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具抑制法呢基转化酶作用的喹唑啉酮类
    本发明关于新颖的喹唑啉酮衍生物，它的制法、含该新颖化合物的药剂组合物及这些化合物为药剂的用途以及用该化合物的治疗方法。

    基因研究已经可以确认多种基因族，其中突变可导致发生多种不同的肿瘤。一种称为ras的特殊基因族，已经在哺乳动物、鸟类、昆虫类、软体动物、植物、真菌及酵母菌中被确认。哺乳动物的ras基因族包括三种主要成员(“异构形式”)：H-ras、K-ras及N-ras基因，与蛋白质密切相关的这些ras基因编码统称为p21ras，这些p21ras蛋白质含一种蛋白质族，当其与浆膜内表面连接时可控制细胞成长，但是过度制造p21ras蛋白质或该ras基因突变因而编码突变体或致瘤形式的p21ras蛋白质，导致失控地细胞分裂，为了控制细胞成长，ras蛋白质必须连接至浆膜的内小叶，如果突变或致瘤形式的p21ras(p21ras致瘤蛋白质)变成连接至浆膜，其提供一种讯号将正常细胞转化成肿瘤细胞并促进其失控的成长，为了得到此转化可能，p21ras致瘤蛋白质前驱物必须使位于羧基末端四肽的半胱胺酸残基进行酶催化的法呢基转化，因此催化此改变的酶抑制剂(法呢基蛋白质转化酶)，将可预防膜与p21ras的连接，并阻止ras-转化的肿瘤的异常成长，因此，此项技艺中对于其中ras导致转化的肿瘤，通常接受法呢基转化酶抑制剂可以非常有效作为抗癌剂。

    因为突变或致瘤形式的ras经常在许多人类的癌症上发现，最明显地在超过50％的直肠及胰腺癌(Kohl et al.，Science，vol 260，1834-1837，1993)，法呢基转化酶抑制剂被建议可以非常有效地对抗这类型的癌症。

    EP-3,371,564揭示(1H-偶氮-1-基甲基)取代的喹啉、喹唑啉及喹噁啉衍生物可抑制血浆消除视黄酸，部分这些化合物也具有抑制从黄体素形成雄激素及/或抑制芳香酶络合物活性的能力。

    已经发现本发明的新颖化合物，其中在带有碳或氮连接的咪唑基部分的2-喹唑啉酮部分的4-位置都含有一个苯基取代基，可显示法呢基蛋白质转化酶抑制活性。

    本发明关于下式的化合物，其药学上可被接受的酸加成盐类及立体化学异构物形式，其中：虚线代表视需要选用的键；X为氧或硫；R1及R2各彼此独立地为氢、羟基、卤基、氰基、C1-6烷基、三卤甲基、

    三卤甲氧基、C2-6烯基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷

    氧基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基羰基、氨基C1-6烷氧基、单-或二

    (C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、Ar1、Ar1C1-6烷基、Ar1氧基、

    Ar1C1-6烷氧基；R3及R4各彼此独立地为氢、卤基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ar1

    氧基、C1-6烷硫基、二(C1-6烷基)氨基、三卤甲基或三卤甲氧

    基；R5为氢、卤基、C1-6烷基、卤基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰

    基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷硫

    基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基、

    C1-6烷基羰基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、单-或二(C1-6烷基)

    氨基C1-6烷基、Ar1、Ar1C1-6烷氧基C1-6烷基、或为下式的基团

                 -OR10       (a-1)，

                 -SR10       (a-2)，

                 -NR11R12    (a-3)，其中R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1、Ar1C1-6烷基、C1-6烷

    氧基羰基C1-6烷基、或式-Alk-OR13或-Alk-NR14R15的基团；

    R11为氢、C1-6烷基、Ar1或Ar1C1-6烷基；

    R12为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷氨

    基羰基、Ar1、Ar1C1-6烷基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、Ar1羰基、

    Ar1C1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、

    羟基、C1-6烷氧基、氨基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰

    基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基氨基、或式-Alk-OR13

    或-Alk-NR14R15的基团；

    其中Alk为C1-6烷二基；

    R13为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基C1-6烷基、Ar1或Ar1C1-6

    烷基；

    R14为氢、C1-6烷基、Ar1或Ar1C1-6烷基；

    R15为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1或Ar1C1-6烷基；R6为下式的基团其中R16为氢、卤基、Ar1、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基

    C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、C1-6烷氧基羰基、

    C1-6烷硫基C1-6烷基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基

    S(O)2C1-6烷基；

    R17为氢、C1-6烷基或二(C1-4烷基)氨基磺酰基；R7为氢或C1-6烷基，其条件是虚线不代表一个键；R8为氢、C1-6烷基或Ar2CH2或Het1CH2；R9为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤基；或R8及R9可一起形成一个下式的二价基团

       -CH＝CH-         (c-1)，

       -CH2-CH2-        (c-2)，

       -CH2-CH2-CH2-    (c-3)，

       -CH2-O-          (c-4)，或

       -CH2-CH2-O-      (c-5)；Ar1为苯基、或被1或2个独立地选自卤基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或

    三氟甲基的取代基取代的苯基；Ar2为苯基、或被1或2个独立地选自卤基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或

    三氟甲基的取代基取代的苯基；且Het1为吡啶基、或被1或2个独立地选自卤基、C1-6烷基、C1-6烷氧

    基或三氟甲基的取代基取代的吡啶基。

    在前述定义及下文中使用的卤基是氟、氯、溴及碘统称，C1-2烷基定义为甲基或乙基；C1-4烷基包括C1-2烷基及其含3至4个碳原子的更高碳同系基，例如丙基、丁基、1-甲基乙基、2-甲基丙基等；C1-6烷基包括C1-4烷基及其含5至6个碳原子的更高碳同系基，例如戊基、2-甲基丁基、己基、2-甲基戊基等；C2-6烯基定义为含一个双键且含2至6个碳原子的直链与支链烃基，例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等；C1-6烷二基定义为含1至6个碳原子的二价直链或支链烷二基例如亚甲基、1，2-乙二基、1，3-丙二基、1，4-丁二基、1，5-戊二基、1，6-己二基及其支链异构物，“S(O)”指亚砜且“S(O)2”指砜。

