种 ： (1) 序列表的序列 3 所示的单链核酸 ； (2)序列表的序列4所示的单链 核酸 ； (3) 序列表的序列 5 所示的单链核酸 ； (4) 序列表的序列 3 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所 示的单链核酸 ； (5) 序列表的序列 4 自 5 末端第 1 至 1。
3、9 位核苷酸所示的单链核酸 ； (6) 序列表的 序列 5 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所示的单链 核酸。 所述FBXL15蛋白的抑制剂可用于制备骨质 疏松动物模型。大鼠实验证实， 在骨组织中导入 FBXL15蛋白抑制剂后， 可以敲低FBXL15蛋白的编 码基因的表达量， 大鼠绝大多数骨指标明显下降， 呈现明显的骨质疏松表型。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 2 页 CN 102382845 A1/2 页 2 1. 核酸， 为如下 (1) 至 (6) 。
4、中的任意一种 ： (1) 序列表的序列 3 所示的单链核酸 ； (2) 序列表的序列 4 所示的单链核酸 ； (3) 序列表的序列 5 所示的单链核酸 ； (4) 序列表的序列 3 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所示的单链核酸 ； (5) 序列表的序列 4 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所示的单链核酸 ； (6) 序列表的序列 5 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所示的单链核酸。 2.FBXL15 蛋白的抑制剂在制备骨质疏松动物模型中的应用 ； 所述 FBXL15 蛋白是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将。
5、序列表中序列 1 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺 失和 / 或添加且具有相同功能的由序列 1 衍生的蛋白质。 3. 用于制备骨质疏松动物模型的产品， 它的活性成分为 FBXL15 蛋白的抑制剂 ； 所述 FBXL15 蛋白是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列表中序列 1 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺 失和 / 或添加且具有相同功能的由序列 1 衍生的蛋白质。 4.FBXL15 蛋白的抑制剂在降低 FBXL15 蛋白的编码基因的表达量中的应用 ； 所述 FBXL15 。
6、蛋白是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列表中序列 1 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺 失和 / 或添加且具有相同功能的由序列 1 衍生的蛋白质。 5.如权利要求2所述的应用， 或， 如权利要求3所述的产品， 或， 如权利要求4所述的应 用， 其特征在于 ： 所述 FBXL15 蛋白的抑制剂为权利要求 1 所述的核酸。 6. 如权利要求 2 所述的应用， 或， 如权利要求 3 所述的产品， 其特征在于 ： 所述骨质疏 松动物模型的骨小梁密度、 骨小梁相对骨量， 骨小梁数量和骨小梁厚度中的至少一种低。
7、于 所述骨质疏松动物模型的出发动物。 7. 如权利要求 2 所述的应用， 或， 如权利要求 3 所述的产品， 其特征在于 ： 所述动物为 大鼠。 8. 如权利要求 2 至 7 中任一所述的应用或产品， 其特征在于 ： 所述 FBXL15 蛋白的编码 基因是如下 (1) 或 (2) 或 (3) 所述的 DNA 分子 ： (1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ； (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子 ； (3) 与 (1) 限定的 DNA 序列至少具有 90以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA 分子。 9.FBXL15 蛋白或其编码基。