    本文所提到的酸加成盐指式(I)化合物可以形成的具有治疗活性无毒的酸加成盐形式，具有碱性的式(I)化合物可通过用适当的酸处理该碱性形式而转化成其药学上可被接受的酸加成盐，适当的酸包括例如无机酸类例如氢卤酸，例如氢氯酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等酸类；或有机酸例如醋酸、丙酸、羟基醋酸、乳酸、丙酮酸、乙二酸、丙二酸、琥珀酸(丁二酸)、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲基磺酸、乙基磺酸、苯基磺酸、对甲苯基磺酸、环己氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、巴莫酸(pamoic)等酸类。

    所称的酸加成盐也包括式(I)化合物可以形成的水合物及溶剂加成形式，此种形式为例如水合物、醇盐等。

    本文中所称的式(I)化合物的立体化学异构形式，定义式(I)化合物可具有的全部异构形式，其由相同原子通过相同顺序的键完成键结但是有无法交换的不同三度空间结构。除非另外提到或说明，化合物的化学命名包括该化合物可具有的全部可能的立体化学异构物形式的混合物，该混合物可包括该化合物碱性分子结构的全部的非对掌异构物及/或对掌异构物，式(I)化合物的全部立体化学异构形式，不论是纯的或彼此的混合物都包含在本发明的范围内。

    部分的式(I)化合物也可以其互变形式存在，此种形式虽然没有在上式中明确标示，但也包含在本发明的范围内。

    在虚线不是代表一个键的那些化合物中，在喹唑啉酮部分3-位置上的氮可以有额外的键，也就是说基团R7，在虚线代表一个键的那些化合物中，该基团R7不存在。

    当R8及R9一起形成一个式(c-4)或(c-5)的二价基团时，该二价基团中的CH2部分较宜连接至式(I)化合物的2-喹唑啉酮部分的氮原子。

    不论在本文中何时使用，“式(I)化合物”的称呼指也包括药学上可被接受的酸加成盐类及全部的立体异构形式。

    一组有价值的化合物为那些式(I)化合物其中适用下列一种或多种限制：a)R1及R2各独立地选自氢、卤基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或三卤甲  基；尤其是氢、卤基或C1-4烷基；b)R3及R4一起各独立地选自氢、卤基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或三  卤甲基；尤其是氢、卤基或C1-4烷基；c)R5为氢、羟基、卤基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、  C1-6烷氧基羰基C1-6烷基、或式-NR11R12的基团其中R11为氢或  C1-6烷基且R12为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6  烷基羰基；尤其是R5为氢、羟基、卤基或氨基；d)R6为式(b-1)或(b-2)的基团其中R16为氢或C1-6烷基且R17  为C1-6烷基；e)R7为氢或C1-6烷基，其中虚线不是代表一个键；f)R8为氢、C1-6烷基或Het1CH2；g)R9为氢。

    特别的化合物包括那些式(I)化合物其中X为氧，R1及R2各独立地选自氢、卤基或C1-4烷基；R3及R4一起各独立地选自氢、卤基或C1-4烷基；R5为氢、羟基、卤基或氨基；R6为式(b-1)或(b-2)的基团其中R16为氢或C1-4烷基且R17为C1-4烷基；R7为氢或C1-4烷基，其中虚线不是代表一个键；R8为氢、C1-4烷基或Het1CH2；且R9为氢。

    较佳的化合物为那些式(I)化合物其中X为氧，R1为3-氯基，R2为氢，R3为4-氯基，R4为氢，R5为氢、C1-2烷基、卤基或氨基；R6为式(b-1)或(b-2)的基团其中R16为氢且R17为C1-2烷基；R7为氢或C1-2烷基，其中虚线不是代表一个键；R8为氢、C1-2烷基或Het1CH2；且R9为氢。

    最佳的式(I)化合物为6-〔氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基〕-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮；及6-〔氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基〕-4-(3-氯苯基)-3，4-二氢-1，3-二甲基-2(1H)-喹唑啉酮；其立体异构形式及药学上可被接受的酸加成盐类。

    制备式(I-a)化合物代表的其中R6为式(b-1)基团的式(I)化合物，通常可通过使用式(II)的中间物将式(III)的中间物N-烷基化，其中W为适当的离去基例如氯、溴、甲基磺酰氧基或苯基磺酰氧基。反应可在反应惰性溶剂例如乙腈中进行，且视需要在适当的碱例如碳酸钠、碳酸钾或三乙胺存在下。搅拌可增进反应速率，反应适宜在室温至回流温度范围下进行。

    而且，制备式(I-a)化合物也可从式(IV)的中间物与式(V)的中间物的反应，其中Y为碳或硫，例如1，1′-羰基二咪唑。

    该反应适宜在反应惰性溶剂例如四氢呋喃中进行，且视需要在碱例如氢化钠存在下，并在室温至反应混合物的回流温度范围下进行。

    制备式(I-b-1)化合物代表的其中R6为式(b-2)基团，R5为羟基且R17为C1-6烷基的式(I)化合物，可通过使式(VI)的中间物酮与式(III-1)的中间物反应，该反应需要有适当的强碱例如丁基锂存在及在适当的溶剂例如四氢呋喃中，并在适当的硅烷衍生物例如三乙基氯硅烷存在下进行。在处理过程中将中间物硅烷衍生物水解，也可使用涉及类似于硅烷衍生物的保护基的其它步骤。

    而且，制备式(I-b-2)化合物代表的其中R6为式(b-2)基团，R5为羟基且R17为氢的式(I)化合物，可通过使式(VI)的中间物酮与式(III-2)的中间物反应，其中PG为保护基例如磺酰基的二甲氨基磺酰基，其可在加成反应后去除。该反应的进行与式(I-b-1)化合物的制备类似，随后去除保护基PG，得到式(I-b-2)化合物。

    式(I-c)化合物定义为式(I)化合物其中R7为氢且虚线不是代表一个键，可通过此项技艺中已知的氧化步骤例如在反应惰性溶剂例如二氯甲烷中用MnO2氧化，转化成式(I-d)化合物，其定义为式(I)化合物其中虚线代表一个键。

    相反地，可使用此项技艺中已知的还原步骤例如在合适的溶剂例如甲醇中用氢硼化钠处理，将(I-d)化合物转化成式(I-c)化合物。

    而且，可将式(I-c)化合物转化成式(I-c-1)化合物，用式R7-W1的试剂处理化合物(I-c)，其中W1为合适的离去基例如氯、溴、甲基磺酰氧基或苯基磺酰氧基，并使用上述的N-烷基化反应。

    使式(I-b)化合物在适当的还原条件下例如在甲酰胺存在下在醋酸中搅拌，可将式(I-b)化合物转化成式(I-e)化合物，其定义为式(I)化合物其中R6为式(b-2)基团且R5为氢。

    而且，通过使式(I-b)化合物与合适的卤化剂，如亚硫酰氯或三溴化磷反应，可将式(I-b)化合物转化成式(I-f)化合物其中R5为卤基，随后在反应惰性溶剂中用式H-NR11R12的试剂处理式(I-f)化合物，可得到式(I-g)化合物。

    在适当的溶剂例如吡啶中，使定义为式(I)化合物其中X为氧的相对应式(I-h)化合物与例如五硫化磷或Lawesson氏试剂反应，可制备定义为式(I)化合物其中X为硫的式(I-i)化合物。

    式(II-a)中间物为式(II)的一个中间物其中X为氧且R7及R8为氢，可从式(VII)中间物开始制备，该中间物(VII)其中n为2或3，可通过保护此项技艺中已知的酮成为缩酮而轻易地制备，式(VII)中间物与式(VIII)中间物在碱例如氢氧化钠存在下，在适当的溶剂例如甲醇中反应，通过在适当的催化剂例如Raney Nickel存在下将中间物(IX)氢化而如此得到的式(IX)中间物在异噁唑部分进行开环反应，随后用反应性羧酸衍生物例如三氯乙酰基氯或三氟乙酰基氯酰化，得到式(X)中间物，其在铵盐例如醋酸铵及适当的碱例如六甲基磷三酰胺(HMPT)存在下进行闭环反应。使式(X)中间物在酸性情形下随后用此项技艺中已知的还原剂例如氢硼化钠处理，得到式(XII)中间物，用适当的试剂例如甲基磺酰氧基氯或卤化剂例如POCl3或SOCl2处理式(XII)中间物，将式(XII)中间物的羟基转化成离去基W，得到式(II-a)中间物。

    使用上述N-烷基化步骤，使式(XI)中间物与R8-W1反应，其中W1为适当的离去基例如氯、溴、甲基磺酰氧基或苯基磺酰氧基，可制备定义为式(II)化合物其中X为0且R7为氢的式(II-b)中间物。随后在适当溶剂例如甲醇中用例如氢硼化钠还原，并在酸性情形下水解，得到式(XIV)中间物，用甲基磺酰氧基氯或卤化剂例如SOCl2或POCl3处理，将中间物(XIV)的羟基转化成离去基W，得到式(II-b)中间物。

    用此项技艺中已知的还原步骤，例如在反应惰性溶剂例如甲醇中，用氢硼化钠处理式(XIII)中间物，可制备定义为式(VI)中间物其中X为0且虚线不是代表一个键的式(VI-a)中间物，因而得到式(XV)中间物。用R7-W1其中W1为上述的离去基使中间物(XV)进行N-烷基化，随后在酸性情形下水解成式(VI-a)中间物。而且，在水存在下用酸例如TiCl3水解式(IX)中间物，可制备定义为式(VI)中间物其中X为0且虚线代表一个键的式(VI-b)中间物。随后用反应性羧酸衍生物例如三氯乙酰基氯酰化，得到式(XVII)中间物，其在铵盐例如醋酸铵及适当的碱例如六甲基磷三酰胺(HMPT)存在下进行闭环反应，因而得到式(VI-b)中间物。

    本发明中的式(I)化合物及部分中间物在其结构中含至少一个立体中心，此立体中心可用R或S构型代表。

    根据上述方法制备的式(I)化合物通常为对照体的外消旋混合物，其可用此项技艺中已知的解离方法将其彼此分离。式(I)化合物的外消旋混合物通过与适当的手性酸反应，可转化成相对应的非对称异构性盐的形式，随后可将该非对称异构性盐的形式分离，例如通过选择性或分步结晶法并用碱从其中释出对称异构物，将式(I)化合物的对称异构性形式分离的另一种替代方法包括使用手性固相的液体层析法。该纯立体化学异构性的形式也可衍生自适当起始物质的纯立体化学异构性的形式，其条件是反应必须以立体专一性进行。如果需要特定的立体异构物，该化合物较宜用立体专一性的制备方法合成，这些方法较宜使用对映体纯的起始物质。

    本发明提供一种方法，通过用有效量的本发明化合物，以控制细胞的不正常成长，包括变态的细胞。细胞的不正常成长指与正常规则化机制无关的细胞成长(例如丧失接触抑制)，此包括下列细胞的不正常成长：(1)表达活化的ras致癌基因的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其中ras蛋白质由于另一种原因的致癌突变而导致活化的肿瘤细胞；(3)其中发生异常ras活化的其它增殖性疾病的良性及恶性细胞。而且，文献中建议ras致癌基因不只通过在肿瘤细胞成长的直接效应而在活体内导致肿瘤细胞成长，而且也间接也就是说促进肿瘤引发的血管生成(Rak.J.et al.，Cancer Research，55，4575-4580，1995)，因此，药理学标的的突变ras致癌基因可通过抑制肿瘤引发的血管生成部分抑制活体内的固态肿瘤成长。