8、因在参与大鼠体内骨稳态平衡中的应用 ； 所述 FBXL15 蛋白是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列表中序列 1 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺 权 利 要 求 书 CN 102382829 A CN 102382845 A2/2 页 3 失和 / 或添加且具有相同功能的由序列 1 衍生的蛋白质。 10.如权利要求9所述的应用， 其特征在于 ： 所述FBXL15蛋白的编码基因是如下(1)或 (2) 或 (3) 所述的 DNA 分子 ： (1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ； (2)在。
9、严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子 ； (3) 与 (1) 限定的 DNA 序列至少具有 90以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA 分子。 权 利 要 求 书 CN 102382829 A CN 102382845 A1/6 页 4 FBXL15 蛋白抑制剂以及它们的应用 技术领域 0001 本发明涉及 FBXL15 蛋白抑制剂以及它们的应用。 背景技术 0002 蛋白质是构成生命体内细胞和组织的基本物质， 几乎所有的蛋白质都处在不断合 成与降解的动态平衡之中。与蛋白质的合成相比， 蛋白质的降解同样重要， 机体内短寿命 的、 错误折叠的以及机体自。
10、身不需要的蛋白都需要通过降解途径来清除。其中泛素 - 蛋白 酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System， UPS)就是真核生物体内普遍存在的具有高度选 择性的蛋白质降解系统， 主要由蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。该系统的生 物学功能非常广泛， 参与调控细胞内几乎各个方面的生命活动， 其异常与炎症、 癌症及神经 退行性疾病等密切相关。 0003 泛素化修饰通过由泛素激活酶 (ubiquitin activating enzyme， E1)、 泛素结合 酶 (ubiquitin conjugating enzyme， E2) 和泛素连接酶 (ubiquitin-pr。
11、otein ligase， E3) 参与介导的酶促级联反应完成， 最后经蛋白酶体降解。其中 E3 决定底物识别的特异性， 是 蛋白质泛素化领域的研究热点。E3 可以分为两大类 ： 含有 RING(really interesting new gene) 锌指结构和 HECT(homologous to E6AP C-terminus) 结构域的 E3( 图 1)。 0004 RING类E3中的大多数是基于Cullins蛋白的多亚基复合体， 其中基于Cullinl所 形成的 SCF(Skpl-Cullinl-F-box) 复合体是研究最多、 最深入的 RING 类 E3 复合体。它以 支架蛋白 。
12、Cullin1 为中心， C 端结合 RING 锌指蛋白 Roc1， N 端结合接头蛋白 Skp1， Skp1 又 进一步募集不同的 F-box 蛋白， F-box 蛋白担当底物识别亚基的角色， 这样 SCF 复合体就利 用不同的 F-box 蛋白形成不同复合体， 从而结合不同的底物， 在细胞周期调控、 细胞生长及 肿瘤发生等多种生物学过程中发挥着重要作用。F-box 蛋白是一个大的蛋白家族， 其家族 成员数量在不同的物种中差别很大， 酵母中约有 20 种， 果蝇中有 27 种， 而在人中则有 69 个 成员。人中的 F-box 蛋白家族根据其 C 端所含结构域的不同， 可以分为三类 ： 含有。
13、 WD40 结 构域的 FBXW 亚家族， 含有 LRR 区的 FBXL 亚家族， 以及含有其它结构域的统称为 FBXO 亚家 族， 它们分别通过 WD40、 LRR 及其它结构域与底物蛋白发生相互作用， 介导 SCF 复合体对底 物的识别及泛素化修饰。 发明内容 0005 本发明的目的是提供 FBXL15 蛋白抑制剂以及它们的应用。 0006 本发明提供了一种核酸 (FBXL15 蛋白抑制剂 )， 为如下 (1) 至 (6) 中的任意一种 ： 0007 (1) 序列表的序列 3 所示的单链核酸 ； 0008 (2) 序列表的序列 4 所示的单链核酸 ； 0009 (3) 序列表的序列 5 所。
14、示的单链核酸 ； 0010 (4) 序列表的序列 3 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所示的单链核酸 ； 0011 (5) 序列表的序列 4 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所示的单链核酸 ； 说 明 书 CN 102382829 A CN 102382845 A2/6 页 5 0012 (6) 序列表的序列 5 自 5 末端第 1 至 19 位核苷酸所示的单链核酸。 0013 本发明还保护 FBXL15 蛋白的抑制剂在制备骨质疏松动物模型中的应用 ； 0014 所述 FBXL15 蛋白是如下 (a) 或 (b) ： 0015 (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白。