    本发明也提供一种抑制肿瘤成长的方法，其通过将有效剂量的本发明化合物用至需要此种治疗的患者例如哺乳动物(且特别是人类)。具体地说，本发明提供一种方法，通过用有效剂量的本发明化合物，供抑制表达活化的ras致癌基因的肿瘤成长，可以抑制的肿瘤实例包括但不限于肺癌(例如腺癌)、胰癌(例如胰腺癌例如外分泌胰腺癌)、直肠癌(例如结肠直肠癌，例如直肠腺癌及直肠腺瘤)、淋巴的造血肿瘤(例如急性淋巴白血病、B-细胞淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))、甲状腺滤泡癌、脊髓发育不良征候群(MDS)、间充质源的肿瘤(例如纤维肉瘤急横纹肌肉瘤)、黑色素癌、畸胎癌、神经母细胞癌、神经胶质癌、皮肤的良性肿瘤(例如角质棘皮瘤)、乳癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌及皮肤癌。

    本发明也提供一种方法供抑制包括良性及恶性的增殖性疾病，其中ras蛋白质由于基因的致癌突变而异常活化，也就是说ras基因本身没有被突变活化成致癌形式，该抑制是通过将有效剂量的本文所述的化合物用至需要此种治疗的患者而达成，例如，良性增殖疾病的神经纤维瘤病或其中由于突变或过度表达酪胺酸激酶致癌基因而活化ras的肿瘤，可使用本发明化合物抑制。

    因而，本发明揭示式(I)化合物作为药剂有用途，及这些式(I)化合物制造药剂供治疗一或多种上述疾病的用途。

    鉴于其有用的药理性质，本发明化合物可制成不同的药剂形式用于各用药目的。

    制备本发明的药物组合物时，将有效剂量作为活性成分的碱或酸加成盐的特定化合物，与药学上可被接受的载剂掺混成紧密混合物，该载剂可决定于所要用药的制剂形式而有多种不同的形式，这些药剂组合物需要是单位剂量的形式，特别是适于供口服、经皮或不经肠道注射用药，例如在制备口服剂量形式的组合物时，可使用任何常用的药剂介质，在口服液体制剂例如悬浮液、糖浆、酏剂及溶液的情形下，可使用例如水、二醇类、油类、醇类等；在粉剂、丸剂、胶囊、及片剂的情形下，可使用固体载剂例如淀粉类、糖类、高岭土、润滑剂、粘着剂、分解剂等，因为其在用药上的方便性，片剂及胶囊代表最适宜的口服剂量单位形式，在此情形下明显地是使用固体药剂载剂。对于不经肠道的组合物，载剂通常包括无菌的水，至少是占大部分，虽然可包括其它的组合物例如供促进溶解度。注射用的溶液可例如制成其中载剂包括食盐水、葡萄糖溶液或食盐水与葡萄糖溶液的混合物，也可制成注射用的悬浮液，在此情形下可使用适当的液体载剂、悬浮剂等。在适于供经皮用药的组合物中，载剂可视需要含穿透促进剂及/或适当的湿化剂，并视需要结合少量的任何的适当添加剂，此添加剂在皮肤上不会引起明显的恶化效应，该添加剂可促进用药至皮肤及/或有助于制备所要的组合物，这些组合物可用不同的方式用药，例如以经皮肤的贴布、点剂或软膏。特别适宜将上述的药剂组合物调制成剂量单位形式，供用药的方便性及使剂量一致，在本文说明书及权利要求书中所称的剂量单位形式指适宜作为单位剂量使用的物理独立的单位，每个单位含经计算以产生所需医疗效应的预先计量的活性成分以及所需的药剂载剂，此种剂量单位形式的实例为片剂(包括刻痕或包衣的片剂)、胶囊、丸剂、粉剂包装、糯米纸囊剂、注射用的溶液或悬浮液等，及其分离的多重剂量。

    熟悉此技术者从本文所陈述的测试结果将可很容易地决定出有效剂量，一般而言，预期的有效剂量为0.01毫克/千克至100毫克/千克体重，更适宜为0.05毫克/千克至10毫克/千克体重，适宜将所需用药的剂量在一天内的适当间隔下分成二、三、四或更多的次剂量，该次剂量可调制成单位剂量形式，例如每单位剂量形式含0.05至500毫克，且尤其是0.1至200毫克的活性成分。

    下列实例用于说明本发明。实验部分A.制备中间物

    以下“THF”指四氢呋喃，“DIPE”指二异丙醚，“DCM”指二氯甲烷，“DMF”指N，N-二甲基甲酰胺且“ACN”指乙腈。

    部分式(I)化合物的绝对立体化学构型没有经实验测定，在这些情形下先分离出的立体化学异构形式称为“A”且第二个分离出的称为“B”，没有进一步参照实际的立体化学构型。实例A.1a)  将(4-氯苯基)(4-硝基苯基)甲酮(0.0382摩尔)，1，2-乙

    二醇(90.0764摩尔)及4-甲基苯基磺酸单水合物96％(0.19摩

    尔)在甲基苯(150毫升)中的混合物在Dean Stark装置中搅拌

    及回流24小时，依序用K2CO3(10％)及水清洗混合物，有机层

    经干燥、过滤并蒸发，产物不再纯化而直接使用，得到11.42克

    (98％)的2-(4-氯苯基)-2-(4-硝基苯基)-1，3-二氧

    戊环(中间物1)。b)  依序将氢氧化钠(0.818摩尔)及3-氯苯基乙腈(0.294摩尔)

    添加至中间物(1)(0.164摩尔)在甲醇(200毫升)的溶液中，

    使混合物在室温下搅拌过夜，用水将混合物淬火并用DCM萃取，

    有机层经干燥、过滤并蒸干，使残留物从DIPE中再结晶，得到47.3

    克(70％)的3-(3-氯苯基)-5-〔2-(4-氯苯基)-1，3

    -二氧戊环-2-基〕-2，1-苯并异噁唑(中间物2)。c)  将在甲醇(200毫升)中的中间物(2)(0.0381摩尔)用Raney

    镍(15克)作为催化剂在室温及3×105Pa(3巴)压力的Parr装

    置中氢化5小时，消耗氢气后，将催化剂过滤并将过滤液蒸干，

    产物不再纯化而直接使用，得到15.7克的〔2-氨基-5-〔2-(4

    -氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-基〕苯基〕(3-氯苯基)甲酮

    (中间物3)。d)  将在DCM(400毫升)中的中间物(3)(0.098摩尔)在5-

    10℃下搅拌，在5-10℃的温度下逐滴加入三氯乙酰氯(0.12摩尔)

    历时15分钟，在5-10℃的温度下逐滴加入三乙胺(0.12摩尔)

    历时20分钟，使反应混合物在5-10℃下再搅拌1小时，加入水

    (250毫升)并持续搅拌5分钟，将有机层分离、干燥、过滤并将

    溶剂蒸发，在玻璃过滤器上通过硅胶纯化残留物(溶离液：DCM)，

    收集所要的溶离份并将溶剂蒸发，使残留物在CAN中搅拌，过滤

    并干燥，得到46.5克(85％)的三氯-N-〔2-(3-氯苯基)

    -4-〔2-(4-氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-基〕苯基〕乙酰

    胺(中间物4)。e)  将中间物(4)(0.078摩尔)及醋酸铵(0.156摩尔)在六甲基磷

    酸三酰胺(HMPT)(300毫升)的混合物在100℃下搅拌3小时，

    使反应混合物冷却，倒入冰水(1500毫升)中并导致沉淀，将沉

    淀物过滤并用水清洗，将产物溶解在DCM中，将有机层分离、干

    燥、过滤并将溶剂蒸发，在玻璃过滤器上通过硅胶纯化残留物三

    次(溶离液：CH2Cl2/CH3OH 97/3，然后95/5)，收集所要的溶

    离份并将溶剂蒸发，使残留物在回流的异丙醇(200毫升)中搅拌，

    使混合物冷却并将产生的沉淀物过滤，用DIPE清洗并干燥，得到

    26克(76％)的4-(3-氯苯基)-6-〔2-(4-氯苯基)-1，3

    -二氧戊环-2-基〕-2(1H)-喹唑啉酮(中间物5，熔点

    219.5℃)。f)  将中间物(5)(0.052摩尔)在3当量浓度氢氯酸(250毫升)及

    甲醇(250毫升)的混合物搅拌并回流2小时，使反应混合物冷却，

    加入水(250毫升)并将所得的沉淀物过滤，用水、异丙醇及DIPE

    清洗后干燥，得到19.4克(94.4％)的6-(4-氯苯甲酰基)-4

    -(3-氯苯基)-2(1H)-喹唑啉酮(中间物6，熔点256.4℃)。g)  将中间物(6)(0.005摩尔)在甲醇(50毫升)的混合物搅拌并

    在冰浴(5-10℃)中冷却，逐滴加入氢硼化钠(0.007摩尔)历

    时15分钟(首先导致溶解，经15分钟后开始沉淀)，使混合物

    在室温下搅拌1小时，用1当量浓度HCl将混合物酸化，将沉淀

    物过滤，用DIPE清洗后干燥，得到1.6克(80％)的(±)-4-

    (3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)羟甲基〕-3，4-二氢-2(1H)

    -喹唑啉酮(中间物7，熔点231.4℃)。h)  将中间物(7)(0.013摩尔)在DCM(60毫升)的混合物在室温

    下搅拌，逐滴加入亚硫酰基氯(0.065摩尔)历时15分钟，使反

    应混合物在室温下搅拌3小时，导致溶解，将溶剂蒸发，加入甲

    苯并在旋转蒸发器中共沸，得到5.4克的(±)-6-〔氯(4-氯

    苯基)甲基〕-4-(3-氯苯基)-3，4-二氢-2(1H)-喹唑

    啉酮(中间物8)。实例A.2a)  将中间物(5)(0.0455摩尔)在DMF(500毫升)的混合物在室

    温及N2气流下搅拌，逐份加入氢化钠在矿物油中的分散液(50％，

    0.0455摩尔)，搅拌反应混合物直到停止释出气体，逐滴加入甲

    基碘(0.0455摩尔)并使所得的反应混合物在室温下搅拌14小时，

    将溶剂蒸发，加入甲苯并在旋转蒸发器中共沸，使粗油在DCM(300

    毫升)中搅拌，用水(2×250毫升)清洗、干燥、过滤并将溶剂

    蒸发，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：DCM)，

    收集所要的溶离份并将溶剂蒸发，得到16.7克(80％)的4-

    (3-氯苯基)-6-〔2-(4-氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-

    基〕-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物9)。b)  将中间物(9)(0.037摩尔)在甲醇(300毫升)的混合物在室

    温下搅拌，逐滴加入氢氯酸(0.75摩尔)并使所得的反应混合物

    搅拌并回流1小时，然后冷却至室温并用DCM(2×250毫升)

    萃取，将分离后的有机层干燥、过滤并将溶剂蒸发，在DIPE中

    碾制残留物，将沉淀物过滤，用DIPE(100毫升)清洗并干燥(真

    空；60℃；14小时)，得到12.6克(83％)的6-(4-氯苯甲

    酰基)-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中

    间物10)。实例A.3a)  将中间物(10)(0.031摩尔)在甲醇(150毫升)的悬浮液在室

    温下搅拌，逐份加入氢硼化钠(0.062摩尔)(最高上升温度为

    5℃)，使反应混合物在室温下搅拌2小时，将沉淀物过滤，用水

    (50毫升)、异丙醇(100毫升)及DIPE(100毫升)清洗、然

    后干燥(真空；50℃)，得到11.5克(90％)的(±)-4-(3

    -氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)羟甲基〕-3，4-二氢-1-甲

    基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物11)。b)  将DCM(0.0556摩尔)逐滴添加至中间物(11)(0.028摩尔)