15、质 ； 0016 (b) 将序列表中序列 1 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有相同功能的由序列 1 衍生的蛋白质。 0017 本发明还保护一种用于制备骨质疏松动物模型的产品， 它的活性成分为所述 FBXL15 蛋白的抑制剂。 0018 本发明还保护所述FBXL15蛋白的抑制剂在降低所述FBXL15蛋白的编码基因的表 达量中的应用。 0019 以上任一所述 FBXL15 蛋白的抑制剂均可为所述核酸中的任意一种。 0020 以上任一所述骨质疏松动物模型的骨小梁密度 (BMD)、 骨小梁相对骨量 (BV/TV)， 骨小梁数量 (Tb.N) 和骨小梁厚度。
16、 (Tb.Th) 中的至少一种低于所述骨质疏松动物模型的出 发动物。 0021 以上任一所述动物具体可为大鼠， 如 SD 大鼠。 0022 所述 FBXL15 蛋白的编码基因可为如下 (1) 或 (2) 或 (3) 所述的 DNA 分子 ： 0023 (1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ； 0024 (2) 在严格条件下与 (1) 限定的 DNA 序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的 DNA 分子 ； 0025 (3) 与 (1) 限定的 DNA 序列至少具有 90以上同源性且编码具有相同功能的蛋白 的 DNA 分子。 0026 本发明还保护所述FBXL15蛋白或所述FBXL15蛋白。
17、的编码基因在参与大鼠体内骨 稳态平衡中的应用。 0027 大鼠实验证实， 在骨组织中导入所述FBXL15蛋白抑制剂后， 可以敲低FBXL15蛋白 的编码基因的表达量， 大鼠绝大多数骨指标明显下降， 呈现明显的骨质疏松表型。 附图说明 0028 图 1 为 E3 泛素连接酶的组成类型 ； 根据结构组成及泛素转移方式的不同， E3 可分 为单体 RING 类 E3， HECT 类 E3 和多亚基 RING 类 E3。 0029 图 2 为 FBXL15 蛋白的结构域组成示意图。 0030 图 3 为小鼠 FBXL15 基因的组织表达谱。 0031 图 4 为各个实验组经过相应处理后， 细胞内 FB。
18、XL15 基因 mRNA 的相对水平。 0032 图 5 为大鼠胫骨骨小梁 MicroCT 参数分析 ； * 表示 P 0.05 ； BMD 的单位为 “mg/ ccm” ， BV/TV 的单位为 “” ， Tb.Th 的单位为 “mm” ， Tb.N 的单位为 “1/mm” ， Tb.sp 的单位为 “mm” 。 0033 图 6 为大鼠胫骨骨小梁 MicroCT 三维重建图像。 具体实施方式 0034 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 说 明 书 CN 102382829 A CN 102382845 A3/6 页 6 方法， 如无特殊说明， 均为常。
19、规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 0035 SD 大鼠 ( 健康 6 月龄雌性 Sprague-Dawley 大鼠 ) ： 购自军事医学科学院实验动物 中心。UMR106 细胞 ( 大鼠成骨样细胞系 ) ： 购自美国标准菌种保藏中心 (ATCC)， 目录号为 CRL-1661。 0036 实施例 1、 FBXL15 蛋白的基本特征描述 0037 FBXL15蛋白由F-box结构域和6个亮氨酸富含区(LRR)所组成(结构示意图见图 2)。LRR 是一大类介导蛋白相互作用的。
20、结构域， 根据长度及序列特征可以分为 6 类， FBXL15 蛋白及 Skp2 蛋白等 F-box 蛋白属于其中的 CC(cysteine-containing) 亚类。FBXL15 蛋白 在进化上较为保守， 在果蝇、 疟蚊等无脊椎动物及鱼类、 鸟类等脊椎动物以及哺乳动物中都 存在FBXL15蛋白的同源基因， 其中哺乳动物中FBXL15蛋白高度保守， 人与其它哺乳动物的 同源性高达 95以上， 与鱼类、 鸟类的同源性在 60左右， 与无脊椎动物的进化距离较远， 只有 30左右。从 FBXL15 蛋白与其它 FBXL 亚类的蛋白的进化树关系分析， FBXL15 蛋白分 支独立于大多数 FBXL 。