    在DCM(100毫升)的混合物，使反应混合物搅拌并回流2小时，

    将溶剂蒸发，加入甲苯并在旋转蒸发器中共沸，得到12.09克的

    (±)-6-〔氯(4-氯苯基)甲基〕-4-(3-氯苯基)-3，4

    -二氢-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物12)。实例A.4a)  将中间物(9)(0.0122摩尔)在甲醇(50毫升)中的溶液冷却至

    5℃，逐份加入氢硼化钠(0.0122摩尔)并将混合物在5℃下放置

    30分钟，将混合物倒入冰水中，过滤沉淀物，用水清洗并干燥，

    得到5.4克(98％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔2-(4

    -氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-基〕-3，4-二氢-1-甲基-

    2(1H)-喹唑啉酮(中间物13)。b)  将中间物(13)(0.0107摩尔)在0℃及N2气流下溶解在DMF

    (50毫升)中，加入氢化钠(80％)在矿物油中的悬浮液(0.013

    摩尔)并将混合物在0℃下放置30分钟，逐滴加入甲基碘(0.0215

    摩尔)并将混合物在0℃下放置1小时，将混合物倒入冰水中，

    过滤沉淀物，用水清洗并溶解在DCM中，将有机层干燥，过滤

    并将溶剂蒸发，得到6.2克的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔2

    -(4-氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-基〕-3，4-二氢-1，3-

    二甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物14)。c)  将中间物(14)(0.0259摩尔)在醋酸(75毫升)、水(20毫升)

    及THF(10毫升)中的混合物搅拌并回流过夜，将溶剂蒸发，

    使残留物溶解在DCM中并用K2CO3(10％)清洗，将有机层倾析、

    干燥、过滤并将溶剂蒸发，得到11克(100％)的产物，使一部

    分样品从2-丙酮/DIPE中结晶，将沉淀物过滤并干燥，得到1.5

    克的(±)-6-(4-氯苯甲酰基)-4-(3-氯苯基)-3，4-

    二氢-1，3-二甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物15)。实例A.5a)  将中间物(5)(0.0175摩尔)在DMF(80毫升)中的混合物在

    冰浴及氮气流下冷却，逐份加入氢化钠(80％在油中，0.0228摩

    尔)并将混合物在低温下搅拌30分钟后水解，过滤沉淀物，用水

    清洗并溶解在DCM中，干燥、过滤并将溶剂蒸干，在硅胶上经

    由管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH

    99/1/0.1)，得到2.9克(33.3％)的4-(3-氯苯基)-6-〔2

    -(4-氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-基〕-1-(乙氧基甲基)

    -2(1H)-喹唑啉酮(中间物16)。b)  将中间物(16)(0.0058摩尔)在甲醇(50毫升)的溶液在冰

    水中冷却，逐份加入氢硼化钠(0.0058摩尔)，使混合物在低温

    下搅拌30分钟，然后倒入冰水中并用DCM萃取，将有机层分离、

    干燥、过滤并将溶剂蒸干，得到2.9克(100％)的(±)-4-

    (3-氯苯基)-6-〔2-(4-氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-

    基〕-1-(乙氧基甲基)-3，4-二氢-2(1H)-喹唑啉酮(中

    间物17)。c)  将中间物(17)(0.0058摩尔)在DMF(30毫升)中的混合物

    在冰浴及氮气流下冷却，加入氢化钠(80％在油中，0.007摩尔)

    并将混合物在低温下搅拌30分钟，逐滴加入甲基碘(0.007摩尔)，

    使混合物在低温下搅拌1小时，然后使其温热至室温，水解并加

    入水，过滤沉淀物，用水清洗并溶解在DCM中，干燥，过滤并

    将溶剂蒸干，得到3克(100％)的(±)-4-(3-氯苯基)-

    6-〔2-(4-氯苯基)-1，3-二氧戊环-2-基〕-1-(乙氧

    基甲基)-3，4-二氢-3-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物18)。d)  将中间物(18)(0.0058摩尔)在HCl(30毫升)及THF(30

    毫升)中的混合物搅拌并回流过夜，加入冰使其冷却，用NH3(水

    溶液)碱化并用DCM萃取，将有机层分离、干燥、过滤并将溶

    剂蒸干，将残留物溶解在2-丙酮及DIPE中，将沉淀物过滤、

    清洗并干燥，得到2.2克(91.6％)的(±)-6-(4-氯苯甲酰

    基)-4-(3-氯苯基)-3，4-二氢-3-甲基-2(1H)-喹

    唑啉酮(中间物19)。e)  将氢硼化钠(0.0053摩尔)添加至中间物(19)(0.0053摩尔)

    在甲醇(20毫升)及THF(20毫升)且先在冰浴中冷却(5℃)

    的混合物，使混合物在5℃下搅拌30分钟，倒入冰水中并用DCM

    萃取，将有机层分离、干燥、过滤并将溶剂蒸干，得到2.2克(100

    ％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)羟甲基〕

    -3，4-二氢-3-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物20)。f)  将亚硫酰氯(10毫升)逐滴添加至中间物(20)(0.005摩尔)

    在DCM(50毫升)且先在冰浴中冷却(5℃)的混合物，使混合

    物在室温下搅拌1小时，将溶剂蒸干，产物不再纯化而直接使用，

    定量地得到(±)-6-〔氯(4-氯苯基)甲基〕-4-(3-氯

    苯基)-3，4-二氢-3-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(中间物21)。B.  制备最终的产物实例B.1

    将中间物(8)(0.013摩尔)，咪唑(0.039摩尔)及碳酸钾(0.04摩尔)在ACN(75毫升)中的混合物搅拌并回流3小时，将溶剂蒸发，在水中搅拌残留物并用DCM萃取此混合物，将分离后的有机层干燥，过滤并将溶剂蒸发，在玻璃过滤器上通过硅胶纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH 95/5)，收集所要的溶离份并将溶剂蒸发，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH/(CH3OH/NH3)95/2.5/2.5)，收集所要的纯溶离份并将溶剂蒸发，使残留物在乙醚(50毫升)中搅拌，过滤并干燥，得到2.6克(44.5％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基〕-3，4-二氢-2(1H)-喹唑啉酮(化合物8)；熔点177.1℃。实例B.2

    将1-甲基咪唑(0.073摩尔)在THF(110毫升)中的混合物在N2气流下冷却至-70℃，逐滴加入正丁基锂在己烷中的溶液(1.6摩尔浓度)(45.6毫升)，使混合物在-70℃下搅拌30分钟，加入氯三乙基硅烷(0.073摩尔)。使混合物慢慢温热至室温并再冷至-70℃。滴加正丁基锂己烷溶液(1.6M)(45.6ml)。将混合物在-70℃搅拌1小时，然后使其上升至-15℃后再度冷却至-70℃，加入中间物(10)(0.061摩尔)在THF(100毫升)中的混合物，使混合物在-70℃下搅拌30分钟，然后使其上升至0℃，水解，用醋酸乙酯萃取并倒出，将有机层干燥、过滤并将溶剂蒸干，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH)93/7/0.5)，得到9.5克的产物，使此产物从2-丙酮/CAN中再结晶，将沉淀物过滤，用乙醚清洗并干燥，得到2克的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)羟基(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基〕-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮单水合物(化合物4)。实例B.3

    将化合物(8)(0.0045摩尔)及氧化锰(IV)(0.05摩尔)在DCM(50毫升)中的混合物在室温下搅拌18小时，通过硅藻土过滤混合物，用CH2Cl2/CH3OH 90/10清洗硅藻土，将过滤液蒸发，在玻璃过滤器上通过硅胶纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH 95/5，收集所要的溶离份并将溶剂蒸发，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH 95/5)并从ACN(25毫升)中再结晶，过滤沉淀物，用DIPE清洗并干燥，得到1克(50％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基〕-2(1H)-喹唑啉酮(化合物1；熔点255.1℃)。实例B.4

    在5℃下将氢硼化钠(0.003摩尔)逐份添加至化合物(4)(0.003摩尔)在甲醇(30毫升)的混合物，使混合物在5℃下搅拌30分钟后水解，用DCM萃取并倾析，将有机层干燥、过滤并将溶剂蒸发，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH)，收集纯的溶离份并将溶剂蒸发，使残留物从乙醚结晶，将沉淀物过滤并干燥，得到1克的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)羟基(1-甲基)-1H-咪唑-5-基〕甲基〕-3，4-二氢-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(化合物13)。实例B.5

    将氢化钠在矿物油中的分散液(60％)(0.0047摩尔)在N2气流下逐份添加至化合物(9)(0.0043摩尔)在DMF(40毫升)的混合物，使混合物在室温下搅拌30分钟，逐滴加入甲基碘(0.0047摩尔)在DMF(10毫升)的溶液并使所得的反应混合物在室温下搅拌过夜，将反应混合物倒入水(200毫升)中，用甲苯(3×100毫升)萃取此混合物，将分离后的有机层干燥、过滤并将溶剂蒸发，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：醋酸乙酯/CH3OH/(CH3OH/NH3)90/5/5)，收集纯的溶离份并将溶剂蒸发，在硅胶上通过管柱层析法纯化此溶离份(溶离液：CH3Cl2/CH3OH 100/0，20分钟后改成90/10，125毫升/分钟)，收集纯的溶离份并将溶剂蒸发，得到0.370克(18％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基〕-3，4-二氢-1，3-二甲基-2(1H)-喹唑啉酮(化合物10)。实例B.6

    将氢化钠在矿物油中的分散液(60％)(0.01122摩尔)在N2气流下逐份添加至化合物(1)(0.0051摩尔)在DMF(40毫升)的混合物，使混合物在室温下搅拌30分钟，逐滴加入4-(氯甲基)吡啶盐酸盐(0.00561摩尔)在DMF(5毫升)的溶液并使所得的反应混合物在室温下搅拌整个周末，将反应混合物倒入水中并用甲苯萃取此混合物，将分离后的有机层干燥、过滤并将溶剂蒸发，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH/(CH3OH/NH3)90/5/5)，收集纯的溶离份并将溶剂蒸发，在Kromasil RP-18上通过高效能液相层析法纯化此溶离份(100埃，10微米，5cm DAC；溶离液：(0.5％NH4OAc在H2O中)/CH3OH/CH3CN 47/25/28体积/体积)，收集纯的溶离份并将溶剂蒸发，用DCM萃取水性残留物，将分离后的有机层干燥、过滤并将溶剂蒸发，得到0.900克(32.8％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基〕-1-(4-吡啶基甲基)-2(1H)-喹唑啉酮(化合物3，熔点61.4℃)。实例B.7

    将化合物(4)(0.0069摩尔)在甲酰胺(34毫升)及醋酸(68毫升)的混合物在160℃下搅拌24小时，然后倒入冰水中并用散浓NH3水溶液碱化，将沉淀物过滤，用水清洗并溶解在DCM中，将有机层分离、干燥、过滤并将溶剂蒸干，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.2)，收集纯的溶离份并将溶剂蒸发，使残留物从2-丙酮/DIPE结晶，将沉淀物过滤并干燥，得到0.85克的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基〕-3，4-二氢-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(化合物14)。实例B.8

    将化合物(4)(0.01摩尔)在低温下添加至亚硫酰氯(50毫升)，使混合物在40℃下搅拌2小时，将溶剂蒸干，产物不再纯化而直接使用，得到5.46克的(±)-6-〔(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基〕-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮单盐酸盐(化合物6)。实例B.9