21、亚类蛋白， 提示 FBXL15 蛋白的功能可能比较保守。 0038 在获得 FBXL15 抗体后， 对 FBXL15 蛋白的组织和细胞表达谱进行了分析。组织器 官来自小鼠， 分别为心、 肝、 脾、 肺、 肾、 脑、 骨、 肌肉。结果显示， 抗体可以识别鼠源 FBXL15 蛋 白， FBXL15 蛋白的组织表达谱比较广泛， 在心、 脑组织中呈高表达， 在肝、 脾、 肾、 骨、 肌肉中 表达中等， 在肺中表达很弱 ( 在各器官中的表达谱见图 3)。 0039 实施例 2、 siRNA 的设计和合成 0040 大鼠 FBXL15 蛋白如序列表的序列 1 所示， 其编码基因如序列表的序列 2 所示。 。
22、0041 设计如下三条靶向大鼠中 FBXL15 蛋白的 siRNA ： 0042 1#( 序列表的序列 3) ： 5 -CACCCUUUGUCAACCUACATT-3 ； 0043 2#( 序列表的序列 4) ： 5 -CACCCUGGAAUUUCAAAUATT-3 ； 0044 3#( 序列表的序列 5) ： 5 -GGCCAAAGCUAGUAAAGCUTT-3 。 0045 设计如下阴性对照 siRNA ： 5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 。 0046 以上各条 siRNA 由上海吉玛公司负责合成。 0047 实施例 3、 siRNA 的应用 0048 一、 siRN。
23、A 的敲低效率 0049 借助 Lipofectamine 2000 转染试剂分别将实施例 2 合成的 1#siRNA(si-1 组 )、 2#siRNA(si-2组)、 3#siRNA(si-3组)、 阴性对照siRNA(NC组)转染24孔板中的UMR106细 胞 ( 按 Lipofectamine 2000 转染试剂的说明书操作 ； 24 孔板细胞生长汇合度为 70时转 染细胞， 2l 20M siRNA与1l转染试剂混合， siRNA和细胞个数比例约为80nM siRNA ： 8104个细胞 ) ； 同时设置仅转染不含有 siRNA 的转染试剂的平行处理， 作为空白对照 (VC 组 )。。
24、 0050 转染48小时后， 收取细胞， 提取总RNA并反转录为cDNA， 以cDNA为模板， 通过实时 定量 PCR 检测 siRNA 对 FBXL15 基因的敲低效率 ( 借助 GAPDH 基因调整各组细胞至浓度 )。 0051 检测 GAPDH 基因的引物对如下 ： 0052 5 -CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3 ； 5 -CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3 。 说 明 书 CN 102382829 A CN 102382845 A4/6 页 7 0053 检测 FBXL15 基因的引物对如下 ( 靶序列约 109bp) ： 0054 5 -GCTCAGGTGGG。
25、TCCACAGA-3 ； 5 -CGTCCAACAGCCATTCG-3 。 0055 对于各组处理， 将 FBXL15 基因与 GAPDH 基因的表达量的比值作为 FBXL15 基因的 标准化表达量。 0056 以 NC 组细胞内 FBXL15 基因的标准化表达量 (FBXL15mRNA 的标准化表达量 ) 为 100， 计算其它几组细胞内 FBXL15mRNA 的相对水平 ( 相对表达量 )， 见图 4。敲低效率 1- 相对表达量。结果显示， 3 条 siRNA 的敲低效率均超过了 90， 1#siRNA 的敲低效率为 96.4， 2#siRNA的敲低效率为92.3， 3#siRNA的敲低效。
26、率为93.5， 1#siRNA敲低效率最 高。 0057 二、 FBXL15 参与体内骨稳态的调控 0058 目前已知 Smurf1 最重要的生理功能是参与调控骨平衡， Smurf1-/- 小鼠呈现年龄 依赖的骨量增加， 成骨细胞活性增强。 那么FBXL15对Smurf1的调控是否会影响骨形成呢？ 0059 特异靶向骨组织的递送系统 (BTDS) 中的脂质体的制备方法具体方法如下 ： 将脂 质体 DOTAP(Avanti America， 目录号 890890)， 脂质体 DOPE(Avanti America， 850725)， 胆 固 醇 (Chol)， DSPE-mPEG2000(Ava。
27、nti America， 880128) 和 DSPE-mPEG2000-MAL(Avanti America， 880126) 按照摩尔比 42 15 38 3 2 的比例共同溶解在氯仿中， 然后使之 挥发干缩至薄膜上， 用 10mM PBS(pH 7.4) 使之水合， 50水浴预孵育形成多室脂质体小泡 (MLV) ； 用 LipoFast 挤压器 (Lipofast， Avestin， 多伦多， 加拿大 ) 使 MLV 依次透过两层直 径 0.2m 和 0.1m 的聚碳酸酯膜 ( 分别重复 5 次 )， 形成大的单室脂质体小泡 (LUV) ； LUV 与 N 末端为乙酰半胱氨酸残基的 (D。