    将氢氧化铵(50毫升)冷却至5℃，加入化合物(6)(0.01摩尔)在THF(50毫升)的溶液，使混合物在室温下搅拌2小时，然后在60℃下搅拌30分钟后冷却，加入醋酸乙酯，倾析混合物，将有机层干燥、过滤并将溶剂蒸干，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：甲苯/异丙醇/NH4OH 75/25/2)，收集纯的溶离份并将溶剂蒸发，使残留物从DCM及乙醚结晶，将沉淀物过滤并干燥，得到1.1克的(±)-6-〔氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基〕-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹唑啉酮(化合物7)。实例B.10

    a)将中间物(21)(0.0146摩尔)、2-苯基咪唑(0.0219摩尔)及碳酸钾(0.0438摩尔)在ACN(80毫升)中的混合物搅拌并回流4小时，将溶剂蒸干，使残留物溶解在DCM及水中，将有机层分离干燥、过滤并将溶剂蒸干，产物不再纯化而直接使用，得到(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)(2-苯基-1H-咪唑-1-基)甲基〕-2-甲氧基喹唑啉(中间体22)和(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)(2-苯基-1H-咪唑-4-基)甲基〕-2-甲氧基喹唑啉(中间物23)的混合物。

    b)将中间物(22)及(23)(0.0146摩尔)在HCl(3当量浓度，10毫升)及THF(100毫升)的混合物搅拌并回流3小时，然后倒入冰水中并用醋酸乙酯萃取，将有机层分离、干燥、过滤并将溶剂蒸干，在硅胶上通过管柱层析法纯化残留物(溶离液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH95/5/0.5)，收集两个纯的溶离份并将其溶剂蒸发，第一个溶离份从ACN、2-丙酮及DIPE结晶，得到1.2克(15.8％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)(2-苯基-1H-咪唑-1-基)甲基〕-2(1H)-喹唑啉酮(化合物19，熔点170℃)，第二个溶离份溶解在2-丙酮及DIPE并转化成乙二酸盐(1∶1)，得到0.8克(8.7％)的(±)-4-(3-氯苯基)-6-〔(4-氯苯基)(2-苯基-1H-咪唑-4-基)甲基〕-2(1H)-喹唑啉酮乙二酸盐(1∶1)单水合物(化合物20，熔点197℃)。

    表F-1至F-4列出的化合物根据上述其中一个实例的方法制备表F-1：表F-2：化合物号实例  号  R1  R3  R5  R8    物理数据  4  5  6  7 B.2 B.3 B.8 B.9  3-Cl  3-Cl  3-Cl  3-Cl  4-Cl  4-Cl  4-Cl  4-Cl  OH  H  Cl  NH2  CH3  CH3  CH3  CH3          .H2O(1∶1)  乙二酸盐(1∶1).H2O(1∶2)          .HCl(1∶1)          -表F-3：化合物号实例  号  R1  R3  R5  R7  R8    R16 P物理数据ata 8 9 10 11 18 B.1 B.1 B.5 B.5 B.1  3-Cl  3-Cl  3-Cl  3-Cl  3-Cl  4-Cl  4-Cl  4-Cl  4-Cl  4-Cl  H  H  H  H  H  H  H  CH3  CH2CH3  CH3   H  CH3  CH3  CH3   H    H    H    H    H 2-苯基 mp.177.1℃ mp.111.5℃ - mp.115.8℃ mp.236℃表F-4：化合物号实例号    R1    R3    R5    R7    R8    物理数据  12  13  14  15  16  17 B.2 B.4 B.7 B.7 B.8 B.9    3-Cl    3-Cl    3-Cl    3-Cl    3-Cl    3-Cl    4-Cl    4-Cl    4-Cl    4-Cl    4-Cl    4-Cl    OH    OH    H    H    Cl    NH2    CH3    H    H    CH3    CH3    CH3    CH3    CH3    CH3    CH3    CH3    CH3  -  -  -  -  .HCl(1∶1)  (A)C.药理实例实例C.1：Ras-变性细胞显型逆转测试

    将活性的致癌基因例如ras基因植入小鼠NIH 3T3细胞，将细胞转化成变性显型，细胞变成肿瘤性，在半固体介质中显现与细胞附著无关的成长并丧失接触抑制性，丧失接触抑制性产生细胞培养物，其不再形成均匀的单层，反而细胞堆积多细胞的结，并在塑胶组织培养盘中生长成非常高饱和密度，例如蛋白质法呢基转化酶抑制剂的药剂可逆转培养物中的细胞，将ras变性的显型回复成均匀的单层成长模式，此逆转可通过计数组织培养盘中的细胞数目而轻易地监测，变性细胞与逆转成未变性的显型细胞比较，可达到更高的细胞数，逆转变性显型的化合物将可在含有ras基因突变的肿瘤中产生抗肿瘤效应。方法：

    在组织培养物中，在被T24活化的人类H-ras基因变性的NIH 3T3监测化合物，将细胞以每槽(9.6平方厘米表面积)含200,000细胞的初始密度植入6-槽组织培养盘，将测试化合物立即添加至含3.0微升体积DMSO的3.0毫升细胞成长介质，使细胞成长介质中的DMSO最终浓度为0.1％，在浓度为5、10、50、100及500毫微摩尔浓度下使用测试化合物以及经DMSO处理的媒剂对照组，(如果在5毫微摩尔浓度下观察到高活性，可在更低的浓度下进行测试化合物的测试)，使细胞增殖72小时，然后将细胞分离至1.0毫升胰蛋白酶-EDTA细胞解离介质并在Coulter粒子计数器中计数。测量：

    使用Coulter粒子计数器测量以每槽的细胞数表示的细胞数，全部的细胞计数都减除200,000以校正最初的细胞输入密度，测试化合物细胞计数＝〔用测试化合物培养的细胞的细胞计数-200,000〕化合物5、7、14及15的IC50低于500毫微摩尔浓度。