28、SS)6(ChinaPeptides CO.， LTD， China) 室温孵育 2h(N 末端为乙酰半胱氨酸残基的(DSS)与DSPE-PEG2000-MAL的摩尔比为31)， 然后用琼脂糖 CL-4B 柱子通过筛析色谱法去掉未结合的 (DSS)6， 得到脂质体悬液 ； 将脂质体悬液每 0.5ml 分装成一管， 与等体积的含有甘露醇的去离子水混合(甘露醇与脂质体的摩尔比为51)， 冻干机 (Labconco， Freezezone， 美国 ) 处理 48 小时。 0060 尾静脉注射前， 将 15mol 上述方法得到的脂质体与 0.5ml 含有 375g siRNA 的 DEPC 水再水合，。
29、 室温孵育 20min， 然后通过 0.22m 的滤器过滤， 然后尾静脉注射 SD 大鼠。 siRNA 利用特异靶向骨组织的递送系统 (BTDS) 传送到大鼠的骨组织。 0061 将 30 只 6 月龄大雌性 SD 大鼠随机分为 5 组， 每组 6 只 ； 利用特异靶向骨组织的递 送系统 (BTDS) 将 siRNA 传送到大鼠的骨组织， 各组大鼠每次的注射体积相同， 分组处理情 况如下 ( 各组同时处理 ) ： 0062 第一组 (si-L15 组 ) ： 借助 BTDS 将实施例 2 合成的 1#siRNA 尾静脉注射大鼠， 每 次剂量为4mg siRNA/kg大鼠 ； 注射6次， 每次间。
30、隔1周 ； 第六次注射完成后取右侧胫骨进行 MicroCT 扫描分析 ； 0063 第二组 (NC 组 ) ： 借助 BTDS 将实施例 2 合成的阴性对照 siRNA 尾静脉注射大鼠， 每次剂量为4mg siRNA/kg大鼠 ； 注射6次， 每次间隔1周 ； 第六次注射完成后取右侧胫骨进 行 MicroCT 扫描分析 ； 0064 第三组 (VC 组 ) ： 用 BTDS 尾静脉注射大鼠 ； 注射 6 次， 每次间隔 1 周 ； 第六次注射 完成后取右侧胫骨进行 MicroCT 扫描分析 ； 0065 第四组(AM组) ： 大鼠不进行任何处理 ； 与其它组同时取右侧胫骨进行MicroCT扫 。
31、说 明 书 CN 102382829 A CN 102382845 A5/6 页 8 描分析 ； 0066 第五组(BL组) ： 大鼠不进行任何处理， 实验起始时(即比其它组少饲养5周) ； 取 右侧胫骨进行 MicroCT 扫描分析。 0067 MicroCT 扫描分析采用 21m 分辨率， 选择 8 个横断面来进行， 并对核心直径约 2.2mm的骨小梁进行三维重建(viva CT40， SCANCO MEDICAL， Sigma1.2， Supports2and Threshold 190)， 并定量分析以下参数 ： 骨小梁密度 (BMD)、 骨小梁相对骨量 (BV/TV)， 骨 小梁数量。
32、 (Tb.N)， 骨小梁厚度 (Tb.Th) 和骨小梁间距 (Tb.sp)。各个参数的检测结果见表 1 和图 5。大鼠胫骨骨小梁三维重建图像见图 6。 0068 表 1 各个参数的分析结果 0069 说 明 书 CN 102382829 A CN 102382845 A6/6 页 9 0070 MicroCT 分析结果显示， 注射 1#siRNA 大鼠的骨参数， 包括骨密度、 相对骨量、 骨小 梁厚度、 骨小梁数量均比各对照组有明显的降低， 骨小梁间距没有明显的差异。MicroCT 的 三维重建也清楚的显示， 注射 1#siRNA 大鼠的骨量、 骨结构相比于对照组有明显的减弱， 呈 现骨质疏松。
33、的表型。 说 明 书 CN 102382829 A CN 102382845 A1/4 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102382829 A CN 102382845 A2/4 页 11 0003 序 列 表 CN 102382829 A CN 102382845 A3/4 页 12 0004 序 列 表 CN 102382829 A CN 102382845 A4/4 页 13 序 列 表 CN 102382829 A CN 102382845 A1/2 页 14 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102382829 A CN 102382845 A2/2 页 15 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102382829 A 。